吳文韜，鞠美庭，劉金鵬，劉博群

1 南開大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津　300071 2 賓夕法尼亞州立大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物工程系 賓夕法尼亞州學(xué)院，16802

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青貯對柳枝稷制取燃料乙醇轉(zhuǎn)化過程的影響

吳文韜1,2，鞠美庭1，劉金鵬1，劉博群1

1 南開大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津300071 2 賓夕法尼亞州立大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物工程系 賓夕法尼亞州學(xué)院，16802

吳文韜, 鞠美庭, 劉金鵬, 等. 青貯對柳枝稷制取燃料乙醇轉(zhuǎn)化過程的影響. 生物工程學(xué)報, 2016, 32(4): 457–467.

Wu WT, Ju MT, Liu JP, et al. Effect of ensilage on bioconversion of switchgrass to ethanol based on liquid hot water pretreatment. Chin J Biotech, 2016, 32(4): 457–467.

摘要:青貯是一種傳統(tǒng)的生物質(zhì)原料保存方法，廣泛應(yīng)用于纖維素乙醇煉制領(lǐng)域尚需要考察其對原料品質(zhì)和下游乙醇轉(zhuǎn)化過程的影響。文中以秋季 (初、中和末) 收割的柳枝稷為原料，通過青貯、高溫水熱 (LHW) 預(yù)處理、纖維素酶水解和同步糖化與發(fā)酵 (SSF) 實驗對上述問題予以回答。結(jié)果顯示，秋季初收割的柳枝稷以不同濕度青貯后pH均小于4.0，干重?fù)p失小于2%，各主要成分與青貯前相比無明顯變化；LHW預(yù)處理中青貯樣品半纖維素水解率普遍高于未貯存樣品，但青貯同樣使原料獲得了更高的發(fā)酵抑制物產(chǎn)生水平；青貯柳枝稷葡萄糖、木糖和半乳糖產(chǎn)量 (預(yù)處理+酶水解) 高于未貯存柳枝稷；經(jīng)過168 h的SSF，青貯樣品乙醇濃度為12.1 g/L，未貯存的秋季初、秋季中和秋季末柳枝稷為底物的濃度分別為10.3 g/L、9.7 g/L和10.6 g/L。綜上，青貯有助于提高柳枝稷LHW預(yù)處理效率、酶水解率和乙醇產(chǎn)量。

關(guān)鍵詞:柳枝稷，青貯，高溫水熱預(yù)處理，纖維素乙醇，同步糖化與發(fā)酵

Received: July 21, 2015; Accepted: September 6, 2015

Supported by: International Cooperation Projects in the Science & Technology Pillar Program of Tianjin, China (No. 13RCGFSF14300).

燃料乙醇是一種清潔的可再生能源，可直接作為液體燃料或與汽油混合后利用。近年來，美國、巴西和中國等汽車大國愈發(fā)重視生物乙醇技術(shù)的研發(fā)。國際能源署數(shù)據(jù)顯示，全球能源總消耗約9%為生物質(zhì)能源，生物柴油和乙醇等燃料又占其中約6%，并呈快速增長趨勢[1]。2009年《美國清潔能源安全法案》提出，到2030年，纖維素乙醇等高級生物燃料供應(yīng)至少達(dá)到600億加侖；我國《可再生能源中長期發(fā)展規(guī)劃》指出，到2020年，生物燃料乙醇年目標(biāo)利用量超過1 000萬t。

農(nóng)業(yè)固體廢棄物和能源作物是制取第二代燃料乙醇的主要原料。其中基于秸稈和蔗渣等農(nóng)業(yè)廢棄物的研究已有很多[2-3]；近年，能源作物在歐美等國成為研究熱點，而我國對該類作物種植、收割、運輸、貯存和轉(zhuǎn)化過程的研究尚不充分。柳枝稷 Panicum virgatum L. 是最具前景的能源作物之一，是一種原生于北美地區(qū)的多年生C4草本植物[4]。我國對柳枝稷引進(jìn)和試種開展了大量研究[5]，為其在國內(nèi)大規(guī)模種植和商業(yè)化奠定了一定基礎(chǔ)。

