陳小龍，　王立峰，　王　璐，　王正斌

(1南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,河南 南陽(yáng) 473000;2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,河南 鄭州 450052)

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大蒜素對(duì)病毒性心肌炎小鼠的治療作用*

陳小龍1，王立峰1，王璐1，王正斌2△

(1南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,河南 南陽(yáng) 473000;2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,河南 鄭州 450052)

[摘要]目的： 觀(guān)察大蒜素(garlicin, Gal)注射液對(duì)病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)小鼠的作用并探討其可能的作用機(jī)制。方法: 將40只BALB/c健康小鼠隨機(jī)分為4組：正常組(control組)、VMC模型組以及大蒜素低劑量組(Gal-L組)與高劑量組(Gal-H組)；經(jīng)相應(yīng)處理后，HE染色觀(guān)察心肌組織形態(tài)；比色法檢測(cè)血清中乳酸脫氫酶(LDH)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和肌酸激酶(CK)的水平；Western blot檢測(cè)心肌組織中Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP與cleaved-caspase-8的蛋白水平。結(jié)果: HE染色結(jié)果顯示大蒜素能減少病毒性心肌炎小鼠心肌組織的壞死與炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)；與VMC組相比，大蒜素呈濃度依賴(lài)性降低血清中LDH、AST和CK的水平，同時(shí)，降低心肌組織中Bax、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的蛋白表達(dá)水平，升高Bcl-2的蛋白表達(dá)水平，而cleaved-caspase-8的蛋白水平不變。結(jié)論: 大蒜素能有效改善病毒性心肌炎小鼠的心肌損傷，降低血清中LDH、AST和CK的水平，其可能的作用機(jī)制可能與內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]大蒜素； 病毒性心肌炎； 乳酸脫氫酶； 天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶； 肌酸激酶； 內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是一種急性病毒感染引起的急性心肌局限性或彌漫性病變，是兒科常見(jiàn)的心血管疾病之一，部分患者由于經(jīng)久不愈逐步進(jìn)展演變?yōu)閿U(kuò)張型心肌病和心力衰竭[1-2]。VMC的發(fā)病機(jī)制尚不明確，多年研究表明可能與病毒的直接損傷、自身免疫機(jī)制缺陷、細(xì)胞凋亡等有關(guān)。因此，對(duì)病毒性心肌炎發(fā)病機(jī)制的研究是目前較熱的領(lǐng)域，亟需探索發(fā)病機(jī)制為尋找有效的防治方法提供依據(jù)。

大蒜素(garlicin, Gal)是大蒜的主要有效成分，具有抗菌殺蟲(chóng)能力強(qiáng)，抗菌譜廣的特點(diǎn)，此外還具有抗腫瘤、降膽固醇、降血壓及預(yù)防心血管疾病等作用[3]。有研究表明大蒜素能夠有效改變冠心病心絞痛患者心電圖S-T段及T波異常改變。此外，在常規(guī)治療上加入大蒜素治療，能有效改善室上性早搏，推測(cè)是通過(guò)延長(zhǎng)心肌細(xì)胞的有效不應(yīng)期發(fā)揮作用[4-5]。藍(lán)景生等[6]對(duì)大蒜素注射液治療急性病毒性心肌炎60例患者的臨床療效進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)大蒜素注射液治療的患者在臨床癥狀、心電圖異常與心肌酶學(xué)指標(biāo)方面均優(yōu)于病毒唑注射液的療效，提示大蒜素具有減少心肌損傷，改善心肌細(xì)胞功能的效果，但未對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究。我們通過(guò)建立病毒性心肌炎小鼠模型，觀(guān)察大蒜素對(duì)小鼠心肌組織的作用，并探討大蒜素對(duì)病毒性心肌炎產(chǎn)生作用的初步機(jī)制。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4周齡BALB/c健康小鼠，SPF級(jí)，雄性，體重16～18 g，購(gòu)自斯萊克公司。

2藥物與試劑

大蒜素注射液購(gòu)自上海禾豐制藥廠(chǎng)； 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)和肌酸激酶(creatine kinase，CK)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP與cleaved-caspase-8抗體購(gòu)自Santa Cruz；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)試劑純。

3方法

3.1病毒處理嗜心性柯薩奇病毒B3(Coxsackie virus B3，CVB3)Nancy株由河北醫(yī)科大學(xué)病原微生物教研室惠贈(zèng)，擴(kuò)增方法參照[7]進(jìn)行，在HEp-2細(xì)胞傳代，反復(fù)凍融3次，800×g離心20 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。測(cè)得其半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)是10-3/L。

