姜麗娜,荀守華 ,張元帥,毛秀紅,喬玉玲,董元夫,孫百友
(1 山東農(nóng)業(yè)大學 林學院,山東泰安271018;2 山東省林業(yè)科學研究院,濟南250014;3 費縣國有大青山林場,山東臨沂273402)
多花刺槐花粉與柱頭形態(tài)及授粉親和性研究
姜麗娜1,荀守華2*,張元帥3,毛秀紅2,喬玉玲2,董元夫3,孫百友3
(1 山東農(nóng)業(yè)大學 林學院,山東泰安271018;2 山東省林業(yè)科學研究院,濟南250014;3 費縣國有大青山林場,山東臨沂273402)
摘要:運用掃描電子顯微鏡對多花刺槐不同發(fā)育時期的花粉與柱頭形態(tài)進行觀察分析;采用人工控制授粉方法,將多花刺槐花粉分別與異株多花刺槐和刺槐優(yōu)良無性系(‘魯刺152’)授粉,并用苯胺藍試劑染色法觀察多花刺槐花粉管的萌發(fā)過程,分析其授粉親和性,以探究多花刺槐自然結(jié)實率低的原因,為多花刺槐雜交育種提供理論依據(jù)。結(jié)果表明: (1)多花刺槐花粉粒大小平均為32.08 μm×19.55 μm(極軸長×赤道軸長),形狀為長橢球形、略方,具3個萌發(fā)溝,花粉粒大小在開花當時(花朵旗瓣微微張開,花藥開始散粉)達到最大(33.71 μm×20.11 μm),且形狀飽滿,此時為采粉的最佳時間。(2)柱頭表面具粘液和凸起,開花前12 h可授性最好,開花后48 h柱頭開始分解,可授性已很差;柱頭的可授期從開花前24 h至開花后24 h,約為3 d。(3)多花刺槐花粉在異株多花刺槐和‘魯刺152’為母本的植株上均可萌發(fā),并伸長至子房,但在前者的柱頭上萌發(fā)較晚,伸長速度較慢,說明它們之間均具有親和性,但與異株多花刺槐的親和性較差。
關鍵詞:多花刺槐;花粉;柱頭;電鏡觀察;授粉親和性
多花刺槐(Robinia neo-mexicanavar. luxuriansDieck)為豆科蝶形花亞科刺槐屬新墨西哥刺槐的變種[1],原產(chǎn)北美,為中小喬木。多花刺槐又名香花槐,花冠紫紅色, 花量大,鮮艷奪目;耐干旱,耐鹽堿,抗逆性強,是城鎮(zhèn)園林綠化、生態(tài)防護等優(yōu)良樹種之一[2]。但是,目前國內(nèi)外對多花刺槐的研究較少,僅見分類地位及不結(jié)實現(xiàn)象[3]、引種馴化及組培快繁技術(shù)[4]、苗木繁育技術(shù)[5]等方面研究。這些研究認為多花刺槐的繁殖方式主要以埋根、嫁接繁殖等無性繁殖為主,有性繁殖比較困難[3-5]。作者[6]對多花刺槐的結(jié)實率做過調(diào)查研究,認為多花刺槐能結(jié)實,但是結(jié)實率很低。
植物花粉的形態(tài)與結(jié)構(gòu)特征變化較小[7],如形狀、大小、紋飾、萌發(fā)孔的特征、數(shù)目及位置等都相對穩(wěn)定[8],這些形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征可以反映植物花粉粒的成熟情況、授粉后的發(fā)育情況[9]。柱頭是接受花粉的部位,柱頭的形態(tài)、粘液情況等可以反映其活性與可授性,從而判斷植物傳粉、受精、雜交育種的情況[10]。柱頭的可授期對有性生殖過程十分重要[11],我們可以通過觀察柱頭形態(tài)、柱頭分泌物的情況等判斷柱頭的可授性[12]。
本試驗運用掃描電子顯微鏡觀察法[13]對多花刺槐不同發(fā)育時期的花粉形態(tài)與柱頭形態(tài)進行觀察,從其花粉粒的大小、形態(tài),柱頭的形態(tài)、分泌物等方面,分析多花刺槐的授粉可行性與可授時間,并結(jié)合多花刺槐授粉后花粉體內(nèi)萌發(fā)試驗,分析其雜交授粉親和性。以此探究多花刺槐自然結(jié)實率很低的原因及雜交育種的可行性,為多花刺槐人工授粉雜交育種提供一些理論依據(jù)。
1材料和方法
1.1試驗材料與試驗區(qū)