柳枝稷用于工業(yè)生產(chǎn)將涉及貯存問題。良好的貯存不僅應(yīng)保證原料品質(zhì)，而且可作為預(yù)處理前的生化處理，提高生物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率。傳統(tǒng)生物質(zhì)原料保存方法由農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)生產(chǎn)發(fā)展而來，包括干貯存法和濕貯存法。對于柳枝稷，干貯存需在收割后晾曬至含水率低于15%，然后打捆置于室外或室內(nèi)保存[6]。室外貯存易受氣候條件影響，保存不當(dāng)會造成原料大量損失，貯存過程亦存在火災(zāi)隱患；濕貯存含水率一般大于30%，畜牧業(yè)生產(chǎn)中含水率通常保持在50%?60%。然而，如此高含水率使大規(guī)模貯存成本提高，不利于工業(yè)生產(chǎn)。以往報道顯示，對玉米秸稈以約30%含水率青貯時，厭氧微生物亦能夠產(chǎn)生足夠乳酸和乙酸使原料pH降低，實現(xiàn)保存質(zhì)量[7]。該結(jié)果為柳枝稷濕貯存提供了參考。以典型的北方地區(qū)為例，柳枝稷產(chǎn)量在9月下旬時較高，此時含水率往往大于30%，收割后進(jìn)行青貯處理可能達(dá)到理想的貯存效果。

本文以柳枝稷為原料，青貯后使用LHW預(yù)處理、纖維素酶水解和SSF方法，比較青貯和未青貯原料在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的特征，考察青貯對該過程影響的機(jī)理，為柳枝稷資源的利用提供參考。

1　材料與方法

1.1原料收集與青貯

柳枝稷收割于賓夕法尼亞州立大學(xué)植物試驗田 (PSU Arboretum)，時間為2014年9月16 日 (秋季初)、10月24日 (秋季中) 和11月18 日 (秋季末)，下文簡稱為EFS、MFS和LFS (Early，mid and late fall harvested switchgrass)。青貯實驗以EFS為原料，MFS和LFS室溫存放至使用。青貯前，原料于通風(fēng)處使含水率降至約30%，使用Munson切割機(jī) (SCC-10-MS，Monson，Utica，NY) 切割至1?2 cm。添加超純水調(diào)整原料濕度為30%?70%，共5組，每組3個平行。混勻后使用聚乙烯袋雙層真空包裝(Food Saver Model V3040 Bag Sealer)，置于37 ℃恒溫箱中保存21 d。

1.2高溫水熱預(yù)處理

所有預(yù)處理原料均干燥后使用Wiley粉碎機(jī) (Model 4，Thomas Scientific) 粉碎，過2 mm篩網(wǎng)，其中青貯樣品于40 ℃下烘干。LHW預(yù)處理采用Dionex ASE 350溶劑萃取系統(tǒng) (ASE 350，Thermo Fisher Inc.，Sunnyvale，CA)。反應(yīng)器為66 mL兩端帶有旋蓋的鋯材質(zhì)管狀容器，主體長10.0 cm，外徑3.0 cm，內(nèi)徑2.9 cm。旋蓋內(nèi)裝有過濾篩板和墊圈，使用時下端旋蓋內(nèi)放置2層直徑3.0 cm玻璃纖維濾紙以達(dá)到更好的固液分離效果。原料使用量為 (15.0±1.0)% (W/W，原料干重/總重)。預(yù)處理溫度190 ℃，保留時間10 min，加熱至目標(biāo)溫度的時間為9 min。結(jié)束后共約200 mL去離子水沖洗固體殘余物，使溫度迅速降低至100 ℃以下，最后氮氣吹掃180 s分離固液相。預(yù)處理液收集至儀器底部轉(zhuǎn)盤的玻璃瓶中用于糖和副產(chǎn)物分析。固體殘余物用于成分分析、纖維素酶水解及SSF。

