鄧輝，陳存武，孫傳伯，韋傳寶

1 皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安　237012 2 六安市蛋白質(zhì)分離與純化研究中心，安徽 六安　237012

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大腸桿菌磷酸甘油酸脫氫酶突變體的構(gòu)建及抗反饋抑制效應(yīng)

鄧輝1,2，陳存武1，孫傳伯1，韋傳寶1,2

1 皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安237012 2 六安市蛋白質(zhì)分離與純化研究中心，安徽 六安237012

鄧輝, 陳存武, 孫傳伯, 等. 大腸桿菌磷酸甘油酸脫氫酶突變體的構(gòu)建及抗反饋抑制效應(yīng). 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(4): 468–477.

Deng H, Chen CW, Sun CB, et al. Construction and characterization of Escherichia coli D-3-phosphoglycerate dehydrogenase mutants with feedback-inhibition relief. Chin J Biotech, 2016, 32(4): 468–477.

摘要:磷酸甘油酸脫氫酶 (D-3-phosphoglycerate dehydrogenase，PGDH，EC 1.1.1.95) 為L(zhǎng)-絲氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶，其編碼基因?yàn)閟erA，其活性受到合成產(chǎn)物L(fēng)-絲氨酸的反饋抑制調(diào)控。為解除絲氨酸的反饋抑制，采用定點(diǎn)突變技術(shù)把編碼PGDH酶344位組氨酸或346位天冬氨酸或364位天冬氨酸的密碼子定點(diǎn)突變?yōu)楸彼崦艽a子。改造后的serAFbr被連到表達(dá)載體pT7-7上，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌Escherichia coli BL21 (DE3) 中進(jìn)行表達(dá)，破壁回收粗酶液，通過(guò)DEAE陰離子柱純化PGDH突變體，并對(duì)其酶活性和IC50值進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果，野生型PGDH酶IC50值為7 μmol/L，而PGDH雙突變體N346A/H344A催化活性與野生型相近，在絲氨酸濃度為160 mmol/L時(shí)，其酶活仍保持未添加絲氨酸時(shí)酶活的96%，基本解除反饋抑制。

關(guān)鍵詞:大腸桿菌磷酸甘油酸脫氫酶，突變體的構(gòu)建，解除反饋抑制

Received: July 27, 2015; Accepted: October 29, 2015

Supported by: National High Technology Research and Development Program (863 Program) (No. 2012AA021500), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2012CB720805), National Natural Science Foundation of China (Nos. 81274021, H2801).

Hui Deng. Tel/Fax: +86-564-3305073; E-mail: dhup@qq.com

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2012AA021500)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2012CB720805)，國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 81274021，H2801) 資助。

L-絲氨酸處于氨基酸代謝的中間位置，參與許多生物物質(zhì)的合成，具有許多重要的生理功能和作用，食品和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)對(duì)其需求日益增大[1]。磷酸甘油酸脫氫酶 (PGDH，d-3-phosphoglycerate dehydrogenase，EC 1.1.1.95) 為L(zhǎng)-絲氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶，催化L-絲氨酸生物合成的第一步，其編碼基因?yàn)閟erA，其活性受到合成產(chǎn)物L(fēng)-絲氨酸的反饋抑制調(diào)控[2]，它的克隆表達(dá)及反饋抑制的解除將有助于構(gòu)建在生產(chǎn)上高產(chǎn)L-絲氨酸及其代謝衍生物的生產(chǎn)菌株。

David等[3]在0.9 ?分辨率下解析了結(jié)合有絲氨酸的磷酸甘油酸脫氫酶晶體結(jié)構(gòu)，晶體結(jié)構(gòu)分析表明：磷酸甘油酸脫氫酶為四聚體，每個(gè)亞基由核苷酸結(jié)合域、底物結(jié)合域和調(diào)控域組成。亞基之間的相互作用發(fā)生在調(diào)控區(qū)域，該區(qū)域形成一延伸的β折疊結(jié)構(gòu)，產(chǎn)物L(fēng)-絲氨酸的結(jié)合位點(diǎn)就位于這個(gè)表面。晶體結(jié)構(gòu)給出了與抑制物絲氨酸成極性共價(jià)鍵的氨基酸殘基，變構(gòu)調(diào)控結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖1。

