李娜，李美紅，余貞，周軍，黃雋,2

1 浙江海正藥業(yè)股份有限公司，浙江 臺(tái)州　318000 2 浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程研究所，浙江 杭州　310032

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RNAi沉默lovF基因?qū)崿F(xiàn)土曲霉一步法發(fā)酵生產(chǎn)辛伐他汀

李娜1，李美紅1，余貞1，周軍1，黃雋1,2

1 浙江海正藥業(yè)股份有限公司，浙江 臺(tái)州318000 2 浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程研究所，浙江 杭州310032

李娜, 李美紅, 余貞, 等. RNAi沉默lovF基因?qū)崿F(xiàn)土曲霉一步法發(fā)酵生產(chǎn)辛伐他汀. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(4): 478–486.

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摘要:辛伐他汀是重要的降膽固醇處方藥物。莫那可林J是辛伐他汀合成過(guò)程的關(guān)鍵中間體，也是洛伐他汀生物合成的中間產(chǎn)物。為獲得莫那可林J并通過(guò)一步法發(fā)酵生成辛伐他汀，構(gòu)建了洛伐他汀生物合成關(guān)鍵基因lovF基因的RNAi載體pMHJ137，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化土曲霉F001，篩選整合到染色體的陽(yáng)性菌，并在陽(yáng)性菌株MJ1-24的發(fā)酵過(guò)程中加入了DMB-S-MMP驗(yàn)證其直接合成辛伐他汀的效率。結(jié)果顯示MJ1-24不再產(chǎn)生洛伐他汀，產(chǎn)物中僅有莫那可林J累積。如果在發(fā)酵過(guò)程中加入前體物質(zhì)，可得到產(chǎn)物辛伐他汀。綜上，RNAi技術(shù)能夠有效實(shí)現(xiàn)土曲霉基因沉默。此項(xiàng)技術(shù)推進(jìn)了一步法發(fā)酵生產(chǎn)辛伐他汀的工藝開(kāi)發(fā)。

關(guān)鍵詞:辛伐他汀，洛伐他汀，莫那可林J，RNAi，lovF

Received: July 27, 2015; Accepted: November 2, 2015

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-12-29網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20151229.0949.003.html

辛伐他汀 (Simvastatin, SV) 于1989年在美國(guó)上市，是目前美國(guó)市場(chǎng)上銷量第二的降膽固醇藥物。因?yàn)槠淠赇N售額達(dá)到100億美元左右，也是制藥行業(yè)的“重磅炸彈”[1-2]。辛伐他汀目前主要是以洛伐他汀 (Lovastatin，LV) 化學(xué)全合成得到。合成方法主要包括甲基化法、堿水解法和酶法等[3-4]。其中甲基化法因?yàn)榉磻?yīng)條件苛刻、副反應(yīng)多、產(chǎn)品分離難度大等缺點(diǎn)而很少被采用。而值得一提的是，后兩者都以洛伐他汀的水解物——莫那可林J (Monacolin J，MJ)為原料。

洛伐他汀由絲狀真菌土曲霉Aspergillus terreus發(fā)酵產(chǎn)生，與辛伐他汀的區(qū)別僅在于C8位的側(cè)鏈：前者是2-甲基丁酰，而后者是2,2-二甲基丁酰。洛伐他汀經(jīng)水解脫掉C8位的側(cè)鏈2-甲基丁酰后，得到莫那可林J，后者再與前體2,2-二甲基丁酰 (2,2-Dimethyl Butyryl) 的衍生物通過(guò)化學(xué)法或酶法得到辛伐他汀[5-7]。因此，莫那可林J是間接甲基化法和酶法合成辛伐他汀的關(guān)鍵前體物。

莫那可林J是洛伐他汀的生物合成途徑的一個(gè)中間產(chǎn)物：土曲霉首先通過(guò)PKS途徑合成莫那可林J，再與側(cè)鏈基團(tuán)2-甲基丁酰輔酶A(由lovF基因編號(hào)的二酮合成酶催化合成) 在轉(zhuǎn)脂酶 (由lovD基因編碼) 的催化作用下合成洛伐他汀[10-12]。因此，中斷l(xiāng)ovF和lovD基因均可積累莫那可林J，從而簡(jiǎn)化辛伐他汀的合成工藝。

圖1　洛伐他汀、辛伐他汀和莫那可林J的化學(xué)結(jié)構(gòu)[8-9]Fig. 1　Chemical structures of lovastatin, simvastatin and monacolin J[8-9].

