崔翠菊， 李 言， 劉延嶺， 李曉捷， 羅世菊， 武瑞娜， 王利芹， 張壯志，孫 娟， 田 鑫（. 山東東方海洋科技股份有限公司， 國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心， 山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 煙臺 64003； . 江西財(cái)經(jīng)大學(xué)， 江西 南昌33003）

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運(yùn)用分子標(biāo)記輔助構(gòu)建海帶核心種質(zhì)資源

崔翠菊1， 李 言1， 劉延嶺1， 李曉捷1， 羅世菊1， 武瑞娜1， 王利芹1， 張壯志1，孫 娟1， 田 鑫2
（1. 山東東方海洋科技股份有限公司， 國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心， 山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 煙臺 264003； 2. 江西財(cái)經(jīng)大學(xué)， 江西 南昌330013）

海帶（Saccharina japonica）是一種具有重要經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值的大型海藻， 配子體是其種質(zhì)資源保存的形式， 也是海帶雜交育種、育苗的材料。為有效管理和評價(jià)海帶種質(zhì)資源， 初步構(gòu)建了海帶核心種質(zhì)資源， 利用RAPD標(biāo)記技術(shù)對海帶“早厚成一號”的28份配子體進(jìn)行了遺傳學(xué)評價(jià)。采用UPGMA聚類法， 根據(jù)遺傳相似性系數(shù)進(jìn)行分組， 采用簡單比例法進(jìn)行取樣（25%、35%、50%、65%）分析， 計(jì)算不同取樣比例時(shí)的遺傳多樣性參數(shù)， 結(jié)合樣本的生長狀態(tài)和雌、雄比例， 綜合評價(jià)遺傳多樣性的各種參數(shù)， 取樣比例為50%時(shí)構(gòu)建的核心種質(zhì)庫相對合理。本研究為海帶品種（系）的核心種質(zhì)的篩選和遺傳學(xué)評價(jià)打下基礎(chǔ)。

海帶（Saccharina japonica）； RAPD分子標(biāo)記； 核心種質(zhì)； 遺傳多樣性

［Fund programs： National Supporting Program of Science and Technology of China （2012BAD55G01）； National High Technology Research and Development Program （863 Program） of China （2012AA10A406）， and Municipal Science and Technology Research and Development Project of Yantai （2013LGS002）］

海帶（Saccharina japonica）是一種大型褐藻， 屬于褐藻門（Phaeophyta）， 褐藻綱（Phaeophyceae）， 海帶目（Laminariales）， 海帶科（Laminariaceae）， 海帶屬（Saccharina）， 在醫(yī)藥、化工、食品等領(lǐng)域用途廣泛。目前， 我國已形成山東、福建為主產(chǎn)區(qū)的養(yǎng)殖基地，年產(chǎn)約90萬噸， 其配子體是種質(zhì)保存和人工育種、育苗的對象［1］。我國是開展海帶遺傳選育最早的國家。自20世紀(jì)50年代末以來， 先后有20余個(gè)優(yōu)良品種（系）應(yīng)用于生產(chǎn)， 大大促進(jìn)了海帶栽培業(yè)和相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。開展海帶自交純化、定向選擇， 先后培育出海帶“遠(yuǎn)雜10號”、“901”海帶［2-3］、“榮福”海帶［4］、“東方2號”［5］、“東方3號”［6］和“東方6號”［7］等， 這些海帶品種均是利用配子體直接雜交或雜交后定向選育得到的海帶品種。

分離雌、雄配子體用于其種質(zhì)保存， 不僅可保持海帶目標(biāo)性狀的均質(zhì)性、特異性和重復(fù)性， 也為海帶種質(zhì)遺傳評價(jià)提供材料基礎(chǔ)。目前， 我國海帶種質(zhì)收集、保存和評價(jià)體系已建立， 也開發(fā)了各種分子標(biāo)記技術(shù)體系， 用于海帶種質(zhì)的遺傳評價(jià)［8-12］。但尚未建立將分子標(biāo)記應(yīng)用于篩選海帶核心種質(zhì)的技術(shù)方法。Frankel等［13-14］提出如何處理海量的種質(zhì)資源與有效地評價(jià)利用優(yōu)異資源這一矛盾提出了核心種質(zhì)（core collection）的概念， 即以最小的資源份數(shù)最大限度地代表該物種的遺傳多樣性。有利于作物種質(zhì)的保存、評價(jià)與利用。因此， 迫切需要開展該方面的研究與應(yīng)用， 這可提高海帶種質(zhì)資源的保存效率， 便于種質(zhì)庫的管理、種質(zhì)創(chuàng)新等深層次研究。

