孫麗萍，　胡巢鳳，　張欣洲△

(1暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 深圳 518020;2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣東 廣州 510632)

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TRAF3抑制NF-κB引起的腎囊腔形成作用*

孫麗萍1，胡巢鳳2，張欣洲1△

(1暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 深圳 518020;2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣東 廣州 510632)

[摘要]目的： 研究腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3(TRAF3)對多囊腎集合管上皮細(xì)胞中核因子κB(NF-κB)信號通路及其下游產(chǎn)物表達(dá)的影響；觀察TRAF3基因過表達(dá)的多囊腎集合管上皮細(xì)胞形成管狀分支結(jié)構(gòu)的變化，探討TRAF3在多囊腎囊腔形成的發(fā)生發(fā)展中可能產(chǎn)生的作用。方法: Western blot檢測多囊腎集合管上皮細(xì)胞和TRAF3基因過表達(dá)多囊腎集合管上皮細(xì)胞中NF-κB信號通路的變化，同時檢測下游凋亡因子Bax 及 Bid 的表達(dá)及caspase-3 活性變化；通過Annexin V-FITC/PI雙染法檢測各組細(xì)胞的凋亡情況；應(yīng)用三維(3D)培養(yǎng)法觀察多囊腎集合管上皮細(xì)胞形成管狀分支結(jié)構(gòu)變化的差異。結(jié)果: TRAF3的過表達(dá)能顯著抑制多囊腎集合管上皮細(xì)胞中 NF-κB 信號通路的活性，使下游的Bax及Bid表達(dá)顯著下調(diào)，細(xì)胞凋亡明顯減少；TRAF3 基因過表達(dá)多囊腎集合管上皮細(xì)胞管狀分支結(jié)構(gòu)較多囊腎集合管上皮細(xì)胞組明顯增多。結(jié)論: TRAF3可能通過調(diào)節(jié)NF-κB 信號通路降低Bax及Bid活性，抑制細(xì)胞凋亡，從而抑制多囊腎囊腔形成。

[關(guān)鍵詞]腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3; 核因子κB; 細(xì)胞凋亡; 囊腔形成,腎

多囊腎(polycystic kidney disease，PKD)是一種常見的常染色體遺傳病，為單基因遺傳，遺傳學(xué)上將其分為顯性和隱性2大類，兩種類型均造成雙側(cè)腎臟發(fā)生病變。其中常染色體顯性遺傳性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)最常見，主要特點(diǎn)為腎小管上皮細(xì)胞來源的充滿液體的囊泡不斷地形成和擴(kuò)張，且典型病例在中年時期會發(fā)展到終末期腎臟疾病(end-stage renal disease，ESRD)階段，5%～10%使用腎臟替代治療的 終末期腎臟病患者均由 ADPKD 引起[1]。常染色體隱性遺傳性多囊腎病(autosomal recessive polycystic kidney disease，ARPKD)是一種多發(fā)于嬰幼兒的遺傳性疾病，全球發(fā)病率約為1/20 000[2]。ADPKD 多于成年后發(fā)病，發(fā)病率高(約為 1/400～1/1 000)且預(yù)后不良，目前臨床上尚無有效治療方法。因此，深入了解多囊腎病的發(fā)病機(jī)理，揭示其發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制，針對致病基因發(fā)病機(jī)理進(jìn)行干預(yù)，并探討有效的早期診斷標(biāo)志物及藥物治療靶點(diǎn)，具有重要意義。