絲狀真菌常用的基因中斷手段有基因敲除和RNA干擾技術(shù) (RNAi) 等。但是土曲霉的同源重組效率低，利用基因敲除的方法有較大的難度[13-14]。本文利用RNAi對(duì)土曲霉的lovF進(jìn)行中斷，獲得積累莫那可林J的基因工程菌，并在該基因工程菌的發(fā)酵過(guò)程中加入前體物質(zhì)，發(fā)酵直接得到辛伐他汀。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒和菌株

土曲霉Aspergillus terreus F001為本公司洛伐他汀產(chǎn)生菌、農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404由本實(shí)驗(yàn)室保藏。克隆載體pBluKS、雙元載體pBGgHg 及pCAMBIA1300由本實(shí)驗(yàn)室保藏；pMD19S購(gòu)自寶生物工程 (大連) 有限公司 (TaKaRa)。

1.1.2抗生素和培養(yǎng)基

大腸桿菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B，培養(yǎng)基中使用的卡那霉素 (Kanamycin，Km) 和羧芐青霉素(Carbenicillin，Cb) 終濃度為100 μg/mL，利福平 (Rifampicin，Rif) 終濃度為50 μg/mL，鏈霉素 (Streptomycin，Sm) 終濃度為30 μg/mL，潮霉素 (Hygromycin B，Hm) 的終濃度為

200 μg/mL。土曲霉生長(zhǎng)培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖)，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為IMAS培養(yǎng)基[15]。

1.1.3主要試劑

核酸內(nèi)切酶，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，rTaq DNA聚合酶，LA Taq DNA聚合酶，DNA連接試劑盒，DNA平末端化試劑盒 (BKL kit)等購(gòu)自TaKaRa公司；DNA膠回收試劑盒和DNA片段回收試劑盒購(gòu)自上海華舜生物公司；引物由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。

1.2轉(zhuǎn)化方法

大腸桿菌轉(zhuǎn)化采用CaCl2法，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化采用電轉(zhuǎn)化法[15]，土曲霉轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法 (ATMT法)[15]。

1.3土曲霉的發(fā)酵及產(chǎn)物檢測(cè)

土曲霉F001在YPD固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)8 d。轉(zhuǎn)接到30 mL種子培養(yǎng)基 (酵母抽提物0.12%，棉籽餅粉2.5%，葡萄糖3%，K2HPO41.5%，調(diào)節(jié)pH值為7.0)，28 ℃、220 r/min培養(yǎng)40–48 h；以10%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基 (乳糖20%，葡萄糖1.2%，棉籽餅粉4%，酵母抽提0.12%，調(diào)節(jié)pH值為7.2)，28 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 d。發(fā)酵液中產(chǎn)物檢測(cè)方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[16]。

1.4菌株穩(wěn)定性研究

將陽(yáng)性菌株MJ1-24在不含抗生素的YPD培養(yǎng)基上連續(xù)傳代5次后，稀釋涂布分離單菌落。隨機(jī)挑取10株單菌落進(jìn)行潮霉素抗性檢測(cè)及發(fā)酵驗(yàn)證。

2　結(jié)果與分析

2.1載體pMHJ137的構(gòu)建

雙元載體pMHJ1由pBGgHg經(jīng)SacⅡ+ PvuⅡ切除帶真核啟動(dòng)子的egfp和hph基因以及LB后，與退火后的包含LB序列 (下劃線部分)的兩條互補(bǔ)寡核苷酸鏈LBS和LBR (表1) 連接得到。

為了形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA，我們選擇lovF基因的exon6作為反向重復(fù)序列，而在這個(gè)反向重復(fù)序列之間以lovF基因的intron6為連接序列。把這樣的序列放在gpd啟動(dòng)子與35S-3'終止子之間 (如圖)。構(gòu)建過(guò)程如下：