為解除合成產(chǎn)物L(fēng)-絲氨酸對(duì)磷酸甘油酸脫氫酶的反饋抑制調(diào)控，本研究直接阻斷絲氨酸與酶的極性共價(jià)結(jié)合，即利用定點(diǎn)突變技術(shù)把磷酸甘油酸脫氫酶上與絲氨酸結(jié)合的344位組氨酸或346位天冬氨酸或364位天冬氨酸突變?yōu)楸彼?，使絲氨酸不能與PDGH形成極性共價(jià)鍵，致使絲氨酸無(wú)法完成對(duì)PDGH的變構(gòu)調(diào)控，從而獲得基本解除絲氨酸對(duì)PDGH反饋抑制作用的突變體。

圖1　絲氨酸分子在PGDH酶上結(jié)合位點(diǎn)Fig. 1　Serine bonding sites of PGDH. Subunit interface of PGDH consisting of two regulatory domains is shown in cartoon form. Banding subunit A is depicted in green, banding subunit D in purple. The two allosteric serine ligands are drawn in light blue, and side chains of residues which form important contacts (yellow dotted line) to the ligands are especially shown in molecular structural form. Using PyMOL 1.4 software to simulate the above picture.

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株、載體和質(zhì)粒

菌株BW25113、JM109和BL21 (DE3)，質(zhì)粒pMDTM18-T Simple均購(gòu)自Sigma公司。質(zhì)粒pT7-7為本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pMDTM18-T-serA、pMDTM18-T-serAFbr、pT7-7-serA和pT7-7-serAFbr為本次試驗(yàn)構(gòu)建，其中Fbr為feedback-inhibition resistance縮寫(xiě)，即抗反饋抑制。

1.1.2培養(yǎng)基、工具酶和試劑

培養(yǎng)基配方見(jiàn)文獻(xiàn)[4]，NdeⅠ、Hind Ⅲ、DpnⅠ、CIAP及T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa 公司；pMDTM18-T Simple、基因組DNA 及質(zhì)粒小量提取試劑盒為Promega 公司產(chǎn)品；蛋白定量試劑盒與酶活性測(cè)定試劑為Sigma 公司產(chǎn)品；酵母提取物和胰蛋白胨為Oxoid 公司產(chǎn)品；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank 中報(bào)道的E. coli str.K-12 Substr. MG1655的serA 基因序列 (Accession No. 945258)，以構(gòu)建PGDH雙突變體N346A/ H344A為例，設(shè)計(jì)4條寡核苷酸引物，并在兩端加上合適的酶切位點(diǎn) (NdeⅠ，Hind Ⅲ) (表1)，引物合成及測(cè)序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

表1　本研究所用的引物名稱(chēng)與序列Table 1　Primers used in this study

1.2重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

用基因組提取試劑盒提取E. coli K-12 BW25113基因組DNA，用引物系列1 PCR擴(kuò)增得到的野生型serA基因，將其與克隆載體pMDTM18-T Simple連接后，轉(zhuǎn)入JM109進(jìn)行擴(kuò)增，借助重組克隆質(zhì)粒pMDTM18-T-serA，用引物系列2對(duì)serA進(jìn)行H344A、N346A定點(diǎn)突變，獲得重組克隆質(zhì)粒pMDTM18-serAFbr，然后把野生型serA基因、突變型serAFbr基因和pT7-7載體用NdeⅠ、Hind Ⅲ雙酶切后分別切膠回收，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pT7-7-serA和pT7-7-serAFbr。

1.3野生型及突變型酶基因的表達(dá)和產(chǎn)物的純化

把重組表達(dá)質(zhì)粒pT7-7-serA和pT7-7-serAFbr電轉(zhuǎn)入BL21 (DE3)，取活化后菌體100 μL菌液至50 mL TB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至OD600約為1.3時(shí)，轉(zhuǎn)入25 ℃搖床繼續(xù)培養(yǎng)0.5 h，添加IPTG至終濃度50 mmol/L[5]，繼續(xù)培養(yǎng)10?16 h。