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)家族是一類重要的胞內(nèi)接頭蛋白，能直接或間接與胞漿內(nèi)的其它信號分子結(jié)合，從而參與多種下游信號通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活、凋亡[3]。目前已發(fā)現(xiàn)7種不同的TRAF蛋白，TRAF3就是其中的一員。TRAF3廣泛存在于體內(nèi)的各個組織，是核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)非經(jīng)典通路重要的銜接蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)[4-5]，TRAF3表達(dá)下調(diào)可抑制 腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)引起的 NF-κB p100 的聚集并激活I(lǐng)KK復(fù)合物，引起NIK表達(dá)增加。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，在多囊腎肝病1(polycystic kidney and hepatic disease 1，Pkhd1)基因部分沉默的內(nèi)髓集合管細(xì)胞 (inner medullary collecting duct, IMCD)中，NF-κB處于持續(xù)性激活狀態(tài)，并可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，并發(fā)現(xiàn)NF-κB促進(jìn)三維(3D)培養(yǎng)的腎小管管腔增大，囊腔形成。因此，TRAF3 可能通過調(diào)節(jié)NF-κB通路，參與ARPKD腎集合管上皮細(xì)胞抗凋亡作用。本研究旨在探討多囊腎細(xì)胞中 TRAF3 是否可以通過NF-κB信號通路抑制多囊腎囊腔形成。

材料和方法

1材料

1.1主要材料與試劑RPMI-1640 培養(yǎng)基、LHC-9 培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素鏈霉素雙抗溶液(HyClone)；EDTA-胰蛋白酶(Gibco)；DMSO (Sigma)；DBA 免疫組化試劑盒(ZYMED Laboratories Inc.)；BCA 蛋白濃度測定試劑盒(Pierce)；NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents kit (碧云天生物技術(shù)研究所)；Caspase-3 Activity Assay Kits(Calbiochem)；兔抗鼠 NF-κB (p65) 抗體試劑盒、HRP標(biāo)記的羊抗兔II抗(Cell Signaling Technology)；兔抗鼠TRAF3多克隆抗體、兔抗鼠Bax單克隆抗體、兔抗鼠及Bid單克隆抗體(Santa Cruz)；小鼠內(nèi)髓集合管細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；其它試劑均為 Fisher 產(chǎn)品。

1.2多囊腎小鼠模型的建立Pkhd1 基因第 15 和 16 外顯子敲除的C57BL/6小鼠模型由南華大學(xué)賀修勝教授饋贈。由于Pkhd1 基因缺失，該小鼠模型的肝和腎表現(xiàn)出不同程度的管道擴(kuò)張、囊腫和纖維化，有部分小鼠在胚胎即死亡，絕大部分小鼠由于肝腎囊腫而僅能存活 1 年；除此之外，Pkhd1-/-小鼠的胰腺和腦組織也出現(xiàn)囊腫和小管擴(kuò)張；這些癥狀很好地模擬了人類 ARPKD。文中我們將這一Pkhd1 基因突變小鼠模型稱為多囊腎小鼠。

1.3多囊腎集合管上皮細(xì)胞的分離及擴(kuò)增培養(yǎng)將8周齡多囊腎小鼠乙醚麻醉，75%乙醇浸泡10 min；無菌條件下，打開腹腔，迅速取出腎臟，置于10 mL預(yù)冷的PBS(含5 mmol/L蔗糖)中，冰浴。用刀片切碎腎臟。用10 mL 0.5%膠原酶將其轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，用吸管吹散混勻；在37 ℃條件下消化40 min，將消化后的組織液用70 μm孔徑濾篩網(wǎng)過濾去除未被消化的結(jié)締組織；過濾后室溫1 000 r/min離心10 min。棄去上清后加入10 mL的PBS(含5 mmol/L蔗糖)，混勻，室溫1 000 r/min離心5 min,重復(fù)用PBS洗滌1次。棄去上清，加入含DBA抗體(終濃度10 μmol/L)的PBS(含5 mmol/L蔗糖)10 mL，4 ℃反應(yīng)1 h，1 000 r/min離心5 min，用PBS(含5 mmol/L蔗糖)洗滌2次，完全棄去上清。將含有磁珠的1 mL PBS(含5 mmol/L蔗糖，可結(jié)合的最大細(xì)胞數(shù)為2×107)重懸后，轉(zhuǎn)移至已棄去上清的含有細(xì)胞沉淀的離心管中，充分混勻，4 ℃反應(yīng)30 min。置于磁柱上吸附5 min，吸掉液體，加入5 mL PBS(含5 mmol/L蔗糖)，小心混勻，洗滌2次。棄去上清，加入含5 μL release buffer的無血清RPMI-1640 培養(yǎng)基 400 μL，混勻后37 ℃孵育20 min。置于磁柱上吸附5 min，將上清轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入RPMI-1640 培養(yǎng)基洗滌2次，室溫 1 000 r/min 離心 5 min。棄去上清，加入適量含5%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基混勻，加入24 孔板中(24孔板事先加入0.1%明膠包被，室溫放置 30 min 以上)，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h。待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基換成含 γ-干擾素 的 LHC-9 培養(yǎng)基，33 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞都需轉(zhuǎn)移至 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3 d后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)小鼠多囊腎集合管上皮細(xì)胞和小鼠IMCD 細(xì)胞株均用含 10% 胎牛血清、1% 雙抗的 RPMI-1640 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。3～4 d 細(xì)胞長到 90%左右融合時，PBS 緩沖液清洗，用胰酶消化，離心收集細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)后細(xì)胞按每孔 1×106個接種于 6 孔板。IMCD細(xì)胞是內(nèi)髓集合管細(xì)胞，我們前期利用 RNAi 特異性抑制 Pkhd1 在 IMCD 細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，NF-κB處于持續(xù)性激活狀態(tài)，并可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加， IMCD 細(xì)胞不能在 3D培養(yǎng)條件形成管狀分支結(jié)構(gòu)，文中用此細(xì)胞作為從多囊腎小鼠腎臟提取的細(xì)胞的對照細(xì)胞。