1.3纖維素酶水解

纖維素酶水解主要參照美國國家可再生能源實驗室 (NREL) 標(biāo)準(zhǔn)分析方法LAP 9并稍作如下修改[8]。為防止微生物生長，加入40 μL 四環(huán)素和100 μL 放線菌酮。使用兩種酶Cellic Ctec 2 (Novozymes，F(xiàn)ranklinton，NC，USA) 和Novozyme 188 (Novozymes，Bagsvaerd，Denmark)對固體殘余物進(jìn)行水解處理，添加量分別為30 FPU/g纖維素和64 CBU/g纖維素。酶水解反應(yīng)在50 ℃下進(jìn)行168 h，水解液4 000 r/min下離心15 min，上清液用于糖成分分析。

1.4同步糖化與發(fā)酵

SSF主要參照NREL LAP 10并稍作修改[9]。使用–20 ℃保存的預(yù)處理固體殘余物作底物，底物纖維素投加量為30 g/L。添加15 FPU/g纖維素的Cellic Ctec 2和64 CBU/g纖維素的Novozyme 188。菌種為釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae ATCC 24859。所有樣品于30 ℃、130 r/min發(fā)酵168 h。第0、6、12、24、72、120和168 h取樣，其中第72、120和168 h于厭氧箱中取樣。發(fā)酵液4 000 r/min離心15 min，上清液過0.22 μm Nylon濾膜用于乙醇測定。測定儀器為YSI 2700 SELECTTM生化分析儀(Xylem Inc.，Yellow Springs，OH，USA)，校準(zhǔn)液為1.0 g/L乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液 (YSI 2792 Ethanol Standard Kit)。

1.5成分分析

柳枝稷原料、青貯樣品和預(yù)處理固體殘余物的成分分析參照NREL LAP 1?6[10-11]。其中青貯樣品和預(yù)處理固體殘余物分析前在通風(fēng)烘箱中40 ℃下烘干。

將部分青貯樣品置于干燥箱中60 ℃下烘干24 h用于干重 (DM) 測定。DM損失率按照每袋柳枝稷青貯前后DM的差除以青貯前DM計算。青貯樣品按照重量比1∶10 (原料/水) 混合，取濾液測定pH和有機(jī)酸，有機(jī)酸的測定包括羥基二丁酸、丁二酸、乳酸、甲酸、乙酸、異丁酸、丙酸、丁酸、酒石酸和戊酸。為了測定柳枝稷原樣和干燥后青貯樣品的有機(jī)酸成分，使用ASE 350于40 ℃下對原料進(jìn)行萃取，取萃取液進(jìn)行測定。

糖、糠醛、羥甲基糠醛 (HMF)、有機(jī)酸的分析參照NREL LAP 7[12]。為測定預(yù)處理水解液中低聚糖，將10 mL水解液移至15 mL血清瓶中，加入348 μL 72% H2SO4，121 ℃處理1 h，測定酸水解液中某一種糖的總含量 (如葡萄糖)，該種糖的低聚糖含量按照總含量減去預(yù)處理水解液中單糖含量計算。所有糖、醛和酸由Dionex ICS-3000離子交換色譜儀 (ICE, Thermo Fisher Scientific Inc., Sunnyvale, CA) 測定。

1.6離子色譜條件

所有樣品測定前過0.22 μm PTFE或Nylon濾膜并稀釋。糖的測定中，保護(hù)柱和分析柱為3 mm×30 mm和3 mm×150 mm CarboPacTMPA20 (Dionex，Sunnyvale)，工作溫度30 ℃，流動相為2 mmol/L NaOH，流速0.5 mL/min，檢測器為金電極檢測器 (Dionex，Sunnyvale，CA)。醛和酸的測定中，保護(hù)柱和分析柱為4 mm×50 mm和4 mm×250 mm IonPacTMICE-AS1離子交換柱，工作溫度30 ℃，流動相為100 mmol/L甲基磺酸，流速0.16 mL/min，檢測器為二極管陣列檢測器 (Dionex UVD 340U)，檢測波長210 nm。

1.7計算

酶水解纖維素轉(zhuǎn)化率和SSF乙醇產(chǎn)量的計算參照NREL LAP 9和LAP 10[8-9]。LHW預(yù)處理 (S1) 和酶水解 (S2) 中糖的產(chǎn)量按照下列公式計算[13]：