取100 mL培養(yǎng)后的菌體12 000 r/min、4 ℃離心，去盡上清，加入10 mL PBS緩沖液(20 mmol/L 磷酸鉀緩沖液，1 mmol/L DTT，pH 7.5)，充分混勻，ON 10 s，OFF 1 min超聲破碎，使渾濁液澄清。4 ℃、13 000 r/min離心30 min，上清和沉淀分別–20 ℃保藏。

用AKTA蛋白純化系統(tǒng)，采用Sepharose Fast Flow層析柱，DEAE為其陰離子交換介質(zhì)基團(tuán)，洗脫液為：A液 (20 mmol/L 磷酸鉀緩沖液，1 mmol/L DTT)，B液 (20 mmol/L磷酸鉀緩沖液，1 mmol/L DTT，1 mol/L NaCl)。對(duì)出峰蛋白進(jìn)行酶活測(cè)定，選取合適的洗脫液比例洗脫目的蛋白。用30 kDa的纖維柱濃縮蛋白樣液。

用SDS-PAGE蛋白電泳分析純化產(chǎn)物和粗酶液，比較純化效果。

1.4酶活性測(cè)定

PGDH酶活性的測(cè)定見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。2 mL反應(yīng)體系中含有：40 mmol/L磷酸鉀緩沖液 (pH 7.5)，1.0 mmol/L DTT，0.25 mmol/L NADH，5 mmol/L α-KG，10?20 μL 的已純化蛋白。測(cè)定方法：把0 ℃酶液加入37 ℃的反應(yīng)體系，測(cè)定樣品在340 nm條件下的NADH的吸光值減少量，計(jì)算酶的活性。1 U酶活定義等于反應(yīng)體系中每分鐘減少1 nmol/L NADH。蛋白濃度測(cè)定采用Bradford法[7]，繪出蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)酶活和蛋白含量計(jì)算比酶活。

1.5野生型及突變型PGDH穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)比較及抗反饋抑制效果

測(cè)定不同濃度α-KG (α-酮戊二酸) 下的反應(yīng)速度，作1/[s]和1/[v]的雙倒數(shù)曲線(xiàn)圖，求出反應(yīng)體系為：40 mmol/L磷酸鉀緩沖液 (pH 7.5)，1.0 mmol/L DTT，0.25 mmol/L NADH，不同濃度α-KG，10?20 μL的已純化蛋白。按1.4酶活性測(cè)定方法測(cè)定酶活。

IC50表示在底物濃度飽和的情況下，抑制原酶活性50%時(shí)絲氨酸的濃度。在PGDH酶活(μmol/L) 分別為0、4、8、9、15、20、30、40、50、60、80、20 000、40 000、60 000、80 000、160 000，加入純化后的野生型及突變型酶蛋白10 μg，以未加入絲氨酸時(shí)的酶活性為100%，計(jì)算酶活比。

1.6野生型及突變型PGDH理化性質(zhì)比較

測(cè)定不同反應(yīng)溫度下 (30?70 ℃) 酶液的酶活來(lái)確定最適溫度。反應(yīng)體系見(jiàn)1.4酶活性測(cè)定，酶液在待測(cè)溫度下先預(yù)熱1 min后加入同樣溫度下預(yù)熱2 min的反應(yīng)液中，待測(cè)溫度下測(cè)定樣品在340 nm條件下的NADH的吸光值減少量，計(jì)算酶的活性。

測(cè)定不同溫度 (0?60 ℃) 下保存3 min后的酶液的酶活來(lái)確定熱穩(wěn)定性。按1.4酶活性測(cè)定方法確定酶活比值。

測(cè)定不同pH值下 (pH 6?9) 酶液的酶活來(lái)確定最適pH。反應(yīng)體系為：40 mmol/L磷酸鉀-鈉緩沖液 (pH 6?9) (由Na2HPO4和KH2PO4混合)，1.0 mmol/L DTT，0.25 mmol/L NADH，5 mmol/L α-KG，10?20 μL的已純化蛋白。酶液調(diào)整到待測(cè)pH值下加入同樣pH值反應(yīng)液中，按1.4酶活性測(cè)定方法確定酶活比值。