2.2TRAF3基因轉(zhuǎn)染構(gòu)建pCDNA3.0-hTRAF3質(zhì)粒，用 pCDNA 空載體質(zhì)粒作為對照質(zhì)粒，用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。提取蛋白 用Western blot檢測TRAF3的表達(dá)效率。

2.3細(xì)胞核蛋白提取按NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents Kit試劑盒說明書加入核蛋白抽提試劑提取細(xì)胞中核蛋白，終濃度調(diào)整為2 g/L。細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%融合，棄培養(yǎng)液，加3 mL預(yù)冷 PBS 漂洗細(xì)胞2次，棄漂洗液，取1.5 mL胞漿蛋白裂解液I漂洗細(xì)胞1次，棄漂洗液，取1.0 mL胞漿蛋白裂解液H于培養(yǎng)瓶中溶解細(xì)胞，吸凈裂解液，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，4 ℃、14 000 r/min離心2 min，分離上清，取0.5 mL胞漿蛋白裂解液I漂洗沉淀 1 次，4 ℃、14 000 r/inm離心2 min，取50 μL核裂解液重懸沉淀，4 ℃靜置30 min，棄上清，4 ℃、14 000 r/min離心20 min，取上清液(即核抽提物)于-80 ℃保存。

2.4HE染色取材標(biāo)本放置于 4%多聚甲醛中固定 18～24 h，脫水石蠟包埋，制成石蠟標(biāo)本，4 μm 切片，每 1 例均連續(xù)切片，用于 HE 染色和免疫組織化學(xué)染色。組織片置于二甲苯中浸泡 15 min，更換二甲苯后再浸泡 2 min，在 100%、95%、90%、85%的乙醇中依次浸泡 3 min，流動自來水清洗 2 min，用蘇木素染色 5 min，流動自來水沖洗 5 min，鹽酸乙醇分化 2 min，自來水沖洗 5 min，70%乙醇浸泡 2 min，伊紅染色 1 min，將載玻片依次放入 95%乙醇-100%乙醇×二甲苯II，各2 min，通風(fēng)櫥室溫晾干，細(xì)胞核染成藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)為紅色。光學(xué)顯微鏡觀察、拍照。