目前， 核心種質(zhì)的篩選工作主要應(yīng)用在農(nóng)作物和果樹等陸地植物， 如小麥、水稻、大豆、玉米、高梁、桃樹、大白菜和山藥等物種中開展了相應(yīng)的核心種質(zhì)和初級核心種質(zhì)的篩選［15-21］。但海帶與陸地作物不同， 因?yàn)檗r(nóng)作物是純系， 其核心種質(zhì)是相對物種而言， 由不同的農(nóng)家種組成。而海帶本身是經(jīng)過多代雜交或自交選育而來， 遺傳相對復(fù)雜， 不是純系， 是一些性狀表現(xiàn)相對一致的群體， 海帶保存的種質(zhì)材料為配子體， 由于海帶配子體是采用低溫液相保存， 存在雜菌污染或生長狀態(tài)不好種質(zhì)， 這就需要在保存過程去掉， 因此， 在每個(gè)品種（系）配子體采集時(shí)， 都多選擇幾個(gè)不同個(gè)體的種海帶在當(dāng)年進(jìn)行配子體的分離、培養(yǎng)和保存， 導(dǎo)致保存的種質(zhì)可能有重復(fù)， 長期保存會費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)錢。所以海帶核心種質(zhì)需要在品種的層面上進(jìn)行篩選。

在進(jìn)行陸地作物核心種質(zhì)篩選時(shí)多選用SSR和RAPD標(biāo)記， 但SSR在品種內(nèi)多態(tài)率太低， 不適用，新型的分子標(biāo)記SNP雖然有數(shù)量上的優(yōu)勢， 但目前若要大批量檢測應(yīng)用還存在技術(shù)和經(jīng)費(fèi)的限制。除此之外， 在電泳檢測的高通量標(biāo)記體系中， 只有AFLP和RAPD標(biāo)記， 但AFLP標(biāo)記的酶切和檢測體系都比較繁瑣， 且對基因組樣品的要求很高， 綜合考慮， 只有RAPD標(biāo)記體系比較易操作且多態(tài)性高。

本研究以海帶“早厚成一號”為材料， 將其保存的28份配子體進(jìn)行核心種質(zhì)篩選， 嘗試構(gòu)建核心種質(zhì)庫， 利用RAPD標(biāo)記技術(shù)， 進(jìn)行遺傳學(xué)評價(jià)， 探討海帶核心種質(zhì)構(gòu)建的可行性， 為其他海帶種質(zhì)保存和篩選提供參考， 為高效、合理構(gòu)建海帶核心種質(zhì)資源提供技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 材料

選取海帶“早厚成一號”的28個(gè)種質(zhì)（配子體）為材料。保存條件： 溫度10℃左右， 光照強(qiáng)度10 μmol/（m2·s）以下， 培養(yǎng)液為煮沸消毒海水， 營養(yǎng)鹽： NaNO3-N 10mg/L， KH2PO4-P 1 mg/L。培養(yǎng)液2周更換1次。

1.2 DNA提取

取0.1 g濕重的配子體材料， 用消毒海水反復(fù)多次沖洗， 篩絹過濾， 盡可能的吸干水分， 采用植物基因組DNA提取試劑盒（天根公司， 中國）提取基因組DNA， 用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA的濃度和純度。DNA濃度統(tǒng)一稀釋為40 ng/μL以方便后續(xù)使用。–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RAPD引物的選擇和PCR反應(yīng)參數(shù)

從候選的100條引物中篩選出16條能夠獲得清晰條帶、重復(fù)性好的引物， 篩選出的引物見表1。RAPDPCR反應(yīng)總體積為該體系（20 μL）為： 1×PCR buffer，1.0 mmol/L Mg2+， 0.2 mmol/L dNTPs， 2.0 μmol/L 引物，40 ng 模板DNA， 0.25 U Taq DNA 聚合酶（promega）。

擴(kuò)增PCR程序?yàn)椋?95℃預(yù)變性5 min； 95℃變性30 s， 37℃退火1min， 72℃延伸2 min， 共40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。Tanon 2500凝膠成像儀拍照記錄電泳結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