其中GO和XO為低聚葡萄糖和低聚木糖；0.9為葡萄糖至葡聚糖轉(zhuǎn)換系數(shù)；1.9為蔗糖與葡萄糖分子質(zhì)量比；0.88為木糖至木聚糖轉(zhuǎn)換系數(shù)[14]；f為處理前原料。半乳糖產(chǎn)量計算參照葡萄糖，但不包含蔗糖；阿拉伯糖產(chǎn)量計算參照木糖。

2　結(jié)果與討論

2.1青貯對柳枝稷品質(zhì)的影響

表1列出了秋季初、秋季中和秋季末柳枝稷 (EFS、MFS和LFS) 及以秋季初柳枝稷為原料青貯21 d樣品的主要成分。通常，本研究涉及的高地生態(tài)型柳枝稷自秋季初開始枯萎衰老，水分含量逐漸減少，纖維化程度提高，因此隨著收割時間的延后纖維素、木聚糖、木質(zhì)素和乙?；吭黾?，而水提取物和蔗糖含量降低。其中，EFS可溶性糖成分由大于5%降低至MFS和LFS的1%左右。因此10月中旬后柳枝稷可能更適于干貯存，這也正是本文只對EFS進(jìn)行青貯的原因。加入MFS和LFS主要是比較EFS青貯原料與較晚收割柳枝稷之間、不同收割時間柳枝稷之間乙醇轉(zhuǎn)化能力，并有助于探討產(chǎn)生差異的機(jī)理。由表1，青貯對結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量影響較小，其中纖維素含量在青貯前后幾乎一致；木聚糖、半乳聚糖和乙?；兴陆?，但不明顯；阿拉伯聚糖和木質(zhì)素含量普遍略有升高。青貯過程中微生物活動消耗了原料中部分可溶性糖，通過發(fā)酵產(chǎn)生乳酸和乙酸。此類有機(jī)酸使親水性相對較強(qiáng)的半纖維素和其中乙酰基少量水解，因此木聚糖和乙?；肯陆?。阿拉伯聚糖和木質(zhì)素含量的升高則可能是水提取物等其他成分降低的結(jié)果。

表1　青貯及不同收割時間柳枝稷成分Table 1　Composition of silage and switchgrass harvested on different dates

圖1顯示了不同含水率青貯柳枝稷有機(jī)酸含量、DM損失率和pH值。青貯前EFS pH為6.7，青貯后各含水率組pH均低于4.0。其中，30%含水率組最高，約為3.9；60%和70%組以及40%和50%組pH分別為3.7和3.8左右。有機(jī)酸含量是決定青貯樣品pH值的重要因素，尤其是乳酸含量。乳酸是否為主要發(fā)酵產(chǎn)物是能否保證貯存質(zhì)量的關(guān)鍵因素。經(jīng)測定，青貯后柳枝稷有機(jī)酸主要由乳酸、乙酸、異丁酸和丁酸組成，其中乳酸在各含水率組中含量均最高，其次為乙酸 (未列出丁酸和異丁酸)。由圖1，所有未干燥和低溫通風(fēng)干燥的青貯樣品 (F和D) 有機(jī)酸含量隨含水率升高先增加再減少，60%組含量最高為6.2% (F) 和5.4% (D)。低溫通風(fēng)干燥后，青貯樣品有機(jī)酸有一定損失 (圖1)。其中乳酸損失較小，40%組乳酸含量由3.9% (F)下降至3.6% (D)；乙酸含量受干燥影響較大，由0.8% (F) 下降至 0.3% (D) (表1)。并且，乙酸揮發(fā)量隨青貯樣品含水率升高而增加。乙酸作為乙醇發(fā)酵的抑制物之一[15]，干燥過程大量揮發(fā)有利于后續(xù)乙醇發(fā)酵。各含水率組柳枝稷貯存21 d后DM損失略有不同 (圖1)。其中50%?70%組DM損失率較大，為1.5%左右；30% 和40%組均小于1%。含水率較高時，青貯樣品中丁酸和異丁酸含量隨之增加 (數(shù)據(jù)未列出)，表明梭狀芽孢桿菌活躍，導(dǎo)致原料異型發(fā)酵，因此DM損失增加[16]，總有機(jī)酸含量也因此產(chǎn)生變化；含水率過低時，原料中微生物活動總體受到限制，發(fā)酵水平較低，因此總產(chǎn)酸水平較低，DM損失率低 (不足1%)。綜合pH值、有機(jī)酸含量和DM損失情況，本文采用40%含水率青貯柳枝稷進(jìn)行后續(xù)LWH預(yù)處理和SSF，考察青貯對柳枝稷生物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的影響。

圖1　青貯柳枝稷pH值、有機(jī)酸含量及干物質(zhì)損失率Fig. 1　The pH values, organic acids and DM loss of switchgrass silage.