2.5Western blot檢測蛋白水平當(dāng)細(xì)胞融合度為 80%～90%時，用RIPA裂解液冰上裂解 30 min，4 ℃、 12 000 r/min 離心 15 min，取上清液用BCA 法上酶標(biāo)儀測定蛋白濃度；上樣20 μg蛋白，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，100 ℃加熱5 min，使蛋白變性；30 mA 恒流行 7%～15% SDS-PAGE 分離樣本，以 100 V 恒壓轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，用 5% 脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，分別加入兔抗鼠TRAF3(1∶800)、抗NF-κB(p65)、抗Bid(1∶1 000)及抗Bax抗體 (1∶1 000)室溫孵育 2 h，次日用 TBST 漂洗 3次后加入 HRP 標(biāo)記的II抗 (1∶5 000)室溫孵育 1 h，TBST 清洗3 次加入 ECL 顯色；通過凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各蛋白變化。以β-actin 作為內(nèi)參照。

2.6細(xì)胞免疫熒光染色4%多聚甲醛固定細(xì)胞，置于 4 ℃ 30 min；PBS 洗3遍后，用1% BSA+0.3% Triton X-100 室溫透化 1 h。1 % BSA 溶液室溫封閉2 h，加入適量 I 抗稀釋液(1 % BSA 溶液)配制 I 抗，4 ℃反應(yīng)過夜。PBS洗3次，加入Cy2/Cy3 標(biāo)記 II 抗(1∶1 000 稀釋于 1% BSA/PBS 中)，避光室溫反應(yīng) 1 h，PBS 洗3 次，加入DAPI (1∶10 000 稀釋于 PBS 中)室溫反應(yīng) 30 s；PBS 洗3 次。用封片劑 Aqueous Mountant 封片，蓋玻片周圍用指甲油密封。封片后熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察或保存于 4 ℃后續(xù)觀察。

2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡取對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×108/L，接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)；細(xì)胞長至80%融合時，無血清饑餓24 h誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；收集細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌；重懸細(xì)胞于0.5 mL binding buffer中，加入2 μL Annexin V-EGFP 和5 μL 碘化丙啶(propidium iodide, PI)，混勻后室溫避光反應(yīng)10 min，應(yīng)用Single histogram statistic分析軟件測定細(xì)胞凋亡率。

2.8Caspase-3的活性檢測按照Calbiochem的Caspase-3 Activity Assay Kits 操作說明，離心收集細(xì)胞，使用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，加裂解緩沖液重懸細(xì)胞，冰上孵育20 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清進(jìn)行蛋白含量測定；加入反應(yīng)試劑，與caspase-3的底物(Nacetyl-Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilide)在37 ℃孵育4 h； 405 nm處測定吸光度(A)值。

2.93D細(xì)胞培養(yǎng)待細(xì)胞長至90%融合時，0.25%胰酶消化細(xì)胞，并用無血清1×RPMl-1640培養(yǎng)基清洗1遍。按下列比例配置膠原基質(zhì)膠：375 μL H2O，100 μL 200 mmol/L HEPES，10×RPMI-1640 100 μL，50 μL 74 g/L NaHCO3，375 μL rat type I collagen，25 μL Matrigen，1滴 NaOH(pH7.4)，5 μL內(nèi)含3×106細(xì)胞的細(xì)胞液，混勻。96孔板每孔加入 100 μL 混有細(xì)胞的膠原基質(zhì)膠，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個復(fù)孔。剩余的細(xì)胞再加入等體積的膠原基質(zhì)膠使細(xì)胞濃度減半，再按3個復(fù)孔種于96孔板。置 37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h，待膠凝固后加入100 μL 培養(yǎng)基 (10%胎牛血清+1×RPMI-1640)。37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 7 d后，顯微鏡下觀察。

3統(tǒng)計學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次，各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較用單因素方差分析，并用 SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行各組之間的兩兩比較，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1常染色體隱性遺傳性多囊腎小鼠模型的鑒定