測(cè)定在磷酸鉀-鈉緩沖液不同pH值 (pH 6–9) 下4 ℃保存24 h后酶液的酶活來(lái)確定酸堿穩(wěn)定性。按1.4酶活性測(cè)定方法確定酶活比值。

2　結(jié)果與分析

2.1野生型和突變型重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

對(duì)比L-絲氨酸結(jié)合前后的PDGH的晶體結(jié)構(gòu)，可知當(dāng)一個(gè)L-絲氨酸分子與PDGH一個(gè)亞基結(jié)合域的兩個(gè)氨基酸殘基344H、346N和相鄰亞基結(jié)合域的364’N形成3個(gè)極性共價(jià)鍵時(shí)，就會(huì)引起兩亞基間的空間構(gòu)像改變，進(jìn)而引起整個(gè)晶體的空間結(jié)構(gòu)變化，為最大限度維持原蛋白晶體的構(gòu)像，又盡量解除絲氨酸對(duì)PDGH兩相鄰亞基的作用，實(shí)驗(yàn)選擇突變H344A或N346A或N364A來(lái)解除L-絲氨酸的反饋抑制。

以雙突變體PDGH (N346A/H344A) 為例，用引物系列1從基因組擴(kuò)增出serserA，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pMDTM18-T-serserA，用引物系列2 對(duì)serA進(jìn)行H344A、N346A定點(diǎn)突變，獲得pMDTM18-T-serAFbr，再把pMDTM18-T-serA、pMDTM18-T-serAFbr和pT7-7[8]載體酶切后連接，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pT7-7-serA和pT7-7-serAFbr。圖2為重組表達(dá)質(zhì)粒pT7-7-serA及pT7-7-serAFbr的雙酶切鑒定結(jié)果。

圖2　重組質(zhì)粒pT7-7-serA及pT7-7-serAFbr的酶切鑒定Fig. 2　Identification by restriction digestion on recombinant plasmids of pT7-7-serA and pT7-7-serAFbr. M1: DS 15 000 marker; M2: DL 2 000 DNA marker; 1: recombinant plasmids of pT7-7-serA after enzyme digestion; 2: recombinant plasmids of pT7-7-serAFbrafter enzyme digestion.

測(cè)序結(jié)果表明：所構(gòu)建成重組質(zhì)粒pMD18-T-serA中serA的核苷酸序列與GenBank 中報(bào)道的E. coli K-12 的serA 基因序列一致；所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD18-T-serAFbr的H344A、N346A定點(diǎn)突變成功。

2.2PGDH酶液的分離和純化

由于該酶作為 α-酮戊二酸 (α-ketoglutarate, α- K G ) 還原酶和作為3-磷酸甘油酸(3-phosphoglycerate，3PG) 脫氫酶的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)特性一致，且二者對(duì)終產(chǎn)物L(fēng)-絲氨酸反饋抑制特性也幾乎完全一致[9]，以α-KG作為底物測(cè)該酶3PG脫氫酶活性的方法近年來(lái)也得到研究者的普遍應(yīng)用[10-15]，所以我們采用測(cè)定α-酮戊二酸 (α-ketoglutarate，α-KG) 還原酶特性代替測(cè)定3PG (3-phosphoglycerate，3PG) 脫氫酶的特性。

高速離心菌液收集誘導(dǎo)表達(dá)PDGH后的菌體，加入適量緩沖液混勻后超聲破碎至澄清，再高速離心取上清 (即粗酶液) 于–20 ℃保藏。用DEAE陰離子柱洗脫目的蛋白，用30 kDa的纖維柱濃縮蛋白樣液，用SDS-PAGE蛋白電泳對(duì)純化產(chǎn)物和粗酶液進(jìn)行電泳，比較純化效果。PGDH酶及其突變體的蛋白分離純化步驟參數(shù)見(jiàn)表2。

