馬慧玲，李笑梅

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院 省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150076)

響應(yīng)曲面法優(yōu)化β-葡萄糖苷酶固定化的研究

馬慧玲，李笑梅

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院 省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150076)

摘要：以黑曲霉β-葡萄糖苷酶作為研究對(duì)像，采用交聯(lián)-包埋的試驗(yàn)方法，以酶活力回收率作為評(píng)價(jià)的指標(biāo)，選取海藻酸鈉、殼聚糖、海藻酸鈉-殼聚糖為載體，對(duì)β-葡萄糖苷酶固定化效果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示海藻酸鈉-殼聚糖固定化效果最好.再進(jìn)行固定化條件單因素響應(yīng)曲面試驗(yàn)，得到的最優(yōu)條件為，海藻酸鈉-殼聚糖的混合載體中海藻酸鈉溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.91%、殼聚糖-醋酸溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.94%，溫度為40.20 ℃，交聯(lián)時(shí)間為0.98 h.此時(shí)酶活力為112 400 IU/mL，酶活力回收率為66.18%.經(jīng)過(guò)三次回收試驗(yàn)，酶活力回收率分別為65.61%、64.48%、64.16%.

關(guān)鍵詞：β-葡萄糖苷酶；固定化；酶活力回收率；海藻酸鈉；殼聚糖

β-葡萄糖苷酶廣泛的存在于自然界各種生物體內(nèi)，對(duì)生物的生長(zhǎng)、繁殖、代謝均起著重要作用[1-2].β-葡萄糖苷酶能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖鍵，同時(shí)釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基[3].雖然β-葡萄糖苷酶有著巨大的應(yīng)用價(jià)值，但是由于市場(chǎng)價(jià)格十分昂貴而且保存時(shí)間短，不可回收利用.酶的固定化是把酶束縛或者限制在一定的區(qū)域范圍內(nèi)，但是卻仍然能夠使它的催化特性得以保留，讓它能夠連續(xù)的反應(yīng)，并且可以回收重復(fù)使用的一項(xiàng)技術(shù).本文研究意旨在探討篩選出有效的固定化酶載體，使游離酶更易于與載體結(jié)合乃至于后續(xù)大豆異黃酮水解，進(jìn)而提高苷元轉(zhuǎn)化率，為苷元制備技術(shù)的進(jìn)一步開發(fā)及成果轉(zhuǎn)化提供參考數(shù)據(jù).

1材料與方法

1.1試驗(yàn)試劑

對(duì)硝基苯酚(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；對(duì)硝基苯酚-β-D吡喃葡萄糖苷(上海金穗生物科技有限公司)；β-葡萄糖苷酶(黑曲霉來(lái)源，南京生物科技有限公司)；殼聚糖(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；海藻酸鈉(天津市福晨化學(xué)試劑廠).

1.2試驗(yàn)儀器

722型光柵分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)；一次性注射器(1 mL沈陽(yáng)奉達(dá)醫(yī)療器械有限公司).

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用pH為5.0的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖溶液配置濃度為0、10、20、30、40、50、60 μmol/L的對(duì)硝基苯酚溶液，分別取2 mL上述稀釋液，于45 ℃水浴鍋中水浴30 min后，加入2 mL 0.5 mol/L的碳酸鈉溶液，混合均勻，于試管架中冷卻至室溫(n=3).使用722型分光光度計(jì)在400 nm處測(cè)定吸光光度值(A)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3.2游離酶活力的測(cè)定

酶活力定義：每分鐘水解生成1 μmol/L對(duì)硝基苯酚所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位.定義單位IU/ mL[4-5].

吸取1 mL稀釋的酶液于比色管中再分別加入1.5 mL pH5.0的緩沖液，0.4 mL 50 mmol/L對(duì)硝基苯酚-β-D吡喃葡萄糖苷溶液.混合均勻后將其置于45 ℃水浴鍋中30 min，其余步驟同1.3.1項(xiàng)下.

空白試驗(yàn)：以1 mL蒸餾水代替酶液，酶活力計(jì)算見(jiàn)公式(1).

(1)

其中：X為β-葡萄糖苷酶的活性，IU/mL；C為濃度，μmol/L；N為試樣溶液反應(yīng)前的總稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時(shí)間，min；V為游離酶液反應(yīng)用量，mL；m為固定化酶質(zhì)量，g.

1.3.3固定化酶的制備和活力的測(cè)定

吸取稀釋的酶液，加入到的固定化載體溶液中并充分混合均勻.逐滴添加到已配置好的相關(guān)溶液中進(jìn)行制球并硬化處理，然后再在戊二醛溶液中進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)得到固定化酶.用1.3.2 法測(cè)定固定化酶活力，并做相應(yīng)的平行試驗(yàn)(n=3)，酶活力回收率見(jiàn)式(2).

