孔令恒，顧曉明，南　瑛，張建英，孫　娜，朱娟霞，周京軍

(1.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部生理學(xué)教研室，陜西 西安　710021；2.第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生理學(xué)教研室,陜西 西安　710032)

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鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ抑制劑KN-93加重大鼠離體心臟鈣超載損傷

孔令恒1, 2，顧曉明2，南瑛1，張建英2，孫娜1，朱娟霞1，周京軍2

(1.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)部生理學(xué)教研室，陜西 西安710021；2.第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生理學(xué)教研室,陜西 西安710032)

摘要：目的觀察鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)抑制劑KN-93對(duì)大鼠離體心臟鈣超載損傷的影響。方法采用Langendorff裝置進(jìn)行離體心臟灌流，利用鈣反?，F(xiàn)象誘發(fā)胞內(nèi)鈣超載。32只SD ♂大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、藥物KN-93對(duì)照組、鈣反常組和KN-93處理組。實(shí)驗(yàn)全程記錄左心室內(nèi)壓的變化，以左心室舒張末壓(LVEDP)和發(fā)展壓(LVDP)評(píng)價(jià)心功能，于不同時(shí)間點(diǎn)收集冠脈流出液，并測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑染色檢測(cè)心肌梗死面積的變化。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，KN-93(2.5 μmol·L-1)對(duì)正常心臟的左室功能、冠脈流量和心肌梗死面積沒(méi)有明顯影響(P>0.05)；與正常對(duì)照組相比，鈣反常組在復(fù)鈣灌注結(jié)束時(shí)LVEDP抬升、LVDP降低，梗死面積達(dá)(18±7.2)%，冠脈流量減少，LDH含量增加(P<0.01)；KN-93(2.5 μmol·L-1)處理組與鈣反常組相比，心肌梗死面積為(90±4.8)%，LVEDP進(jìn)一步升高，LVDP消失，冠脈流量明顯減少，LDH含量明顯增多(P<0.01)。結(jié)論CaMKⅡ抑制劑KN-93加重急性鈣超載引起的心肌損傷，這一作用可能與影響CaMKⅡ活性有關(guān)。

關(guān)鍵詞：鈣超載；鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ；KN-93；鈣離子；心臟；心肌損傷

心肌缺血/再灌注損傷是急性心肌梗死溶栓治療、冠狀動(dòng)脈成形術(shù)、心臟停跳手術(shù)過(guò)程中不可避免的伴隨事件，可導(dǎo)致心肌頓抑、心肌梗死、心律失常，甚至因心衰致死。眾所周知，鈣超載是導(dǎo)致心臟缺血/再灌注過(guò)程產(chǎn)生不可逆損傷的一個(gè)重要原因，可引起心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙，但其具體機(jī)制仍不清楚[1]。

鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/CaM dependent kinase Ⅱ, CaMKⅡ)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要表達(dá)于心臟，是心血管生理及病理變化過(guò)程中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要組成部分，通過(guò)調(diào)節(jié)肌質(zhì)網(wǎng)上的鈣釋放通道和鈣泵，維持心肌細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，并在心肌肥厚、心力衰竭、心律失常和擴(kuò)張性心肌病的發(fā)生及發(fā)展中起重要作用[2-3]。本實(shí)驗(yàn)利用大鼠離體心臟鈣反?，F(xiàn)象(Ca2+paradox)，即短時(shí)間無(wú)鈣液灌注，之后恢復(fù)有鈣液灌注，可造成急性鈣超載心肌損傷[4-6]，觀察了CaMKⅡ抑制劑KN-93對(duì)心肌損傷的影響，旨在初步明確CaMKⅡ在鈣超載心肌損傷中的作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

健康成年♂ SD大鼠32只，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)買于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。CaMKⅡ抑制劑KN-93購(gòu)于Calbiochem公司。2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(TTC)購(gòu)于Sigma公司。乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Abnova公司。正常Krebs-Henseleit液(KH solution)成分及含量(mmol·L-1)：NaCl 120，KCl 4.7，MgSO41.2，KH2PO41.2，CaCl21.25，NaHCO325，Glucose 11；無(wú)鈣KH液:去除正常KH液中的CaCl2，其它成分保持不變，同時(shí)添加0.2 mmol·L-1Na2EDTA。灌流前40 min用95% O2和5% CO2混合氣體(V/V)向KH液中持續(xù)通氣至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，實(shí)驗(yàn)中KH液溫度保持在37 ℃，pH維持在7.35～7.45。