電泳圖譜的每一條帶為一個(gè)標(biāo)記， 代表一個(gè)引物的結(jié)合位點(diǎn)。依據(jù)DNA電泳分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（Markers）計(jì)算出各PCR產(chǎn)物片段的大?。ń浦担燥@性標(biāo)記計(jì)數(shù)， 若有條帶出現(xiàn)記做1， 若無條帶出現(xiàn)記做0。相同引物不同膠板間以DNA電泳分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、特征帶和公共帶對應(yīng)， 找到相應(yīng)大小的對應(yīng)條帶。應(yīng)用excel建立各引物的0、1數(shù)據(jù)庫。各引物的條帶多態(tài)性比例計(jì)算方法： 多態(tài)位點(diǎn)比例P=（多態(tài)位點(diǎn)數(shù)/位點(diǎn)總數(shù)）×100%； 多態(tài)信息含量（PIC，polymorphic information content）， PICi=1–P其中：Pij表示引物i的第j個(gè)帶型出現(xiàn)的頻率［14］。利用popgene32軟件對28份材料遺傳參數(shù)進(jìn)行多樣性分析， 用NTSYS2.10軟件的Qualitative data程序計(jì)算各樣品間的遺傳距離和遺傳相似性系數(shù)， 用其中SAHN程序和UPGMA方法進(jìn)行聚類分析， 用Dcenter和Eigen程序進(jìn)行主坐標(biāo)分析。

1.5 取樣策略

根據(jù)不同的相似性系數(shù)， 采用逐步UPGMA聚類取樣法構(gòu)建早厚成品系的初級核心種質(zhì)庫， 聚類取樣時(shí)2個(gè)相近個(gè)體的取舍遵從以下原則： 既優(yōu)先保留生長狀態(tài)良好， 藻體干凈的個(gè)體。因海帶配子體有雌雄之分， 所以在進(jìn)行樣品的取舍時(shí)還應(yīng)綜合考慮雌雄比例。比較每次聚類所得的核心種質(zhì)與原庫在平均Nei’s多樣性指數(shù)、平均Shannon信息指數(shù)、平均等位基因數(shù)、平均有效等位基因數(shù)等指標(biāo)評價(jià)各核心種質(zhì)庫的質(zhì)量。

2 結(jié)果

2.1 RAPD擴(kuò)增結(jié)果多態(tài)性分析

16個(gè)RAPD引物對28個(gè)海帶配子體進(jìn)行種質(zhì)資源分析， 各引物的擴(kuò)增條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)和百分率統(tǒng)計(jì)見表1。

不同引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)見表1， 用所選的16條RAPD引物對28個(gè)配子體進(jìn)行擴(kuò)增， 共得到319條可靠、清晰和重復(fù)性高的條帶。319條帶中有301條是多態(tài)性條帶， 平均多態(tài)性比率為91.65%， 每個(gè)引物平均多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為18.81， 除了引物S2110， 其他引物在28個(gè)早厚成品系配子體中得到的多態(tài)性均較高， 平均多態(tài)條帶率78.57%～100%。PIC（polymorphic information content， 多態(tài)性信息含量）數(shù)值除了引物S2110為0.685， 其余引物的PIC值均在0.883～0.944之間， 表明所用引物多態(tài)性均較高。

表1 RAPD引物擴(kuò)增多態(tài)性信息表Tab. 1 Polymorphic information of RAPD primers

2.2 遺傳多樣性分析

根據(jù)16條RAPD引物擴(kuò)增所得結(jié)果進(jìn)行遺傳多樣性分析表明， 平均Shannon’s信息指數(shù)（I）為0.4405，平均Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）為0.2868， 平均有效等位基因數(shù)（Ne）為1.4271， 平均等位基因數(shù)（Na）為1.9718， 均表明28份海帶種質(zhì)多樣性很豐富。遺傳相似性系數(shù)變化范圍在0.608 2～0.824 5之間， 表明28份材料在DNA分子水平上變異幅度較大。根據(jù)RAPD標(biāo)記數(shù)據(jù)計(jì)算個(gè)體間的遺傳相似系數(shù)矩陣，采用UPGMA法構(gòu)建遺傳關(guān)系聚類圖（圖1）。28個(gè)個(gè)體被聚為2個(gè)類群， 其中第1個(gè)類群只有19號個(gè)體，表明它與其他的個(gè)體間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。第2個(gè)類群包括6個(gè)亞類， 有27個(gè)個(gè)體。主坐標(biāo)分析是基于遺傳相似系數(shù)進(jìn)行的。因此， 主坐標(biāo)分析圖中各個(gè)品種種質(zhì)間的位置關(guān)系反應(yīng)了其在遺傳上的相似性。通過RAPD標(biāo)記對28個(gè)個(gè)體進(jìn)行主坐標(biāo)分析， 主坐標(biāo)散點(diǎn)圖見圖2。比較圖1、2可知， 對28份材料所進(jìn)行的聚類分析和主坐標(biāo)分析的結(jié)果基本上是一致的。