首先從土曲霉基因組上擴(kuò)增片段1和片段2：片段1為正向exon6和intron6，以引物EX6SF15和EX6SR16 (表1) 擴(kuò)增；片段2為反向exon6，以引物EX6RR18和EX6RF17 (表1)擴(kuò)增。

再?gòu)碾p元載體pBGgHg擴(kuò)增片段3和片段4：片段3為Pgpd，以引物PgpdF11和PgpdR12(表1) 擴(kuò)增；片段4為35S-3'終止子，以引物35SF19和35SR20 (表1) 擴(kuò)增。

從pCAMBIA1300擴(kuò)增片段5：含35S啟動(dòng)子和35S終止子的潮霉素抗性基因hph，以引物fhphX和fhphY (表1) 擴(kuò)增。

上述5個(gè)片段按3-1-2-4-5的順序通過(guò)克隆載體連接，得到如圖2的片段。以SpeⅠ+ XbaⅠ切下此片段后，連接到pMHJ1的XbaⅠ位點(diǎn)，即為載體pMHJ137。

表1　本研究所用引物序列Table 1　Primers used in this study

2.2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的土曲霉的轉(zhuǎn)化

取3 μL質(zhì)粒pMHJ137，采用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，涂布LB (含Rif，Km，Sm) 平板，28 ℃培養(yǎng)2 d。挑取含質(zhì)粒pMHJ137的農(nóng)桿菌LBA4404，轉(zhuǎn)化土曲霉F001孢子，轉(zhuǎn)化方法參照文獻(xiàn)[15]。

2.3轉(zhuǎn)化子的PCR檢測(cè)

隨機(jī)挑取10個(gè)轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接液體YPD，28 ℃振蕩培養(yǎng)4 d，提取基因組DNA。以基因組DNA為模板，以引物hphcF和hphcR (表1) 進(jìn)行PCR檢驗(yàn)。結(jié)果如圖3所示，和對(duì)照質(zhì)粒pMHJ137一樣，以基因組DNA為模板可以擴(kuò)增出hph基因內(nèi)部740 bp的目的條帶，表明潮霉素抗性基因與發(fā)夾結(jié)構(gòu)已整合到F001的染色體上。

圖2　載體pMHJ137中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)Fig. 2　Hairpin structure in plasmid pMHJ137.

圖3　轉(zhuǎn)化子的PCR檢驗(yàn)Fig. 3　PCR analysis of transformants. M: DNA ladder; 1: plasmid pMHJ137; 2: parent strain F001; 3: positive strain.

2.4轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵驗(yàn)證

對(duì)經(jīng)PCR檢測(cè)后有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果表明，與出發(fā)菌株 (圖4A) 相比，大部分轉(zhuǎn)化子都產(chǎn)生了除洛伐他汀之外的新的物質(zhì) (圖4C)，其出峰時(shí)間在4 min左右，與莫那可林J的出峰時(shí)間吻合。質(zhì)譜分析 (圖5A) 其分子量為338，與莫那可林J相同；二級(jí)質(zhì)譜分析 (圖6A) 其離子碎片峰與辛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品一致。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理，可以斷定該新物質(zhì)為莫那可林J。其中有3個(gè)轉(zhuǎn)化子 (MJ1-8，MJ1-24，MJ2-30)，發(fā)酵樣品中只能檢測(cè)出莫那可林J而沒(méi)有原有的洛伐他汀 (圖4C)。

圖4　轉(zhuǎn)化子MJ1-24與初始菌株F001發(fā)酵液的HPLC圖譜Fig. 4　HPLC analysis of fermentation products from strain MJ1-24 and F001. (A) HPLC analysis of fermentation products from parent strain F001. (B) HPLC analysis of fermentation products from parent strain F001 in which the precursor DMB-S-MMP was added. (C) HPLC analysis of fermentation products from RNAi strain MJ1-24. (D) HPLC analysis of fermentation products from RNAi strain MJ1-24 in which the precursor DMB-S-MMP was added. LV: lovastatin; DSM: DMB-S-MMP; MJ: monacolin J; SV: simvastatin.