3.2動(dòng)物模型建立與分組將40只4周齡BALB/c健康小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(control組)、VMC模型組以及大蒜素低劑量組(Gal-L組)與高劑量組(Gal-H組)。除control組外，其余組小鼠腹腔注射0.1 mL含100 TCID50 CVB3的病毒懸液；造模24 h后給藥，Gal-L組與Gal-H組分別腹腔注射大蒜素20 mg/kg與40 mg/kg，VMC模型組給予等劑量的生理鹽水。每日給藥 1 次，共7 d。

3.3心肌組織的病理觀(guān)察給藥完成24 h后處死，取小鼠心尖組織，用10%甲醛固定，分別經(jīng)過(guò)梯度乙醇(75%→85%→95%→100%)脫水，用石蠟包埋后切片，蘇木素染色5 min，鹽酸乙醇分化30 s，伊紅復(fù)染，再次用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。

3.4血清學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)給藥完成24 h后，斷頭取血，離心，分離血清，采用比色法檢測(cè)血清中LDH、AST和CK的水平。

3.5Western blot檢測(cè)取各組大鼠心肌組織，提取細(xì)胞總蛋白，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量，并調(diào)整蛋白量。取等量裂解產(chǎn)物，進(jìn)行SDS-PAGE。電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，加入封閉液，室溫封閉3 h，封閉結(jié)束后PBST洗膜5 min，加入 I 抗孵育4 ℃過(guò)夜，PBST洗膜2次；再加入相對(duì)應(yīng) II 抗，室溫孵育2 h，PBST洗膜2次，將膜放入顯色液中顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描灰度值進(jìn)行分析。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1各組小鼠心肌組織的病理變化

如圖1所示，control組大鼠心肌組織排列整齊，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；VMC組大鼠心肌組織廣泛壞死，出現(xiàn)空泡，廣泛炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分心肌細(xì)胞萎縮；Gal-L組大鼠心肌組織部分壞死，崩解，細(xì)胞排列紊亂，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；Gal-H組大鼠心肌組織部分壞死，血管周?chē)俨糠钟醒仔约?xì)胞浸潤(rùn)。

Figure 1.HE staining of the myocardium with different treatments (×400).

圖1各組大鼠心肌組織HE染色

2血清學(xué)指標(biāo)的變化

與control組相比，VMC組中LDH、AST和CK的水平顯著升高(P<0.05)；與VMC組相比，Gal-L組與Gal-H組LDH、AST和CK的水平明顯降低(P<0.05)，其中Gal-H組的下降幅度更大，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The levels of LDH, AST and CK in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsVMC.

圖2各組大鼠血清中LDH、AST和CK的水平

3心肌組織中Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)水平

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與control組相比，VMC組的Bax蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與VMC組相比，Gal-L組與Gal-H組的Bax蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表達(dá)明顯上升(P<0.05)，而Gal-H組的變化幅度最大。Bax/Bcl-2的比值在給予大蒜素處理后顯著低于VMC組(P<0.05),見(jiàn)圖3。

Figure 3.The protein expression of Bcl-2 and Bax. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsVMC.

圖3Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平的變化

4心肌組織中cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP與cleaved-caspase-8蛋白水平的變化

如圖4所示，與control組相比，VMC組的cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05)，cleaved-caspase-8的蛋白表達(dá)無(wú)變化；與VMC組相比，Gal-L組與Gal-H組的cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的蛋白水平明顯下降(P<0.05)，其中Gal-H組的下降幅度最大，cleaved-caspase-8的蛋白表達(dá)無(wú)變化。