(2)

其中：W為酶活力回收率，%；M1為固定化酶的酶活力，IU/g；M0為游離酶的酶活力，IU/mL.

1.3.4三種不同固定化載體的比較篩選

1 )以海藻酸鈉為載體固定化β-葡萄糖苷酶

準(zhǔn)確吸取1 mL稀釋的酶液，添加到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的海藻酸鈉水溶液中，并充分混合均勻.用注射器逐滴緩慢的加入到4 g/L CaCl2溶液中去.在常溫下硬化2 h.然后用真空抽濾機(jī)進(jìn)行抽濾.在0.2%的戊二醛中交聯(lián)1h[6].用蒸餾水洗滌3遍，沖去未結(jié)合的游離酶以及固定化酶表面的戊二醛，得到固定化酶(n=3).

2) 以殼聚糖為載體固定化β-葡萄糖苷酶

以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的醋酸溶液將殼聚糖溶解，使之形成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的殼聚糖溶液.攪拌均勻[7].將酶液與殼聚糖-醋酸溶液攪拌均勻.用注射器將酶與殼聚糖的混合液滴入混有15%的氫氧化鈉溶液和95%乙醇的溶液中，制成殼聚糖微球放置于4 ℃條件下固定化2 h.其余步驟同上.

3) 以海藻酸鈉-殼聚糖為載體固定化β-葡萄糖苷酶

吸取稀釋的酶液與2%的海藻酸鈉水溶液混合均勻.用注射器緩慢的滴入到2%的殼聚糖-醋酸溶液和2%的CaCl2溶液的混合液中，形成微膠囊.然后將其放入4 ℃的冰箱中硬化2 h.其余步驟同上.

1.3.5酶固定化條件的單因素試驗(yàn)

在所篩選出最適宜載體下，選定載體溶液的濃度、交聯(lián)時(shí)間、反應(yīng)溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn).基礎(chǔ)條件分別為海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、交聯(lián)時(shí)間為1 h、反應(yīng)溫度為45 ℃，評(píng)價(jià)指標(biāo)為酶活力回收率.

1)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶活力回收率的影響

考察海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%時(shí)，對(duì)酶活力回收率的影響.

2)殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶活力回收率的影響

考察殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%時(shí)，對(duì)酶活力回收率的影響.

3)交聯(lián)時(shí)間對(duì)酶活力回收率的影響

考察交聯(lián)時(shí)間分別為0.5、1、1.5、2、2.5 h時(shí)，對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響.

4)反應(yīng)溫度對(duì)酶活力回收率的影響

考察反應(yīng)溫度分別為35、40、45、50、55 ℃時(shí)，對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響.

1.3.6響應(yīng)曲面法確定最優(yōu)固定化條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)曲面的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因子編碼及水平如表1.

表1　試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼

1.3.7最優(yōu)條件的驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)響應(yīng)曲面試驗(yàn)得到最優(yōu)化條件后，在此最優(yōu)化條件下，重新制定最優(yōu)的固定化酶，并進(jìn)行此時(shí)固定化酶的酶活以及酶活力回收率的測(cè)定.將反應(yīng)過(guò)后的固定化酶進(jìn)行回收，用蒸餾水沖洗干凈，進(jìn)行酶解反應(yīng)(n=3)，計(jì)算酶活力回收率，與之前各組酶活力回收率比較，驗(yàn)證最優(yōu)條件.

2結(jié)果與討論

2.1對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定結(jié)果

以對(duì)硝基苯酚的濃度值作為橫坐標(biāo)，吸光光度值作為縱坐標(biāo)，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.009 8x-0.001 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2.

2.2最適宜固定化載體的篩選結(jié)果

從表2中可以看出，以海藻酸鈉-殼聚糖作為固定化β-葡萄糖苷酶的載體時(shí)，得到的酶活力回收率為61.43%，比分別以海藻酸鈉或者是殼聚糖作為固定化載體的回收率都要高.結(jié)論與周亞軍[8]相同.認(rèn)為殼聚糖和海藻酸鈉共用的新型復(fù)合載體(ACA)固定化酶的活性更高，更適合作為載體.

表2　不同載體對(duì)固定化酶的酶活力回收率的影響

2.3單因素條件的試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶活力回收率的影響

由圖1可以看出，殼聚糖溶液的適宜質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%～2.5%.這是因?yàn)楫?dāng)殼聚糖溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)<2%時(shí)，制備的交聯(lián)微球可提供更多游離醛基，用以共價(jià)連接酶.所以會(huì)使得固定化酶的活力不斷增大.但當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)>2%時(shí)，隨著其再次不斷增大，會(huì)使網(wǎng)狀的連接越來(lái)越緊密，而使微球的空隙越來(lái)越小.這樣使得酶進(jìn)入微球的難度逐漸增大，固定化酶的結(jié)合率降低，從而降低固定化酶的催化活力，使得酶活力回收率又開始不斷的下降.