圖5　莫那可林J (A) 和辛伐他汀 (B) 的質(zhì)譜圖Fig. 5　A mass spectrometry analysis of monacolin J (A) and simvastatin (B).

圖6　莫那可林J (A) 和辛伐他汀 (B) 的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 6　Secondary spectrometry analysis of monacolin J (A) and simvastatin (B).

2.5一步法發(fā)酵生產(chǎn)辛伐他汀

由于由lovD基因編碼的轉(zhuǎn)脂酶沒(méi)有被干擾，因此理論上在發(fā)酵體系中加入前體2,2-二甲基丁酰 (2,2-Dimethyl Butyryl) 的衍生物可以發(fā)酵產(chǎn)生辛伐他汀。我們?cè)贛J1-24菌株的發(fā)酵過(guò)程中加入DMB-S-MMP，結(jié)果在發(fā)酵產(chǎn)物中檢測(cè)到2個(gè)對(duì)照樣品中沒(méi)有的物質(zhì) (圖4D)。其中HPLC分析保留時(shí)間在7.5 min處的新峰經(jīng)質(zhì)譜分析其分子量為436 (圖5B)，與辛伐他汀的分子量吻合，其HPLC出峰時(shí)間也與辛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品一致 (數(shù)據(jù)未顯示)；二級(jí)質(zhì)譜分析 (圖6B)其離子碎片峰與辛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品一致。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理，可以斷定該新物質(zhì)為辛伐他汀。而出峰時(shí)間在5.0 min的樣品HPLC出峰時(shí)間與前體DMB-S-MMP相同，經(jīng)質(zhì)譜分析其分子量為218，因此可以判斷此物質(zhì)為前體DMB-S-MMP。同時(shí)，我們?cè)诔霭l(fā)菌株F001的發(fā)酵過(guò)程中加入DMB-S-MMP，結(jié)果在發(fā)酵產(chǎn)物中可以檢測(cè)出洛伐他汀產(chǎn)物及前體DMB-S-MMP，并沒(méi)有辛伐他汀的累積 (圖4B)。

2.6菌株穩(wěn)定性

菌株MJ1-24傳代5次后，分離得到的10株單菌落，在潮霉素抗性平板上均生長(zhǎng)正常。以其基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR檢驗(yàn)，可以擴(kuò)增到潮霉素基因740 bp目的條帶；而發(fā)酵結(jié)果也表明與初始菌株相同，樣品中只能檢測(cè)到莫那可林J的累積，而沒(méi)有洛伐他汀產(chǎn)物?？梢?jiàn)該菌株在不含潮霉素的培養(yǎng)條件下，菌株生長(zhǎng)情況沒(méi)有明顯變化，菌株特性能夠穩(wěn)定遺傳。

3　討論

通過(guò)抑制lovF和lovD基因的表達(dá)均可以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物莫那可林J的累積，但兩種方法的原理有所不同：針對(duì)lovF基因的抑制策略是通過(guò)阻斷側(cè)鏈前體的合成來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而針對(duì)lovD基因的抑制策略則是通過(guò)阻斷側(cè)鏈基因的加入完成的。生產(chǎn)莫那可林J的最終目的是合成辛伐他汀。在積累莫那可林J的同時(shí)保留轉(zhuǎn)脂酶的活性從而實(shí)現(xiàn)一步法發(fā)酵生產(chǎn)辛伐他汀，被認(rèn)為是較合理的方案。本研究選擇lovF基因作為靶基因進(jìn)行干擾。

全生物法生產(chǎn)辛伐他汀一直以來(lái)被認(rèn)為是理想的合成方法，印度的Ranganathan[17]敲除了土曲霉的lovF基因，并將不同來(lái)源的PKS結(jié)構(gòu)域組合在一起，重新構(gòu)建可合成2,2-二甲基CoA的二酮合成酶基因，得到的基因工程菌可用于發(fā)酵直接生產(chǎn)辛伐他汀。但是通過(guò)組合生物合成技術(shù)得到的聚酮化合物產(chǎn)量都非常低，難以應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)[18]。