由表2知純化后的PGDH比酶活約為1.0×104U/mg，比純化前的比酶活提高了約3.2倍。SDS-PAGE電泳比較純化后酶液和粗酶液，結(jié)果見(jiàn)下圖3。

由圖知純化后的PDGH亞基蛋白分子量約在45 kDa，純化后的目的條帶清晰，達(dá)到電泳純。

2.3野生型及突變型PGDH穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)比較及抗反饋抑制效果

在NADH濃度飽和下，測(cè)定不同濃度α-KG下的反應(yīng)速度，作1/[s]和1/[v]的雙倒數(shù)曲線(xiàn)圖，得出PDGH的α-KG還原酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2　不同處理步驟對(duì)PGDH純化的影響Table 2　The influence of different processing steps on PGDH purification

圖3　野生酶與突變酶SDS-PAGE蛋白電泳Fig. 3　SDS-PAGE protein electrophoresis of wild type enzyme and its mutation. 1, 2: wild type enzyme and its mutation after purification; 3, 4: soluble cellular fraction of BL21(DE3) (serA) and its mutation; M: protein marker (14.4 kDa?94.0 kDa).

表3　野生型PDGH酶及其突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3　Kinetic parameters of Wild type PDGH and Mutant

L-絲氨酸對(duì)突變體和野生型PDGH的α-KG還原酶活性為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，在PGDH 酶活性測(cè)定反應(yīng)體系中加入一系列不同濃度的L-絲氨酸，測(cè)定絲氨酸對(duì)野生型及突變型PGDH的活性影響。不同絲氨酸濃度下野生酶和突變體(N346A/H344A) 真實(shí)酶活和酶活比的變化見(jiàn)圖4。

由曲線(xiàn)數(shù)據(jù)顯示，未添加L-絲氨酸時(shí)，野生酶和突變酶的比酶活相近，都約為1.01×104U/mg；當(dāng)添加不同濃度的絲氨酸后，野生酶的IC50值為7 μmol/L，即野生酶在絲氨酸濃度達(dá)到7 μmol/L時(shí)，酶活就被抑制為原來(lái)的50%，而突變酶 (N346A/H344A) 在絲氨酸濃度達(dá)到160 mmol/L時(shí)酶活仍保持96%。與野生型相比，本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建突變體在解除了終產(chǎn)物L(fēng)-絲氨酸對(duì)PGDH酶反饋抑制的同時(shí)，基本保持了原有野生型酶活性。

2.4野生型及突變型PGDH理化性質(zhì)比較

酶液在待測(cè)溫度下先預(yù)熱1 min后加入同樣溫度下預(yù)熱2 min的反應(yīng)液中，測(cè)定不同反應(yīng)溫度下酶液的酶活。由曲線(xiàn)數(shù)據(jù)顯示，野生型PDGH的最適溫度為50 ℃，突變體的最適溫度為55 ℃，高于野生型PDGH (圖5A)。

圖4　野生型PGDH酶及其突變體 (N346A/H344A)的抗反饋抑制曲線(xiàn)Fig. 4　Feedback inhibition of wild-type PGDH and its mutant (N346A/H344A).

圖5　野生型PGDH及突變體 (N346A/H344A) 理化性質(zhì)比較Fig. 5　Compare of physicochemical property of wld type PGDH and its mutant (N346A/H344A). (A) Optimum temperature. (B) Thermostability. (C) Optimal pH. (D) pH-stability.

酶液在設(shè)定溫度下保存3 min后置于冰上，測(cè)定在37 ℃反應(yīng)溫度下酶液的酶活。由曲線(xiàn)數(shù)據(jù)顯示 (圖5B)，突變體和野生型PDGH的在0?30 ℃保存3 min后，酶活一直很穩(wěn)定，但野生型PDGH在60 ℃保存3 min后迅速失活到原活性的7%，而突變體在60 ℃保存3 min后，仍保持原酶活的38%。由此得出突變體的最適溫度和熱穩(wěn)定性都略高于野生型PDGH。