1.2方法

1.2.1大鼠離體心臟灌流按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行大鼠離體心臟灌流，基本過(guò)程為：大鼠腹腔內(nèi)分別注射肝素500 U·kg-1及戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)，待麻醉后立即開(kāi)胸摘取心臟置于4 ℃的正常KH液中，將主動(dòng)脈根部固定于Langendorff灌流系統(tǒng)(Radnoti Glass Technology, USA)的管口，37 ℃正常KH液由主動(dòng)脈口逆行灌注，灌注壓維持在10.64 kPa(80 mmHg)。待心臟復(fù)跳后，于左心耳處剪一小口，將前端帶有乳膠球囊的測(cè)壓管經(jīng)二尖瓣插入左心室，測(cè)壓管的另一端經(jīng)壓力換能器(Model 100BP, Biopac System, USA)與計(jì)算機(jī)相連。調(diào)節(jié)球囊內(nèi)的液體量使左心室舒張末壓界于0.67～1.33 kPa(5～10 mmHg)之間，平衡灌流15 min，待心臟跳動(dòng)穩(wěn)定后標(biāo)記為灌注開(kāi)始，按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行灌流。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組如Fig 1所示，32只大鼠隨機(jī)分成4組(n=8)：① 正常對(duì)照組(Control)：KH液灌注40 min； ② 藥物對(duì)照組(KN-93+control)：用KH液灌注7 min，含KN-93的KH液灌注8 min，再用KH液灌注25 min；③ 鈣反常組(Ca2+paradox, CaP)：KH液灌注8 min，無(wú)鈣KH液灌注2 min，KH液灌注30 min；④ KN-93處理組(KN-93+CaP)：KH液灌注7 min，含KN-93的KH液灌注1 min，無(wú)鈣含KN-93的KH液灌注2 min，含KN-93的KH液灌注5 min，正常KH液灌注 25min。

Fig 1　 Experimental protocol

The time upon re-perfusion with KH solution containing 1.25 mmol·L-1Ca2+was set as 0.

1.2.3心臟功能的測(cè)定采用AcqKnowledge 3.8.1系統(tǒng)全程記錄左心室內(nèi)壓(left ventricular pressure，LVP)、左室收縮峰壓(left ventricular peak systolic pressure，LVPSP)及LVEDP的變化。左室發(fā)展壓(LVDP)采用LVPSP-LVEDP計(jì)算獲得，以LVDP和LVEDP反映左室功能變化。

1.2.4LDH檢測(cè)收集各組復(fù)鈣開(kāi)始后5 min內(nèi)的冠脈流出液，按照Abnova公司提供的ELISA試劑盒說(shuō)明，依次加入反應(yīng)液，450 nm處檢測(cè)吸光值。結(jié)果以實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值的比值來(lái)表示各組LDH的相對(duì)活性。

1.2.5心肌梗死面積的測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，快速取下心臟，置于-80 ℃凍存1 h；去除心房組織，沿心臟長(zhǎng)軸自心尖向心底方向，連續(xù)切6片厚度為1 mm左右的環(huán)形切片，置于10 g·L-1TTC溶液中，37 ℃下避光孵育10 min；4%多聚甲醛固定過(guò)夜；數(shù)碼相機(jī)拍照，用OPTIMASv5.2軟件雙盲法分析心肌梗死面積。正常心肌組織呈現(xiàn)磚紅色，壞死組織為白色。

心肌梗死面積百分比/%=(壞死區(qū)面積/總面積)×100%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1各組大鼠心肌梗死面積比較

TTC染色結(jié)果顯示，對(duì)照組于心臟實(shí)驗(yàn)結(jié)束后未檢測(cè)到心肌死亡(Fig 2A)；藥物對(duì)照組心臟接受KN-93(2.5 μmol·L-1)處理8 min，與正常對(duì)照組大鼠相比，心梗面積沒(méi)有明顯變化(P>0.05，F(xiàn)ig 2B，F(xiàn)ig 3)；鈣反常組心臟在用2 min無(wú)鈣液、30 min正常KH液接替灌注后，心肌梗死面積明顯增大，達(dá)(18±7.2)%(P<0.01,Fig 2C，F(xiàn)ig 3)；KN-93處理心臟后可進(jìn)一步增加梗死面積，變?yōu)?90±4.8)%(P<0.01,Fig 2D，F(xiàn)ig 3)。

Fig 2　TTC staining of myocardial tissue slices in different groups

A: Control; B: KN-93+control; C: CaP group; D: KN-93+CaP group.