2.2青貯對高溫水熱預(yù)處理效率的影響

青貯和不同時間收割的柳枝稷經(jīng)過190 ℃10 min LHW處理后，結(jié)構(gòu)性碳水化合物和木質(zhì)素發(fā)生了不同程度的水解 (表2)。100 g樣品預(yù)處理后青貯樣品和EFS固體殘余物不足65 g；MFS和LFS大于70 g。由于10月和11月收割的柳枝稷具有更致密的纖維結(jié)構(gòu)、更高木質(zhì)素和更低的水溶物含量，因此在該處理條件下溶解率相對較低。青貯樣品處理前含纖維素33.4 g(表1)，預(yù)處理后固體殘余物中剩余30.9 g，水解率為7.5%；EFS、MFS和LFS纖維素水解率分別為10.5%、2.0%和3.6%。較晚收割的柳枝稷纖維素水解率明顯低于青貯樣品和EFS，主要原因可能是隨著柳枝稷衰老枯萎，細(xì)胞壁纖維素聚合度和結(jié)晶度增加，無定型區(qū)纖維含量減少，使該處理條件下可被水解的部分減少。青貯對LHW預(yù)處理中纖維素水解的影響不明顯，而對半纖維素各組分水解有明顯提升作用。

表2　預(yù)處理固體殘余物成分 (g/100 g預(yù)處理前樣品)Table 2　Composition of pretreated solids (g/100 g un-pretreated biomass)

去除半纖維素是LHW預(yù)處理的主要目的之一。半纖維素主要由木糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，其中木聚糖含量最高。在190 ℃下，100 g青貯樣品中12.2 g木聚糖水解，水解率為55.2% (表1和2)；MFS和LFS水解率分別為49.2%和53.3%；EFS最低為45.8%。對于半乳聚糖和阿拉伯聚糖，青貯樣品水解率亦大于EFS：二者半乳聚糖水解率分別為71.3%和64.2%，阿拉伯聚糖分別為71.4%和52.7%。一方面，青貯樣品有機(jī)酸含量較高，使預(yù)處理體系pH降低，有助于聚糖水解；另一方面，青貯使半纖維素結(jié)構(gòu)變得疏松，并且由于微生物的活動，纖維表面更加粗糙[17]，因此水解率增加。

預(yù)處理對各樣品中木質(zhì)素成分去除效果均不明顯。青貯樣品木質(zhì)素由處理前的16.6 g減少至15.4 g，去除率為7.2%；EFS由16.2 g減少至15.6 g，去除率為3.7%，略小于青貯樣品；MFS和LFS分別為10.7%和14.2%。以往研究顯示，200 ℃時，約20%木質(zhì)素溶解于水中[14]，說明即使在相對激烈的條件下，LHW對木質(zhì)素的去除率依舊不高。在預(yù)處理過程中，木質(zhì)素降解為酚類和其他芳香族化合物，在一定程度上破壞了木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)，使纖維素更容易酶解[18]。木質(zhì)素為生物質(zhì)抗降解屏障的重要組成部分，通過兩方面影響木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)的水解進(jìn)程：一是含量；二是分子量大小以及聚合形式[19]。以往研究顯示，青貯玉米秸稈預(yù)處理后木質(zhì)素中愈創(chuàng)木基丙烷結(jié)構(gòu)單體有明顯斷裂跡象；未青貯或干貯存的秸稈這種斷裂現(xiàn)象不明顯，且固體殘余物中的木質(zhì)素與纖維素和半纖維素的結(jié)合程度高于青貯秸稈[17]。本文中，各樣品木質(zhì)素去除率雖然普遍不高，且青貯樣品僅大于EFS，但可以肯定，LHW預(yù)處理對青貯樣品木質(zhì)素的破壞不僅表現(xiàn)在量的大小，而且更多表現(xiàn)為對整體纖維結(jié)構(gòu)的影響。

圖2　預(yù)處理過程中HMF、糠醛和乙酸的產(chǎn)量Fig. 2　HMF, furfural and acetic acids released during pretreatment.