試驗材料取自山東省費縣大青山林場刺槐無性系種子園中嫁接繁殖的6年生多花刺槐植株,均已進入開花結(jié)實年齡。本區(qū)域地理坐標為N35°23′,E118°11′,海拔240~250m;年平均氣溫13.8 ℃,年平均降雨量836.6mm。多花刺槐的花期在4月下旬至5月中旬,約半個月。
1.2試驗過程和方法
1.2.1花粉形態(tài)掃描電鏡觀察隨機選擇3株生長正常、樹體健壯的多花刺槐植株,在樹體的不同部位分別采集開花前24h、開花前12h、開花當時(花朵旗瓣微微張開,花藥開始散粉)、開花后12h、開花后24h、開花后48h共6個時段的花朵;每個時間段各采集5朵小花為一個樣本。將花朵的花藥取下,干燥后碾壓使花藥破裂散粉,將花粉密封置于4 ℃低溫冰箱中保存;將花粉噴金、抽真空后,用掃描電鏡依次對每個發(fā)育時期的花粉粒進行觀察,分析記錄,并拍照。根據(jù)掃描電鏡觀察,每個時段隨機選擇20個花粉粒(每個時段選取4個視野作為重復,每個視野中選取5個花粉粒),測量其極軸長(P)和赤道軸長(E)的最大值、最小值,并分別取平均值,用P、E、P×E3個數(shù)值來表示花粉粒的大小情況?;ǚ哿5男螤钣脴O軸長與赤道軸長比值(P/E)表示,P/E>1.6為長橢球形,P/E在1.3~1.6為橢球形。用Punt等[14]文中的專業(yè)術(shù)語來描述分析表面紋飾、褶皺、孔洞等花粉形態(tài)特征。
1.2.2柱頭形態(tài)掃描電鏡觀察利用試驗1.2.1花朵的雌蕊,用FAA固定,試驗時用不同梯度50%~100%的乙醇依次進行脫水后干燥;將柱頭噴金、抽真空后,用掃描電鏡依次對每個發(fā)育時期的柱頭進行觀察,分析記錄、拍照。根據(jù)掃描電鏡所拍照片與試驗觀察情況,分析柱頭整體形態(tài)、柱頭局部的放大情況、分泌粘液情況、吸附花粉粒的情況等,判斷柱頭的可授性、可授期及與花粉的親和情況等。
1.2.3授粉親和性試驗在開花當時采集多花刺槐花藥,干燥處理后破壁制成粉,分別選擇異株多花刺槐(樣樹3棵A1~A3)和刺槐無性系(魯刺152樣樹3棵B1~B3)處于開花前12h的花序柱頭進行人工授粉套袋,每個試驗設計3個重復花序,分別于授粉后2h、6h、10h、24h、48h采集小花2朵,用FAA固定;觀察時將雌蕊取出,用磷酸鉀溶液清洗后,用4mol/L的NaOH溶液軟化,再用苯胺藍試劑染色,用甘油封片,在熒光顯微鏡下觀察多花刺槐花粉管的萌發(fā)情況,并拍照。根據(jù)試驗觀察及所拍照片,取3個重復的平均值,分析計算花粉萌發(fā)量與萌發(fā)長度,得出多花刺槐授粉親和性情況。
2結(jié)果與分析
2.1多花刺槐花粉粒大小
試驗測定的各時間段多花刺槐花粉粒的極軸長最小值為27.22μm,最大值為36.17μm,平均值為32.08μm;赤道軸長最小值為16.58μm,最大值為21.46μm,平均值為19.55μm;即多花刺槐花粉粒的平均大小為32.08μm×19.55μm(P×E)。
多花刺槐花粉粒大小在不同發(fā)育時段是不斷變化的。開花前24h花粉粒平均大小為32.10μm×19.44μm,開花前12h的平均大小為32.80μm×19.50μm,開花當時的平均大小為33.71μm×20.11μm,開花后12h的平均大小為32.68μm×20.25μm,開花后24h的平均大小為29.12μm×18.44μm(表1)。從整體上看,多花刺槐花粉粒在開花前不斷增大,開花當時達到最大、形態(tài)飽滿,開花后又逐漸減小。
2.2多花刺槐花粉粒形狀
所測多花刺槐花粉粒中長橢球形所占比例為65%(13/20),橢球形占35%(7/20),大多數(shù)為長橢球形,數(shù)量接近2/3(圖1,a)。從開花不同時間段看,橢球形花粉粒多出現(xiàn)在開花前花粉不成熟時期與開花后期(圖1,b),開花當時橢球形的花粉粒極少(表1),多為略方的長橢圓球形,近似長方球形(圖1,c)。