圖1　殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化結(jié)果的影響

2.3.2海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化效果的影響

由圖2可以看出，酶活力回收率隨著海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而增大，直至質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2%.當(dāng)海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，此時(shí)酶活力回收率的值最大，為68.15%.當(dāng)海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)再次增加時(shí)，酶活力回收率不再增加，反而出現(xiàn)下降的現(xiàn)象.所以海藻酸鈉最佳的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.5%～2.5%之間.

圖2　海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化結(jié)果的影響

2.3.3交聯(lián)時(shí)間對(duì)酶活力回收率的影響結(jié)果與分析

由圖3可以看出，最佳的交聯(lián)時(shí)間在0.5～1.5 h之間，當(dāng)交聯(lián)時(shí)間較短，小于1 h時(shí)，固定化不完全.當(dāng)交聯(lián)時(shí)間在0.5～1 h時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，使固定化酶很好的結(jié)合，凝膠效果也越來(lái)越好，酶分子流失的較少，所以使得酶活力回收率會(huì)逐漸的增大.當(dāng)交聯(lián)時(shí)間為1 h時(shí)，凝膠效果最好，固定化結(jié)果最佳.但當(dāng)交聯(lián)時(shí)間大于1 h時(shí)，交聯(lián)程度會(huì)逐漸變高，凝膠所形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)會(huì)越來(lái)越緊密，從而限制酶促反應(yīng)的效率，部分酶也會(huì)因此失活.

圖3　交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化結(jié)果的影響

2.3.4反應(yīng)溫度對(duì)酶活力回收率的影響結(jié)果

由圖4可以看出，當(dāng)溫度為35～40 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，酶活力回收率會(huì)逐漸的變大.當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)，酶活力回收率達(dá)到最大值.但當(dāng)溫度再逐漸升高時(shí)，酶活力回收率會(huì)逐漸降低，所以最佳的反應(yīng)溫度為35～45 ℃之間.

圖4　反應(yīng)溫度對(duì)固定化結(jié)果的影響

2.4響應(yīng)曲面法確定最優(yōu)固定化條件的結(jié)果

2.4.1響應(yīng)曲面法優(yōu)化固定條件的結(jié)果

見(jiàn)表3.利用Design Expert 軟件對(duì)表3響應(yīng)曲面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果的數(shù)據(jù)進(jìn)行了多元回歸擬合分析，得到了酶活力回收率的回歸方程：

Y=65.77+0.81X1-4.93X2-3.15X3+0.80X4+1.32X1X2-0.61X1X3-1.57X1X4-4.28X2X3+0.40X2X4+1.34X3X4-14.86X12-13.44X22-13.78X32-11.84X42

表3　響應(yīng)曲面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

2.4.2酶活力回收率模型及回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

表4　 酶活力回收率回歸方程系數(shù)

2.4.3酶活力回收率的響應(yīng)面分析

見(jiàn)圖5～10.得出的最優(yōu)化固定條件為海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.91%、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.94%、反應(yīng)溫度為40.20 ℃、交聯(lián)時(shí)間為0.98 h.且海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和海藻酸鈉殼聚糖交互作用為本試驗(yàn)的顯著因素.在此最優(yōu)化固定條件下，酶活力回收率為66.18%.試驗(yàn)結(jié)果具有顯著性，可作為工業(yè)生產(chǎn)或研究試驗(yàn)的條件.

圖5　反應(yīng)溫度與海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互作用

圖6　反應(yīng)溫度與殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互作用

圖7　反應(yīng)溫度與交聯(lián)時(shí)間的交互作用

圖8　海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)與殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互作用

圖9　海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)與反應(yīng)時(shí)間的交互作用

圖10　海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)與反應(yīng)時(shí)間的交互作用

2.5驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

在最優(yōu)化矯正條件下殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，交聯(lián)時(shí)間1 h，反應(yīng)溫度40 ℃下，進(jìn)行最優(yōu)結(jié)果的測(cè)定，并把反應(yīng)過(guò)后的固定化酶反復(fù)回收3次進(jìn)行回收試驗(yàn)，具體試驗(yàn)結(jié)果如表5所示.