討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞衰老死亡形式之一，在許多組織的生理病理過(guò)程中均會(huì)發(fā)生，通常與疾病的產(chǎn)生有關(guān)。近年來(lái)，有許多報(bào)道指出心臟疾病中存在心肌細(xì)胞凋亡，心肌細(xì)胞凋亡的異常在病毒性心肌炎的發(fā)病中起重要作用[8]。國(guó)內(nèi)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜上的表面分子caveolin-3可能通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1蛋白的活性，進(jìn)而影響其下游蛋白Smad3的表達(dá)，從而在病毒性心肌炎的發(fā)病中起作用[9]。張松等[8]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可能通過(guò)穿孔素與顆粒酶作用從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡；此外還可能通過(guò)激活的T淋巴細(xì)胞經(jīng)由Fas/FasL與靶細(xì)胞結(jié)合，從而向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)死亡信號(hào)，使細(xì)胞發(fā)生凋亡[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予大蒜素處理后，病毒性心肌炎小鼠心肌組織的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少，細(xì)胞壞死、破裂減少，且作為病毒性心肌炎診斷重要標(biāo)志的心肌酶(LDH、AST、CK)有明顯下降。在臨床早期，由于心電圖診斷缺乏特異性，臨床上一般采用心肌酶水平的檢測(cè)來(lái)間接衡量心肌細(xì)胞的損害程度。

Figure 4.The protein expression of cleaved-caspase-9, cleaved-caspase-3, cleaved-PARP and cleaved-caspase-8. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsVMC.

圖4Cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP與cleaved-caspase-8蛋白水平的變化

抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax作為細(xì)胞內(nèi)源性凋亡通路的重要調(diào)節(jié)因子，二者的蛋白表達(dá)比例對(duì)線(xiàn)粒體的完整性具有非常重要的作用。當(dāng)Bcl-2蛋白表達(dá)下降而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)上升，會(huì)促使線(xiàn)粒體中的凋亡因子釋放至細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，激活caspase-9，已激活的caspase-9進(jìn)一步激活其下游因子caspase-3，隨后caspase-3的切割底物PARP被切割激活后形成DNA碎片，稱(chēng)為內(nèi)源性線(xiàn)粒體凋亡途徑[11]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，給予大蒜素處理后，Bcl-2蛋白表達(dá)增加而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)降低，提示大蒜素可能具有抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用。另外與VMC組相比，經(jīng)大蒜素處理后，心肌組織中cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的蛋白表達(dá)增加，而cleaved-caspase-8蛋白表達(dá)不變，提示大蒜素是通過(guò)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑(線(xiàn)粒體依賴(lài)途徑)發(fā)生作用，而不是非線(xiàn)粒體依賴(lài)途徑發(fā)生作用。

綜上所述，大蒜素可能具有抑制病毒性心肌炎心肌細(xì)胞凋亡的作用，其可能通過(guò)抑制內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effect of garlicin on viral myocarditis in mice

CHEN Xiao-long1, WANG Li-feng1, WANG Lu1, WANG Zheng-bin2

(1DepartmentofCardiology,FirstAffiliatedHospitalofNanyangMedicalCollege,Nanyang473000,China;2DepartmentofCardiology,FirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China.E-mail:wangxqmed@126.com)

[KEY WORDS]Garlicin; Viral myocarditis; Lactate dehydrogenase; Aspartate aminotransferase; Creatine kinase; Intrinsic apoptosis pathway

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of garlicin on mouse viral myocarditis and to explore the possible mechanisms. METHODS: Forty BALB/c mice were randomly divided into 4 groups: control group, viral myocarditis group, low-dose garlicin group and high-dose garlicin group. The morphological changes of the myocardium were observed with HE staining. The levels of lactate dehydrogenase (LDH), aspartate aminotransferase (AST) and creatine kinase (CK) were measured by colorimetric method. The protein levels of Bcl-2, Bax, cleaved-caspase-9, cleaved-caspase-3, cleaved-PARP and cleaved-caspase-8 in the myocardial tissues were determined by Western blot. RESULTS: The morphological observation with HE staining showed that garlicin inhibited the necrosis of the myocardium and infiltration of inflammatory cells. Compared with viral myocarditis group, garlicin dose-dependently decreased the levels of LDL, AST and CK. Moreover, garlicin treatment decreased the protein levels of Bax, cleaved-caspase-9, cleaved-caspase-3 and cleaved-PARP, accompanied with an increase in Bcl-2 expression. However, garlicin had no effect on the protein level of cleaved-caspase-8. CONCLUSION: Garlicin effectively attenuates the myocardial damage in mice with viral myocarditis through inhibition of intrinsic apoptosis pathway.

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)06- 1027- 04

[收稿日期]2015- 12- 07[修回日期] 2016- 02- 25

*[基金項(xiàng)目]河南省教育廳基礎(chǔ)研究項(xiàng)目課題(No. 142300410063)

通訊作者△Tel： 0371-67966261； E-mail: wangxqmed@126.com

[中圖分類(lèi)號(hào)]R542.2+1； R363.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.011