2.2KN-93處理對(duì)冠脈血流量的影響

如Tab 1所示，與正常對(duì)照組相比，KN-93(2.5 μmol·L-1)藥物對(duì)照組大鼠心臟的冠脈流量沒(méi)有明顯變化(P<0.05)；鈣反常組在無(wú)鈣KH液灌注末(0 min)、復(fù)鈣液灌注的3 min、15 min、30 min時(shí)的冠脈流量減少(P<0.01)；與鈣反常組相比，KN-93處理組在無(wú)鈣KH液灌注末(0 min)、復(fù)Ca2+灌注后3 min、15 min、30 min 的冠脈流量顯著減少(P<0.01)。

2.3各組大鼠心臟冠脈流出液中LDH含量的比較

藥物對(duì)照組大鼠心臟冠脈流出液中LDH含量與對(duì)照組相比較無(wú)明顯差異(Fig 4)；與對(duì)照組相比，鈣反常組大鼠冠脈流出液中LDH含量升高(P<0.01，F(xiàn)ig 4)；與鈣反常組相比，KN-93處理組冠脈流出液中LDH含量明顯增加(P<0.01，F(xiàn)ig 4)。

Tab 1　Comparison of coronary flow of isolated rat hearts

**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsCaP.

Fig 3　The percentage of myocardial infarction

**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsCaP.

2.4KN-93處理惡化心功能

平衡灌注期，各組 LVEDP、LVDP均無(wú)顯著差異，對(duì)照組大鼠心臟正常KH液灌注40 min，心功能基本保持不變；用含KN-93(2.5 μmol·L-1)的KH液灌注8 min，與對(duì)照組相比，于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),心功能沒(méi)有明顯變化(P>0.05，F(xiàn)ig 5)；鈣反常組大鼠心臟接受2 min無(wú)鈣液、30 min正常KH液接替灌注后，與正常對(duì)照組相比，LVEDP抬升，LVDP減小(P<0.01，F(xiàn)ig 5)；KN-93干預(yù)鈣反常大鼠心臟后，LVEDP升高更加明顯，且LVDP消失(P<0.01，F(xiàn)ig 5)。

Fig 4　The content of LDH in coronary effluent

**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsCaP.

3討論

心肌細(xì)胞缺血一段時(shí)間后會(huì)導(dǎo)致一定程度的損傷，然而，恢復(fù)血液供應(yīng)后，缺血心肌的損傷不但沒(méi)有改善，反而進(jìn)一步加重，最終導(dǎo)致不可逆損傷，形成心肌缺血/再灌注損傷。目前，關(guān)于缺血/再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制并不是十分清楚，而在心肌細(xì)胞缺血期的可逆性損傷轉(zhuǎn)化為不可逆損傷的過(guò)程中，鈣超載及其觸發(fā)的復(fù)雜細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程起著重要作用[1]。本研究采用大鼠離體心臟急性鈣超載模型，首次觀察到CaMKⅡ抑制劑KN-93加重鈣超載引起的心肌損傷，提示CaMKⅡ可能參與大鼠鈣超載性心肌損傷，進(jìn)一步完善了以往的研究。

Fig 5　KN-93 aggravates the heart function in calcium paradox

The upper panel, the representative of left ventricular pressure (LVP) recording. The lower panel, group results on the recovery of LVDP and the LVEDP at the end of perfusion. 1 mmHg=0.133 kPa,**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsCaP.