為了確定多囊腎小鼠模型作為腎囊腫研究的可行性，本實(shí)驗(yàn)收取從胚胎時期到出生后不同時期小鼠腎臟(胚胎15.5 d、18.5 d，出生后5 d、10 d)，HE染色觀察從胚胎時期到小鼠死亡不同時期腎臟囊性結(jié)構(gòu)發(fā)展過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)多囊腎小鼠腎臟囊腫在胚胎15.5 d時已經(jīng)出現(xiàn)囊性結(jié)構(gòu)，隨著時間的延長，胚胎18.5 d時，在髓質(zhì)區(qū)囊性結(jié)構(gòu)變大；出生后5 d，腎臟囊性結(jié)構(gòu)進(jìn)一步發(fā)生融合,變大；出生后10 d，腎臟大部分區(qū)域發(fā)生囊性化，皮質(zhì)變薄，可見融合的囊性結(jié)構(gòu),見圖1。

2多囊腎集合管上皮細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)

從8周齡多囊腎小鼠中取出腎臟，通過應(yīng)用雙花扁豆凝集素(Dolichus biflorus agglutinin，DBA)分離方法，獲得的多囊腎集合管上皮細(xì)胞系。DBA作為集合管細(xì)胞標(biāo)志物[8]，并用E-cadherin作為上皮細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)物[9]，以鑒定細(xì)胞原始來源。免疫熒光染色顯示本實(shí)驗(yàn)原代分離的細(xì)胞表達(dá)集合管細(xì)胞標(biāo)志物DBA和上皮細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)物 E-cadherin。結(jié)果表明，我們已成功建立多囊腎集合管上皮細(xì)胞，見圖2。

Figure 1.The changes of renal cysts in a mouse model of ARPKD in different periods under microscope.E：embryonic；P：postnatal (×10).

圖1不同時期10倍鏡下多囊腎小鼠腎臟囊腫的變化

Figure 2.The characteristics of collecting duct cell lines derived from the kidneys of mouse model of ARPKD. The cell lines were characterized by staining with collecting duct cell marker Dolichos biflorus agglutinin and epithelial cell markers E-cadherin. The scale bar=5 μm.

圖2多囊腎小鼠腎臟集合管上皮細(xì)胞的特征

細(xì)胞鑒定成功后，在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入TNF-α(質(zhì)量濃度 50 μg/L)分別作用15 min和30 min后收取蛋白，Western blot檢測細(xì)胞核NF-κB (p65)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示刺激15 min 時點(diǎn)多囊腎集合管上皮細(xì)胞組胞核 NF-κB (p65)蛋白表達(dá)水平明顯高于IMCD組(P<0.05)，30 min 時點(diǎn)胞核NF-κB(p65)表達(dá)水平與IMCD組比較也明顯升高(P<0.05)，且與15 min時點(diǎn)相當(dāng),見圖 3。

3TRAF3 對 NF-κB 信號通路及Bax、Bid的作用

TRAF3基因過表達(dá)多囊腎集合管上皮細(xì)胞組(實(shí)驗(yàn)組)TRAF3表達(dá)顯著增高。TNF-α 刺激15 min后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核NF-κB(p65)及細(xì)胞中Bax、Bid的表達(dá)較多囊腎集合管上皮細(xì)胞組(對照組)明顯下降(P<0.05)，而兩組內(nèi)Bax及Bid 的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。表明TRAF3 對NF-κB信號通路激活的抑制可以進(jìn)一步影響下游凋亡因子的表達(dá)，見圖4。

Figure 3.The expression of NF-κB (p65) in the ARPKD renal collecting duct epithelial cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsIMCD group.

圖3多囊腎集合管上皮細(xì)胞中NF-κB(p65)的表達(dá)

4TRAF3對細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對于IMCD組細(xì)胞，多囊腎集合管上皮細(xì)胞組中的細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；與多囊腎集合管上皮細(xì)胞組相比，過表達(dá)TRAF3的多囊腎集合管上皮細(xì)胞組細(xì)胞凋亡率明顯減少(P<0.05)。

我們檢測了caspase-3的酶活性，進(jìn)而驗(yàn)證細(xì)胞凋亡中caspase-3活性的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與IMCD組相比，多囊腎集合管上皮細(xì)胞組的caspase-3活性顯著增加(P<0.05),而過表達(dá)TRAF3的多囊腎集合管上皮細(xì)胞組caspase-3活性則較多囊腎集合管上皮細(xì)胞顯著降低。結(jié)果和Annexin V-FITC/PI雙染的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果一致,見圖5。