2.3 核心種質(zhì)庫構(gòu)建

根據(jù)聚類結(jié)果和主坐標(biāo)分析可知， 該28個(gè)種質(zhì)材料的遺傳相似度較高， 但也有差異。海帶“早厚成一號”是通過自交選育得到的性狀優(yōu)良、遺傳穩(wěn)定的海帶品種。采集種質(zhì)時(shí)選取的均為性狀優(yōu)良的個(gè)體， 所以這些種質(zhì)材料在遺傳上相似度較高。根據(jù)聚類結(jié)果， 若以0.733為最低相似系數(shù)， 可將28個(gè)個(gè)體分為7個(gè)類群（圖1）。分別以取樣比例為25%、35%、50%、65%進(jìn)行初級核心種質(zhì)的篩選， 并對各比例下得到的種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性的評價(jià)（表2）。根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)， 考慮到雌、雄配子體數(shù)量的比例， 綜合評價(jià)遺傳多樣性的各種參數(shù)， 取樣比例為50%時(shí)構(gòu)建的核心種質(zhì)庫相對合理。

3 討論

海帶的生活史表現(xiàn)為異型世代交替， 即由大型的孢子體世代與微小的配子體世代互相交替而組成。配子體作為海帶種質(zhì)保存形式， 可長期保持種質(zhì)的均質(zhì)性的特異性， 利用配子體進(jìn)行保種和育苗，既可以長期保持其優(yōu)良性狀和純度， 也在很大程度上避免大田孢子體逐代選種和混采混育導(dǎo)致的種質(zhì)退化和混雜問題。每個(gè)海帶品種（系）在進(jìn)行配子體采集時(shí)， 為保證種質(zhì)保存的成功率和全面性， 通常會選擇多個(gè)不同個(gè)體的種海帶進(jìn)行配子體的分離、培養(yǎng)和保存， 這就導(dǎo)致保存的種質(zhì)材料可能存在重復(fù)，不能有效地進(jìn)行管理和利用。因此， 對同一品種保存的配子體進(jìn)行遺傳學(xué)評價(jià)， 從中篩選出核心種質(zhì)，提高種質(zhì)保存的效率和實(shí)用性。

圖1 28個(gè)早厚成配子體間基于RAPD遺傳相似性系數(shù)的UPGMA聚類圖Fig. 1 The UPGMA cluster diagram of the 28 “Zaohoucheng” gametophytes based on RAPD genetic similarity coefficient

圖2 主坐標(biāo)分析散點(diǎn)圖Fig. 2 Scatter diagram of principal coordinates analysis

表2 不同取樣比例獲得的核心種質(zhì)與原始種質(zhì)（100%）的遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 The genetic diversity parameters of different sampling rates for core collection and original collection （100%）

目前， 陸地植物方面， 國內(nèi)外主要依據(jù)表型性狀數(shù)據(jù)和分子標(biāo)記數(shù)據(jù)。表型性狀的數(shù)據(jù)與種質(zhì)資源應(yīng)用直接相關(guān)且容易獲取， 但一些數(shù)量性狀易受當(dāng)?shù)貧夂颦h(huán)境的影響， 存在不穩(wěn)定性， 難以真實(shí)地反應(yīng)出種質(zhì)資源的遺傳多樣性。分子標(biāo)記不受物種生長環(huán)境和生長時(shí)期的影響， 多態(tài)性高、信息量大且穩(wěn)定， 適用于遺傳多樣性評價(jià)和核心種質(zhì)取樣［22］。目前多采用表型性狀和分子標(biāo)記兩種數(shù)據(jù)相結(jié)合進(jìn)行構(gòu)建， 并根據(jù)分子標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行取樣。齊永文等利用20對SSR引物上的分子標(biāo)記數(shù)據(jù)和15個(gè)表型性狀資料， 開展了甘蔗細(xì)莖野生種的核心種質(zhì)構(gòu)建［22］。劉遵春等整合農(nóng)藝性狀和分子標(biāo)記數(shù)據(jù)構(gòu)建新疆野蘋果核心種質(zhì)， 所構(gòu)建的42 份新疆野蘋果核心種質(zhì)保留了300 份原始種質(zhì)93%以上的農(nóng)藝性狀， 很好地代表了原始種質(zhì)的遺傳多樣性［23］。但在經(jīng)濟(jì)海藻中尚未見有報(bào)道。本研究的材料為大型的經(jīng)濟(jì)海藻， 本研究中， 在采集海帶種質(zhì)時(shí)因?yàn)殒咦芋w存在表型的差異， 而且缺乏系統(tǒng)的養(yǎng)殖檢測結(jié)果， 因此， 難以直接與配子體進(jìn)行關(guān)聯(lián)評價(jià)， 只能采用分子標(biāo)記數(shù)據(jù)來進(jìn)行海帶核心種質(zhì)的評價(jià)， 用于核心種質(zhì)篩選的參考依據(jù)。在我們用SSR標(biāo)記對海帶“早厚成一號”群體的遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)， 所采用的SSR標(biāo)記在群體中的多態(tài)性呈現(xiàn)率很低， 難以區(qū)分其群體。目前，雖有一定量的SNP分子標(biāo)記， 但若要大批量應(yīng)用還存在技術(shù)和經(jīng)費(fèi)的限制。除此之外， 在電泳檢測的高通量標(biāo)記體系中， 只有AFLP和RAPD標(biāo)記， 但AFLP標(biāo)記的酶切和檢測體系都比較繁瑣， 且對基因組樣品的要求很高， 綜合考慮， 我們選用比較易操作且多態(tài)性高的RAPD標(biāo)記體系， 用篩選后的16條多態(tài)性高， 擴(kuò)增清晰的引物進(jìn)行遺傳學(xué)評價(jià)時(shí)發(fā)現(xiàn)，RAPD標(biāo)記在海帶“早厚成一號”群體中的多態(tài)性較高， 通過聚類分組和不同取樣比例， 綜合考慮雌雄配子體數(shù)量的比例， 在取樣比例為50%時(shí)篩選到的核心種質(zhì)相對合理， 可以達(dá)到預(yù)期效果。