CaMKⅡ參與胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，調(diào)控胞內(nèi)某些基因的表達(dá)以及細(xì)胞凋亡，是胞內(nèi)生理活動(dòng)和病理信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白之一。目前，關(guān)于CaMKⅡ的激活方式有Ca2+/CaM依賴激活、自身激活和氧化激活，研究比較清楚的是Ca2+/CaM依賴性的激活。Ca2+和CaM首先形成有活性的Ca2+/CaM復(fù)合體，進(jìn)而結(jié)合CaMKⅡ調(diào)節(jié)域中的CaM識(shí)別區(qū)并激活CaMKⅡ，使CaMKⅡ單體構(gòu)象發(fā)生改變[7]。有學(xué)者指出，CaMKⅡ是一種損傷分子，在離體灌注心臟的實(shí)驗(yàn)中45 min缺血后再灌注可激活CaMKⅡ，進(jìn)而增加細(xì)胞凋亡/壞死，造成收縮功能障礙，且這種作用能被CaMKⅡ的抑制劑所拮抗[8-9]；在心臟特異性敲除CaMKⅡ的小鼠，也觀察到缺血/再灌注心肌梗死面積縮小，細(xì)胞凋亡減少，改善心功能[10]。然而有文獻(xiàn)報(bào)道，CaMKⅡ是一種細(xì)胞保護(hù)分子，同樣在離體灌注心臟的實(shí)驗(yàn)中，20 min缺血后再灌注可激活CaMKⅡ，減輕心肌頓抑，其作用可能與磷酸化肌漿網(wǎng)鈣泵調(diào)節(jié)分子受磷蛋白(phospholamban)有關(guān)[11]。KN-93是研究CaMKⅡ功能的重要工具藥[12-13]，本實(shí)驗(yàn)觀察到： KN-93干預(yù)鈣反常處理后，心臟梗死面積顯著增大，冠脈流出液中LDH量明顯增加，提示CaMKⅡ可能具有心肌保護(hù)作用，這與Said等[11]在心肌頓抑研究中的報(bào)道一致。然而，有文獻(xiàn)報(bào)道，KN-93抑制鉀通道，這一作用可不依賴CaMKⅡ[14]。因而，在離體心臟鈣超載損傷中，KN-93對(duì)CaMKⅡ活性及其底物的影響有待進(jìn)一步明確。綜上所述，我們觀察到CaMKⅡ抑制劑KN-93能加重急性鈣超載引起的心肌損傷，提示CaMKⅡ可能在這一過(guò)程中發(fā)揮重要作用。后續(xù)工作還需測(cè)定CaMKⅡ的活性，并探討其分子機(jī)制，這將有助于闡明缺血/再灌注損傷機(jī)制，為心肌保護(hù)提供新思路。

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Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ inhibitor KN-93 aggravates the calcium paradox-induced heart injury

KONG Ling-heng1,GU Xiao-ming2, NAN Ying1, ZHANG Jiang-ying2, SUN Na1, Zhu Juan-xia1, ZHOU Jing-jun2

(1.DeptofPhysiology,InstituteofBasicMedicine,Xi’anMedicalUniversity,Xi’an710021,China2.DeptofPhysiology,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China)

Abstract:AimTo investigate the effects of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ inhibitor KN-93 on calcium overload-induced heart injury. MethodsThirty-two isolated rat hearts were randomly divided into the control group, KN-93 control group, calcium paradox group, and calcium paradox with KN-93 treatment group. Left ventricular pressure were recorded, and the heart function was evaluated by the left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP) and developed pressure (LVDP). Coronary flow (CF) were collected, and lactate dehydrogenase (LDH) content was determined. Triphenyltetrazolium chloride staining was used to measure the infarct size. ResultsCompared with the control group, KN-93 at 2.5 μmol·L-1had no effects on coronary flow, cardiac performance and cell death at the end of perfusion in normal rats (P>0.05); The hearts of calcium paradox exhibited a decrease in LVDP and CF, meanwhile an increase in LVEDP, LDH, and infarct size of 18±7.2% (P<0.01). 2.5 μmol·L-1KN-93 further increased the levels of LVEDP, LDH and infarct size (P<0.01) in Ca2+paradoxical hearts, while it provoked the decline in the CF and LVDP (P<0.01). ConclusionThe data demonstrates that KN-93 aggravates heart injury in calcium paradox, it also suggests that CaMKⅡ is involved in the Ca2+overload-induced heart injury.

Key wordscalcium overload; CaMKⅡ; KN-93; calcium; heart; myocardial injury

收稿日期：2016-01-22，修回日期：2016-03-29

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 31371181)；陜西省科技廳項(xiàng)目(No 2014JM2-8164);西安醫(yī)學(xué)院學(xué)科建設(shè)經(jīng)費(fèi)資助

作者簡(jiǎn)介：孔令恒(1984-)，男，博士生，講師， Tel:029-86177559,E-mail:lhkong1984@163.com;

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.018

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)06-0832-05

中國(guó)圖書分類號(hào)：R-332；R322.11；R348.1；R542.202.2；R977.3；R977.6

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-25 15:39網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.036.html

周京軍(1971-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：心肌保護(hù)，通訊作者，E-mail: jjzhou@ fmmu.edu.cn