Figure 4.The activation of NF-κB signaling pathway in TRAF3 over-expressed cells. Control group was ARPKD renal collecting duct epithelial cells, experiment group was TRAF3 over-expressed ARPKD renal collecting duct epithelial cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4TRAF3 過表達(dá)細(xì)胞中NF-κB信號通路激活情況

5TRAF3對3D培養(yǎng)條件下管狀分支結(jié)構(gòu)形成的影響

在膠原/基質(zhì)膠三維培養(yǎng)條件下，80% IMCD細(xì)胞能形成腎內(nèi)小管樣分支結(jié)構(gòu)；與此相反，約95%的多囊腎集合管上皮細(xì)胞管狀分支的形成顯著降低，而形成囊樣結(jié)構(gòu)，不能形成管狀分支結(jié)構(gòu)。接近60%的TRAF3過表達(dá)多囊腎集合管上皮細(xì)胞組能形成4個及其以上的分支，約 35%的細(xì)胞能形成1～3個分支，僅不足5%的細(xì)胞不能形成分支結(jié)構(gòu)，見圖6。

Figure 5.The apoptosis was analyzed in the cells of TRAF3 over-expressed ARPKD renal collecting duct epithelial cells. A: the apoptosis was determined by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI double staining; B: the caspase-3 activity was measured. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsIMCD and TRAF3+PKD collecting duct epithelial cells.

圖5TRAF3過表達(dá)對細(xì)胞凋亡的影響

Figure 6.Tubulomorphogenesis was inducted in 3D culture of TRAF3 over-expressed PKD renal collecting duct epithelial cells. The scale bar=20 μm. A: IMCD cell; B: PKD renal collecting duct epithelial cell; C: TRAF3 over-expressed PKD renal collecting duct epithelial cell; D: cell tubulomorphogenesis counting. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsIMCD group.

圖6TRAF3過表達(dá)能促進(jìn)多囊腎集合管上皮細(xì)胞形成管狀分支結(jié)構(gòu)

討論

本研究通過對多囊腎集合管上皮細(xì)胞進(jìn)行 TNF-α 刺激后檢測 NF-κB 信號通路的變化，證實(shí)NF-κB信號通路在多囊腎中起一定作用，進(jìn)一步檢測過表達(dá)TRAF3 多囊腎集合管上皮細(xì)胞后 NF-κB 活性及其下游凋亡因子 Bax 及 Bid表達(dá)的變化，同時觀察了細(xì)胞凋亡情況，并觀察多囊腎集合管上皮細(xì)胞形成管狀分支結(jié)構(gòu)的變化。證實(shí)了過表達(dá) TRAF3 可以下調(diào)下游凋亡因子的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而使多囊腎集合管上皮細(xì)胞形成管狀分支結(jié)構(gòu)。

多囊腎的發(fā)生是由人類腎臟小管生長發(fā)育分子失調(diào)所造成，因此揭示多囊腎發(fā)病機(jī)制，將有助于揭示腎臟小管發(fā)生、發(fā)育的分子機(jī)制[10]。我們前期研究證實(shí)了NF-κB 在FPC 缺陷細(xì)胞中處于持續(xù)性激活狀態(tài)。而最近研究發(fā)現(xiàn)抑制TRAF3的表達(dá)引起經(jīng)典和非經(jīng)典NF-κB的共同激活。因此我們推測TRAF3可能通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路抑制下游凋亡因子的活性，從而參與腎囊腫形成過程。本研究將TRAF3基因轉(zhuǎn)染多囊腎集合管上皮細(xì)胞使其過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)相對于轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的對照組，TNF-α激活的 NF-κB通路中的Bax及Bid的表達(dá)水平明顯下降，證明過表達(dá)TRAF3之后，多囊腎集合管上皮細(xì)胞中凋亡通路的激活受到抑制，使細(xì)胞凋亡減少。本研究結(jié)果顯示：過表達(dá)TRAF3 細(xì)胞中TNF-α刺激的下游抗凋亡因子Bax及Bid表達(dá)量顯著低于對照組，由此可知，TRAF3 在多囊腎集合管上皮細(xì)胞中可抑制NF-κB通路以及下游凋亡因子的激活與表達(dá)。