LHW預(yù)處理過程中，部分結(jié)構(gòu)性碳水化合物水解為低聚糖和單糖，其中一部分繼而降解為醛和酸。本文中糖的主要副產(chǎn)物為HMF、糠醛和乙酸 (圖2)，主要是戊糖、己糖和半纖維素中乙?；慕到猱a(chǎn)物[18]。由圖2，青貯樣品、MFS和LFS的HMF產(chǎn)量均遠(yuǎn)低于0.1 g/100 g，而EFS約0.2 g/100 g。主要原因是EFS的非結(jié)構(gòu)性葡萄糖含量明顯高于其他樣品 (表1)，這些非結(jié)構(gòu)性糖在一定的處理溫度和時間下能夠直接水解為HMF。青貯柳枝稷糠醛產(chǎn)量明顯高于EFS (分別為0.4 g/100 g和0.2 g/100 g)。預(yù)處理過程中，青貯樣品半纖維素水解率高于其他樣品，因此水解液中含有更多的木糖和阿拉伯糖，使糠醛產(chǎn)生水平升高。本文主要為了比較青貯和未青貯柳枝稷生物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的不同，因此選擇了較為溫和的預(yù)處理條件，盡可能保留纖維素成分用于SSF；若進(jìn)一步升高處理溫度并延長時間，青貯樣品糠醛產(chǎn)量則可能顯著提高，并且糠醛將繼續(xù)降解為乙酰丙酸和甲酸。而在實際生產(chǎn)中，甲酸對酵母菌的抑制作用遠(yuǎn)高于乙酸和丙酸[20]。本研究中所有樣品甲酸產(chǎn)量均低于0.1 g/100 g，并且未青貯樣品低于青貯樣品 (未在圖表中顯示)。值得注意的是，水解液中青貯樣品甲酸可能更多來自于青貯過程而非糠醛降解。

由圖2，青貯樣品和EFS乙酸產(chǎn)量明顯高于MFS和LFS，并且EFS略高于青貯樣品。Darku在比較青貯前后玉米秸稈預(yù)處理水解液乙酸含量時有類似的結(jié)果[7]。主要原因可能是作為預(yù)處理底物，青貯柳枝稷和EFS乙酸成分高于MFS和LFS；而EFS乙酸產(chǎn)量相對較高可能是青貯過程原料乙?；繙p少的結(jié)果。

2.3青貯對糖產(chǎn)量的影響

圖3為各樣品在LHW預(yù)處理和纖維素酶水解過程中糖的產(chǎn)量。S1 (LHW預(yù)處理) 階段，青貯和未青貯柳枝稷水解液中葡萄糖、木糖、半乳糖和阿拉伯糖主要以低聚糖形式存在。除葡萄糖，青貯樣品各糖產(chǎn)量在S1階段均高于EFS。由圖3A，S1階段EFS葡萄糖產(chǎn)量為20.7%，高于青貯樣品 (10.8%)、MFS和LFS (5.7%和4.9%)。這是由于EFS非結(jié)構(gòu)性葡萄糖含量最高(表1)。并且，由圖3A和成分分析可知，這些非結(jié)構(gòu)性葡萄糖主要以蔗糖和低聚糖形式存在。對于所有樣品，葡萄糖主要在S2階段通過酶水解纖維素獲得。其中，青貯柳枝稷和LFS 在S2階段的葡萄糖產(chǎn)量約68%，高于EFS和MFS (分別為55.7%和64.6%)。由章節(jié)2.2，EFS 在S1階段纖維素去除率僅高于青貯樣品約3%，而在S2階段葡萄糖產(chǎn)量明顯低于青貯樣品。S2階段，青貯樣品具有比EFS更高的纖維素轉(zhuǎn)化率 (分別是74.3%和66.6%，未在圖表中顯示)，說明青貯處理提高了底物纖維素的酶水解效率，這也正是造成上述產(chǎn)量差異的直接原因。對于葡萄糖總產(chǎn)量，青貯樣品為78.9%，同樣高于EFS (76.4%) 和LFS (71.9%)；MFS最低為70.3%。