表5　最優(yōu)條件下以及固定化酶的回收試驗(yàn)結(jié)果

由表5可以看出，在響應(yīng)曲面試驗(yàn)優(yōu)化反應(yīng)條件后，在最優(yōu)化條件下，得到的酶活力回收率為66.18%.在進(jìn)行29組響應(yīng)曲面試驗(yàn)時(shí)，最好的酶活力回收率為65.77%(P<0.0001)，具有極顯著性.將反應(yīng)過(guò)后的固定化酶反復(fù)回收，得到的酶活力回收率分別為65.61%、64.48%、64.16%.

3結(jié) 論

本試驗(yàn)先對(duì)游離酶進(jìn)行包埋，后進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，使固定化效果更好.選取載體濃度、反應(yīng)溫度、交聯(lián)時(shí)間為單因素條件.且得到最適宜的固定化條件為海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、反應(yīng)溫度為40 ℃、交聯(lián)時(shí)間為1 h.在此條件下，酶的固定化效果最好、酶活力回收率的值最大，為61.43%.然后進(jìn)行響應(yīng)曲面條件優(yōu)化試驗(yàn)時(shí)，得出的最優(yōu)化固定條件為海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.91%、殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.94%、反應(yīng)溫度為40.20 ℃、交聯(lián)時(shí)間為0.98 h.且海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)和殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為本試驗(yàn)的顯著因素.在此最優(yōu)化固定條件下，做驗(yàn)證試驗(yàn)，酶活力回收率為66.18%.試驗(yàn)結(jié)果具有顯著性，可作為工業(yè)生產(chǎn)或研究試驗(yàn)的條件.將反應(yīng)過(guò)后的固定化酶進(jìn)行重復(fù)回收試驗(yàn)，分別得出酶活力回收率為65.61%、64.48%、64.16%.固定化效果浮動(dòng)不大，所以固定化效果較好.

參考文獻(xiàn)：

[1]張慶華, 李世杰, 涂國(guó)全, 等. 細(xì)菌HGS-3產(chǎn)β-葡萄糖苷酶發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 中國(guó)釀造, 2007(11): 12-16.

[2]石彩蕊, 王義強(qiáng), 陳介南, 等. 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶微生物育種研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào), 2011(3): 59-65.

[3]李英波,吳國(guó)林.β-葡萄糖苷酶及酶固定化研究進(jìn)展[J]. 茶葉通報(bào), 2004, 26(1): 21-22.

[4]張正竹, 李英波, 蘇二正, 等.β-葡萄糖苷酶的蠶絲素蛋白膜固定化及其性質(zhì)研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2004, 30(6): 6 -9.

[5]YAN T R. LIN C L. Purification and characterization of a glucose-tolerant beta-glucosidase from Aspergillus niger CCRC 31494 [J]. Biosc.i Biotech. Biochem, 1997, 61(6): 965 -970.

[6]CHANG M Y, JUANG R S. Use of chitosan-clay composite as immobilization support for improved activity and stability ofβ-glucosidase [J].Biochem.Eng.J, 2007, 35: 93 -98.

[7]JUANG R S, WU F C, TSENG R L. Use of chemically modified chitosan beads for sorption and enzyme immobilization [J]. Advances in Environmental Research, 2002, 6: 171 -177.

[8]周亞軍, 王淑杰, 蘇丹, 等.β-葡萄糖苷酶ACA微膠囊固定化實(shí)驗(yàn)研究[J]. 現(xiàn)代化工, 2009, 29(10): 51-54.

Optimization of immobilizatiedβ-glucosidase with response surface methodology

MA Hui-ling, LI Xiao-mei

(Key Laboratory of Food Science and Engineering, School of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

Abstract：The entrapped immobilization method was used with Aspergillus niger β-glucosidase as a research object and the enzyme activity recovery rate as evaluation index. Sodium alginate, chitosan and sodium alginate-chitosan chitosan were selected as the carriers, and the effects of the entrapped immobilization were compared. The Results showed that sodium alginate chitosan was the best supporter. Immobilization conditions of single factor and response surface experiment were performed, and the optimal conditions were obtained: the alginate mass fraction of the mixed carriers was 1.91%, the chitosan mass fraction of the mixed carriers was 1.94%, the temperature was 40.20 ℃, and the crosslinking time was 0.98 h. At this time, the enzyme activity was 112 400 IU/mL, and the recovery of the enzyme activity was 66.18%. After the three recovery experiments the recoveries of the enzyme activity were 65.61%, 64.48% and 64.16%.

Key words：β- glycosides; immobilization；enzyme activity recovery；sodium alginate； chitosan

收稿日期：2015-08-20.

基金項(xiàng)目：黑龍江省科技廳應(yīng)用技術(shù)項(xiàng)目(G013B203)；黑龍江省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目(2010td04)

作者簡(jiǎn)介：馬慧玲(1988-)，女，碩士，研究方向：食品科學(xué).

中圖分類號(hào)：S2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-0946(2016)03-0357-06