酶液被調(diào)節(jié)到不同的待測(cè)pH值后加入同pH值的反應(yīng)液中，測(cè)定不同pH值下酶液的酶活。曲線(xiàn)數(shù)據(jù)顯示 (圖5C)，突變體和野生型PDGH的最適pH值相當(dāng)，都為pH 8.5，但在磷酸鉀-鈉緩沖液中酶活較同樣pH值下 (pH 7.5)的磷酸鉀緩沖液要小約1 000 U，即在后者中更適合酶的活性表達(dá)；在酸堿穩(wěn)定性測(cè)定中，可觀(guān)測(cè)到突變體 (N346A/H344A) 和野生型PDGH的酸堿穩(wěn)定性基本一致 (圖5D)。

實(shí)驗(yàn)同時(shí)也進(jìn)行了該調(diào)控結(jié)合域的3個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的單點(diǎn)突變，即單突變H344A、N346A 和N364’A和其他兩個(gè)雙點(diǎn)突變，即雙突變H344A和N364’A，N346A和N364’A并采用相同方法構(gòu)建了相應(yīng)的突變體，結(jié)果單點(diǎn)突變體和雙點(diǎn)突變H344A-N364’A、N346A-N364’A的突變體的酶活與野生型相比無(wú)明顯差異，而對(duì)單突變體對(duì)絲氨酸的IC50最大值為52 μmol/L，尚未解除絲氨酸反饋抑制，而雙點(diǎn)突變H344A-N364’A、N346A-N364’A的突變體對(duì)絲氨酸的反饋抑制效果與雙點(diǎn)突變H344AN346A的突變體效果相當(dāng)，且催化活力基本一致，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

表4　絲氨酸對(duì)野生型PGDH及其突變體的抑制效果Table 4　Inhibition of L-Serine on wild-type PGDH and its mutants

3　小結(jié)

國(guó)內(nèi)外報(bào)道中，去除SerA的反饋抑制的方法，多采用嘗試性的刪除部分結(jié)構(gòu)域，以降低反饋抑制效應(yīng)，如Wendisch報(bào)道研究發(fā)現(xiàn)在谷氨酸棒狀桿菌中3-磷酸甘油酸脫氫酶C端197個(gè)氨基酸缺失后能有效地解除反饋抑制，但比酶活從2.1 U/mg下降到1.3 U/mg，研究者同時(shí)發(fā)現(xiàn)該酶野生型為同源四聚體，而突變體為同源二倍體[16]。張緒梅通過(guò)對(duì)大腸桿菌SerA堿基序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，用PCR突變法構(gòu)建C端缺失不同序列的突變酶，獲得了具有抗反饋抑制性質(zhì)的大腸桿菌磷酸甘油酸脫氫酶，酶活性測(cè)定結(jié)果表明，M1、M2蛋白酶均保持了原有的野生型磷酸甘油酸脫氫酶活性，且部分解除了終產(chǎn)物L(fēng)–絲氨酸的反饋抑制作用；M3蛋白酶完全解除了終產(chǎn)物的反饋抑制作用，但酶活為野生型的83%，且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中研究者發(fā)現(xiàn)去除部分結(jié)構(gòu)域的菌株比野生型更易形成包涵體[17]。蔣瓊等構(gòu)建了甲基營(yíng)養(yǎng)菌serA基因的缺失C末端ACT功能域的突變基因和重組體表達(dá)菌MB200/pCM80serA△ 77。分析發(fā)現(xiàn)野生型基因重組表達(dá)菌的PGDH酶活受L-絲氨酸濃度影響較大，當(dāng)反應(yīng)體系中的L-絲氨酸濃度為40 μmol/L時(shí)，酶活減少了約1/3；而缺失了ACT功能域的基因表達(dá)菌的PGDH酶活基本不變，不受L-絲氨酸濃度的影響[18]。除蔣瓊的結(jié)果較為理想外，其他研究者通過(guò)非理性嘗試刪除部分調(diào)控域以達(dá)到解除反饋抑制并能保持酶活力不降的效果均不是很理想。值得注意的是，Al-Rabiee等也曾對(duì)來(lái)源于大腸桿菌Escherichia coli 的PGDH酶的相同位點(diǎn)進(jìn)行過(guò)定點(diǎn)突變和動(dòng)力學(xué)研究[6,19-21]，其采用的表達(dá)載體為pTrc 99A，表達(dá)宿主菌為JM105，結(jié)果顯示單突變體的絲氨酸IC50值與本實(shí)驗(yàn)接近，而雙突變體的絲氨酸IC50的值均大于250 mmol/L，但實(shí)際活細(xì)胞中并不會(huì)在胞內(nèi)出現(xiàn)濃度高達(dá)250 mmol/L的絲氨酸濃度，其突變體在絲氨酸濃度較低情況下的酶活保留率是未知的。相比而言，本實(shí)驗(yàn)明確給出雙突變體 (N346A/H344A) 在絲氨酸濃度為160 mmol/L之前的抑制曲線(xiàn)圖及突變體的酶學(xué)性質(zhì)，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也明確給出不同突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)值，這對(duì)絲氨酸及其衍生物的代謝調(diào)控和生產(chǎn)實(shí)踐將有更多的參考價(jià)值。