另外， 在遺傳學(xué)評價(jià)策略方面， 對核心種質(zhì)其親緣關(guān)系相近的材料的取舍也影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。我們以群體的遺傳相似性系數(shù)， 采用UPGMA聚類法進(jìn)行分組， 采用簡單比例法進(jìn)行取樣， 計(jì)算不同取樣比例時(shí)的遺傳多樣性參數(shù)， 結(jié)合樣本的生長狀態(tài)和雌雄比例， 進(jìn)行取樣。初步結(jié)果表明， 該方法可以獲得海帶核心種質(zhì)材料， 對簡化海帶核心種質(zhì)材料的程序、優(yōu)化原有海帶核心種質(zhì)材料有積極意義。目前， 可用于進(jìn)行海帶核心種質(zhì)篩選的分子標(biāo)記種類和數(shù)量有限， 隨著技術(shù)的進(jìn)步， 若能將大量的SNP標(biāo)記體系用于核心種質(zhì)的篩選， 將會大大提高檢測效率。今后還需要確立相關(guān)的標(biāo)記評價(jià)體系， 檢驗(yàn)其在海帶核心種質(zhì)評價(jià)中的具體效果， 如提高種質(zhì)篩選效率、簡化種質(zhì)保存步驟等。

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（本文編輯： 康亦兼）

Establishment of core collection for Saccharina japonica using molecular markers

CUI Cui-ju1， LI Yan1， LIU Yan-ling1， LI Xiao-jie1， LUO Shi-ju1， WU Rui-na1，WANG Li-qin1， ZHANG Zhuang-zhi1， SUN Juan1， TIAN Xin2
（1. Shandong Oriental Ocean Sci-tech Co. Ltd， National Algae and Sea cucumber Project Technology Research Centre， Algae Genetic Breeding and Cultivation Technology Key Laboratory of Shandong Province，Yantai 264003， China； 2. Jiangxi University of Finance and Economics， Nanchang 330013， China）

Mar.， 19， 2015

Saccharina japonica； RAPD molecular markers； core germplasm； genetic diversity

Kelp is a large alga with an important economic and ecological value. The gametophytes are the preserved materials for kelp germplasm resources， which are also used for kelp crossbreeding and seedling. For an effective management and evaluation of kelp germplasm resources， a core collection of germplasm was screened. Genetic evaluation of 28 gametophytes of “Zaohoucheng” variety was conducted by RAPD molecular marker technology， using the UPGMA clustering method， based on the genetic similarity coefficient of grouping， simple percentage sampling （25%， 35%， 50%， and 35%）， and analysis and calculation of genetic diversity parameters of different sampling rates， combined with the growth status and proportion of males and females. The core collection at the sampling rate of 50% was relatively reasonable. These results laid the foundation for screening and genetic evaluation of core germplasm of kelp varieties （or lines）.

S917.3

A

1000-3096（2016）01-0018-07

10.11759/hykx20150319001

2015-03-19；

2015-05-14

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD55G01）； 國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2012AA10A406）； 煙臺市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2013LGS002）

崔翠菊（1984-）， 女， 山東濟(jì)寧人， 工程師， 博士， 主要從事海藻分子生物學(xué)和遺傳育種研究， 電話： 0535-6929510， Email：cuicuiju@163.com