S1和S2階段青貯柳枝稷木糖和半乳糖總產(chǎn)量高于未青貯柳枝稷，阿拉伯糖總產(chǎn)量略低于LFS (圖3B、C和D)。S1階段青貯樣品的木糖產(chǎn)量最高，為53.6%，EFS最低為45.5%，MFS和LFS分別為46.8%和51.8%。在190 ℃預(yù)處理10 min的條件下，各樣品水解液中的木糖均主要以低聚糖形式存在，這在一定程度上減小了木糖單糖降解為糠醛的風(fēng)險，保證了青貯樣品木糖產(chǎn)量。若增加預(yù)處理溫度或延長處理時間，青貯樣品S1階段木糖損失可能更高。由于Cellic Ctec 2包含少量半纖維素酶，因此S2階段底物中部分木聚糖、半乳聚糖和阿拉伯聚糖亦得到水解，但青貯與未青貯之間無明顯差異，各樣品木糖、半乳糖和阿拉伯糖S2階段產(chǎn)量分別低于35%、14%和10%。再由圖3B，青貯樣品木糖總產(chǎn)量最高，為86.6%；EFS、MFS和LFS分別為80.3%、79.7%和84.9%。半乳糖在酸性條件下最易自半纖維素中解聚。在弱酸條件下，青貯樣品超過90%的半乳糖回收于預(yù)處理階段 (圖3C)；MFS和LFS分別為83.8%和89.7%；EFS最低為71.6%。青貯樣品半乳糖總產(chǎn)量明顯高于EFS，但由于各樣品中半乳聚糖含量僅約1%，因此其產(chǎn)量的差異可能不會對SSF乙醇產(chǎn)量造成影響。對于阿拉伯糖，青貯與未青貯樣品在S1階段產(chǎn)量均低于80%，EFS最低為62.2%；青貯樣品S1和S2階段總產(chǎn)量為79.2%，高于EFS (69.8%)，但低于LFS (83.5%)。但是，由于ATCC 24859主要利用葡萄糖，木糖和阿拉伯糖利用能力有限，因此木糖和阿拉伯糖產(chǎn)量更主要作為指示自身水解效率的指標(biāo)。

圖3　預(yù)處理和纖維素酶水解過程糖的產(chǎn)量Fig. 3　Sugar yield during LHW pretreatment and enzymatic hydrolysis. S1 and S2 represent LHW pretreatment and enzymatic hydrolysis; Glu: glucose; GO: gluco-oligomers; Xyl: xylose; XO: xylo-oligomers; Gal: galactose; GaO: galacto-oligomers; Ara: arabinose; AO: arabino-oligomers.