本研究在分析大腸桿菌SerA蛋白晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過(guò)理性設(shè)計(jì)突變替換絲氨酸分子與酶分子調(diào)控域上直接結(jié)合的氨基酸殘基分子為丙氨酸，阻斷絲氨酸分子與酶分子的極性共價(jià)結(jié)合，希望獲得解除絲氨酸對(duì)PDGH反饋抑制作用且酶活基本保持不變的突變體，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明上述目的達(dá)到，并且通過(guò)進(jìn)一步的酶學(xué)特性和動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，突變體和野生型在理化性質(zhì)和催化活性上均無(wú)顯著差別，而且實(shí)驗(yàn)中野生型和突變體的過(guò)量表達(dá)均沒(méi)有產(chǎn)生明顯的包涵體或聚集體，即選擇的表達(dá)載體和表達(dá)宿主適合過(guò)量表達(dá)目的蛋白。此研究提高了L-絲氨酸中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量，并解除了產(chǎn)物的反饋抑制作用，為應(yīng)用代謝工程方法研究L-絲氨酸的合成及其衍生物的合成提供了重要參考。

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(本文責(zé)編陳宏宇)

工業(yè)生物技術(shù)

Construction and characterization of Escherichia coli D-3-phosphoglycerate dehydrogenase mutants with feedback-inhibition relief

Hui Deng1,2, Cunwu Chen1, Chuanbo Sun1, and Chuanbao Wei1,2
1 College of Biology and Pharmaceutical Engineering, West Anhui University, Liu’an 237012, Anhui, China 2 Research Center of Protein Separation and Purification, Liu'an 237012, Anhui, China

Abstract:3-Phosphoglycerate dehydrogenase (PGDH, EC 1.1.1.95) is the key enzyme in L-serine biosynthesis and its coding gene is serA. PGDH is feedback inhibited by L-serine. In order to relieve the feedback-inhibition of PGDH by L-serine, H344 or D346 or D364 were chosen for site directed mutagenesis. The mutants were generated by the standard QuikChange mutagenesis, further subcloned into expression vector pT7-7 and transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) cells. The recombinant cells were collected after cultured in LB media post induced by isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside. The enzymes were purified by anion exchange chromatography, and SDS-PAGE showed that the purified enzymes were homogenous. Enzyme characterization indicated that the mutant enzyme showed similar activity, optimal temperature, and optimal pH as that of the wild-type enzyme. Moreover, feedback inhibition study showed that the activity of the double mutant (N346A/H344A) could remain 96% in the presence of serine up to 160 mmol/L, whereas the activity of the wild-type enzyme remains only 50% in the presents of serine of 7 μmol/L, thus successfully relieving the feedback inhibition of PGDH with its activity remained.

Keywords:Escherichia coli phosphoglycerate dehydrogenase, construction of mutants, relief of feedback inhibition

DOI:10.13345/j.cjb.150343

Corresponding authors: Chuanbao Wei. Tel/Fax: +86-564-3305073