本研究中的lovD基因的活性仍然保留，當(dāng)加入前體物質(zhì)DMB-S-MMP時(shí)，發(fā)酵液中可以檢測(cè)到辛伐他汀。底物的改變導(dǎo)致lovD基因編碼的轉(zhuǎn)脂酶活性下降是發(fā)酵單位很低的原因之一。以往已經(jīng)有大量研究曾對(duì)轉(zhuǎn)脂酶進(jìn)行了改造的嘗試。例如，Gao等利用定向進(jìn)化技術(shù)，使改造后的lovD以2,2-二甲基丁酰類似物為底物的活性提高11倍[19]；Jiménez-Osés等將lovD基因經(jīng)過(guò)改造后，其合成辛伐他汀的活性提高了1 000倍[20]。如果將這些改造后的轉(zhuǎn)脂酶基因重新導(dǎo)入到土曲霉中以替換原有的lovD基因，或許有助于進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵法一步生產(chǎn)辛伐他汀的工藝。

RNAi技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于絲狀真菌的基因功能研究和工業(yè)菌株的基因改造[21-24]。龔桂花[25]等利用RNAi技術(shù)將頭孢菌素C工業(yè)生產(chǎn)菌株中cefG基因的轉(zhuǎn)錄水平降低了80%以上，而頭孢菌素C發(fā)酵水平降低了34.6%。李曉瑾等[26]通過(guò)RNAi技術(shù)特異性沉默煙曲霉色素形成相關(guān)基因arp1，產(chǎn)生與原始菌株不同的灰色菌株。Liu等[27]在新型隱球菌中應(yīng)用RNAi技術(shù)降低了CAP59及ADE2基因的轉(zhuǎn)錄水平，使菌株產(chǎn)生了不同的表型。由此可見(jiàn)，RNAi是絲狀真菌基因敲除的一種有效的嘗試。目前關(guān)于土曲霉的基因中斷方法的報(bào)道比較少，本文首次將RNAi技術(shù)應(yīng)用于改造土曲霉工業(yè)菌株，通過(guò)沉默土曲霉中l(wèi)ovF基因，去除了洛伐他汀產(chǎn)物，成功地實(shí)現(xiàn)了莫那可林J的積累。這種嘗試不但進(jìn)一步改進(jìn)了辛伐他汀的生產(chǎn)工藝，而且為實(shí)現(xiàn)清潔的工業(yè)化生產(chǎn)打下了良好的基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編郝麗芳)

農(nóng)業(yè)生物技術(shù)

One-step fermentation for producing simvastatin via RNAi silencing of lovF gene in Aspergillus terreus

Na Li1, Meihong Li1, Zhen Yu1, Jun Zhou1, and Jun Huang1,2
1 Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co. Ltd., Taizhou 318000, Zhejiang, China 2 Institute of Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032, Zhejiang, China

Abstract:Simvastatin is one of the important prescription drugs for hypercholesterolemia. Monacolin J is a keyintermediate during simvastatin synthesis, and also an intermediate of lovastatin biosynthesis. In this work, we construct a monacolin J producing strain via RNA interference to achieve one-step fermentation to obtain simvastatin. The lovF gene silencing plasmid pMHJ137 was constructed and transformed into Aspergillus terreus by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation method. Precursor DMB-S-MMP was supplied during the fermentation to screen positive strains of transformants; which also further confirmed the simvastatin producing capability of MJ1-24 by one-step fermentation. Strain MJ1-24 produced monacolin J rather than lovastatin, and the feeding of DMB-S-MMP resulted in the generation of simvastatin. This study suggested that RNAi can efficiently silence the lovF gene of A. terreus and promote the simvastatin production by one-step fermentation.

Keywords:simvastatin, lovastatin, monocolin J, RNAi, lovF

DOI:10.13345/j.cjb.150344

Corresponding authors: Jun Huang. Tel: +86-576-88820587; E-mail: Huangj@hisunpharm.com