多項研究表明，小鼠腎集合管上皮細(xì)胞，在膠原/基質(zhì)膠三維培養(yǎng)條件下能形成腎內(nèi)小管樣分支結(jié)構(gòu)[11]。ADPKD 的致病基因(PKD1 和PKD2)缺失能抑制在三維培養(yǎng)條件下形成管狀分支結(jié)構(gòu)[12]；而高表達(dá)PKD1能促進(jìn)MDCK細(xì)胞管狀分支結(jié)構(gòu)形成[13]；我們前期利用 RNAi 特異性抑制Pkhd1在IMCD細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，IMCD3 細(xì)胞不能在 3D培養(yǎng)條件形成管狀分支結(jié)構(gòu)。本研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的TRAF3過表達(dá)多囊腎集合管上皮細(xì)胞組形成管狀分支結(jié)構(gòu)較多囊腎集合管上皮細(xì)胞管狀分支的形成明顯增多。證明 TRAF3 過表達(dá)多囊腎集合管上皮細(xì)胞中，囊腔形成明顯減少。

綜上所述，在多囊腎集合管上皮細(xì)胞中，TRAF3可顯著抑制NF-κB信號通路以及下游凋亡因子表達(dá)。作為NF-κB 信號通路的一個負(fù)調(diào)控因子，TRAF3對于NF-κB引起的囊腔擴(kuò)大具有抑制作用，可能成為多囊腎病中預(yù)防與保護(hù)腎小管結(jié)構(gòu)破壞的潛在靶點(diǎn)。

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(責(zé)任編輯： 盧萍， 余小慧)

Effects of TRAF3 on inhibiting cyst formation induced by NF-κB signaling in kidney

SUN Li-ping1, HU Chao-feng2, ZHANG Xin-zhou1

(1DepartmentofNephrology,ShenzhenPeople’sHospital,SecondClinicalMedicalCollege,JinanUniversity,Shenzhen518020,China;2DepartmentofPathophysiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:xin.zhou@medmail.com.cn)

[KEY WORDS]Tumor necrosis factor receptor associated factor 3; NF-κB; Apoptosis; Cyst formation, kidney

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of tumor necrosis factor (TNF) receptor associated factor 3 (TRAF3) on the signaling pathway of NF-κB and the expression of Bax and Bid in renal collecting duct epithelial cells of polycystic kidney disease (PKD), and to observe the tubulogenesis of TRAF3 transgenics for exploring the protective effect of TRAF3 on the cystogenesis and development of PKD. METHODS: The signaling changes of NF-κB and expression of Bax and Bid in PKD renal collecting duct epithelial cells and TRAF3 transgenic PKD renal collecting duct epithelial cells were determined by the Western blot. The percentage of apoptotic cells was measured by flow cytometry with Annexin V staining. The caspase-3 activity was also measured. The 3D Matrigel culture was performed to examine abnormal tubulomorphogenesisinvitro. RESULTS: The over-expression of TRAF3 significantly inhibited the signaling pathway of NF-κB in PKD renal collecting duct epithelial cells and significantly downregulated the expression of Bax and Bid, and also decreased the cell apoptosis. More branch structures were observed in the TRAF3 transgenic PKD renal collecting duct epithelial cells. CONCLUSION: TRAF3 is a negative regulatory inhibitor for Bax and Bid by regulating the NF-κB signaling and may be a new target for inhibiting the cyst formation in PKD．

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 1077- 07

[收稿日期]2016- 03- 31[修回日期] 2016- 04- 29

*[基金項目]廣東省科技計劃(No. 2014A020212472)；深圳市科技計劃(No. JCYJ20150403101146288)

通訊作者△Tel: 0755-22943522; E-mail: xin.zhou@medmail.com.cn

[中圖分類號]R681.3; R363.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.020