2.4青貯對乙醇產(chǎn)量的影響

經(jīng)過168 h SSF，青貯樣品、EFS、MFS和LFS乙醇濃度分別為12.1、10.3、9.7和10.6 g/L(圖4)。24 h時，所有樣品乙醇濃度均未達(dá)到10.0 g/L，MFS最小為8.5 g/L。青貯柳枝稷乙醇濃度于24?72 h快速增加，72 h時達(dá)到11.0 g/L，其他樣品均小于10.0 g/L。120 h后青貯樣品中乙醇增加趨勢不明顯，未青貯柳枝稷略微增加。按照NREL LAP 10乙醇產(chǎn)量計算，24 h時，各樣品底物乙醇理論產(chǎn)量均低于60%；72 h時青貯樣品和LFS產(chǎn)量達(dá)到60%；120 h時青貯樣品達(dá)到70%以上，EFS和MFS則低于60%；SSF結(jié)束時，青貯樣品產(chǎn)量為73.0%，其次為LFS (66.9%)，EFS為63.1%。由章節(jié)2.3，各樣品乙醇理論產(chǎn)量均低于S2階段纖維素轉(zhuǎn)化率 (分別為74.3%、66.6%、67.0%和71.7%)，這是由于一方面SSF初始階段酵母菌好氧呼吸迅速增殖消耗了部分葡萄糖；另一方面，為考察各樣品的最大糖產(chǎn)量，章節(jié)1.3中酶水解步驟每g纖維素投加Cellic Ctec 2的量為30 FPU，而SSF中投加量為15 FPU，因此SSF纖維素酶水解效率相比較低。SSF僅使用預(yù)處理后固體殘余物作為底物，沒有將LHW水解液與之混合發(fā)酵，這可能會造成乙醇總產(chǎn)量的降低，尤其是對于青貯前EFS原樣，因為EFS S1階段水解液中包含約20%非結(jié)構(gòu)性葡萄糖。但是，上述情況同樣需要考慮預(yù)處理水解液中發(fā)酵抑制物對乙醇產(chǎn)量的影響，因此不能僅按照S1階段葡萄糖產(chǎn)量直接轉(zhuǎn)換為理論乙醇產(chǎn)量。此部分還需進(jìn)一步實驗加以印證。

圖4　同步糖化與發(fā)酵液中乙醇的濃度Fig. 4　Ethanol concentration in SSF liquids.

3　結(jié)論

青貯秋季初收割的柳枝稷能夠使其獲得良好的貯存效果。青貯后柳枝稷非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量降低，結(jié)構(gòu)性碳水化合物和木質(zhì)素含量無明顯變化。在190 ℃ 預(yù)處理LHW 10 min條件下，青貯處理使柳枝稷獲得了更高的半纖維素去除率，但乙醇發(fā)酵抑制產(chǎn)物的產(chǎn)量也普遍高于未青貯樣品。并且，較晚收割的柳枝稷半纖維素去除率高于較早收割的柳枝稷。未青貯柳枝稷在預(yù)處理和纖維素酶水解中糖的產(chǎn)量普遍低于青貯處理后的柳枝稷。在最終的SSF中，青貯柳枝稷獲得了更高的乙醇產(chǎn)量。

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(本文責(zé)編陳宏宇)

Effect of ensilage on bioconversion of switchgrass to ethanol based on liquid hot water pretreatment

Wentao Wu1,2, Meiting Ju1, Jinpeng Liu1, and Boqun Liu1
1 College of Environmental Science and Engineering, Nankai University, Tianjin 300071, China 2 Department of Agricultural and Biological Engineering, Pennsylvania State University, University Park 16802, United States

Abstract:Ensilage is a traditional way of preserving fresh biomass. However, in order to apply ensilage to the ethanolbiorefinery, two parameters need to be evaluated: quantity and quality changes of the biomass; and its effects on bioconversion process. To study these two aspects, switchgrass harvested on three different time points (Early, mid and late fall) were used as feedstock. The early fall harvested biomass was ensiled at 5 moisture levels ranging from 30% to 70%. Silage of 40% moisture and 3 other raw switchgrass were pretreated with liquid hot water, followed by enzymatic hydrolysis as well as simultaneous saccharification and fermentation. After 21 days storage pH values of all silages decreased below 4.0 and the dry matter losses were less than 2.0%, and structural sugars contents did not change dramatically. Liquid hot water caused more hemicellulose dissolution in the silage than in unensiled switchgrass. However, ensilage also increased the risk of releasing more sugar degradation products; After enzymatic hydrolysis, silage obtained higher total glucose, xylose and galactose yields than raw materials; After simultaneous saccharification and fermentation, ethanol concentration in silage was 12.1 g/L, higher than the unensiled switchgrass (10.3 g/L, 9.7 g/L and 10.6 g/L for early, mid and late fall respectively). Our results suggest that ensilage helps increase pretreatment efficiency and sugar yield, which increases final ethanol production.

Keywords:switchgrass, ensilage, liquid hot water pretreatment, cellulosic ethanol, simultaneous saccharification and fermentation

DOI:10.13345/j.cjb.150335

Corresponding author:Meiting Ju. Tel: +86-22-23506446; E-mail: jumeit@nankai.edu.cn