多花刺槐花粉粒具3個萌發(fā)溝,萌發(fā)溝貫穿花粉粒兩端,較為狹長(圖1,d),從其近極面和遠極面均可清晰看到(圖1,e),萌發(fā)溝附近比較光滑,較少有褶皺與萌發(fā)孔(圖1,f)。
多花刺槐花粉粒表面具有一些紋飾、褶皺和萌發(fā)孔,其數(shù)量和形狀與花粉粒的發(fā)育情況有很大聯(lián)系。開花前24h,花粉粒表面的褶皺和萌發(fā)孔較為明顯、數(shù)量較多(圖2,a);開花前12h,褶皺、萌發(fā)孔數(shù)量都有所減少,形狀縮小(圖2,b);開花當時,花粉粒表面變得比較光滑,褶皺和萌發(fā)孔數(shù)量減少,但還較明顯(圖2,c);開花后12h,花粉粒變得更加平滑(圖2,d);開花后24h,花粉粒表面基本光滑,萌發(fā)溝被花粉粒內(nèi)部物質(zhì)填充(圖2,e);開花后48h,花粉粒表面很光滑,幾乎無褶皺、紋飾,萌發(fā)孔變得極小(圖2,f)。
表1 多花刺槐花粉粒大小與形狀
圖1 多花刺槐花粉粒形態(tài)Fig. 1 The shape of pollens of R. neo-mexicana var. luxurians
2.3多花刺槐柱頭形態(tài)
多花刺槐的柱頭一般膨大成半球形,表面有很多凸起,周圍有絨毛,直徑0.3~0.5mm。多花刺槐柱頭為濕性柱頭[15],在成熟期柱頭會分泌粘液來粘黏花粉粒,并為花粉萌發(fā)提供適宜的環(huán)境,在不同的發(fā)育時期柱頭形態(tài)會不斷發(fā)生變化。
開花前24h多花刺槐柱頭已有分泌的粘液,柱頭表面較為濕潤,形態(tài)比較飽滿,柱頭上幾乎無粘黏的花粉粒(圖3,a);開花前12h,柱頭表面粘液增多,有極少量粘黏的花粉粒(圖3,b);開花當時,柱頭上粘黏大量的花粉粒,表面粘液減少(圖3,c);開花后12h,柱頭上粘黏的花粉粒數(shù)量減少,且出現(xiàn)空癟的現(xiàn)象,這是花粉萌發(fā)后營養(yǎng)與遺傳物質(zhì)輸出的表征,柱頭表面粘液繼續(xù)減少,表面的凸起開始顯現(xiàn)(圖3,d);開花后24h,柱頭表面粘黏的花粉?;旧弦芽瞻T,凸起清晰可見(圖3,e);開花后48h,柱頭表面較為干燥,凸起明顯,部分柱頭向內(nèi)凹陷,發(fā)生分解,不再飽滿完整(圖3,f)。
試驗組合Testbattery樣樹Tree授粉后不同時間花粉萌發(fā)量Numberofpollentubes/stripe2h6h10h24h48h授粉后不同時間花粉萌發(fā)長度Lengthofpollentubes/mm2h6h10h24h48h多花刺槐×多花刺槐R.neo-mexicanavar.luxurians×R.neo-mexicanavar.luxuriansA110.6710.3313.3315.6711.671.00~2.004.00~6.007.00~11.0012.00~15.0015.00~19.00A210.0014.5011.0016.5012.501.00~3.004.00~6.007.00~11.0011.00~15.0014.00~18.00A316.339.0010.3310.6717.671.00~3.004.00~7.008.00~12.0012.00~16.0015.00~19.00平均Average12.3311.2811.5514.2813.951.00~3.004.00~7.007.00~11.0012.00~16.0015.00~19.00魯刺152×多花刺槐R.pseudoacacia‘Luci152’×R.neo-mexicanavar.luxuriansB17.3315.3312.3312.0011.674.00~7.008.00~10.0011.00~14.0013.00~16.0013.00~17.00B217.5019.5019.0016.5012.005.00~8.007.00~11.0011.00~15.0013.00~16.0013.00~17.00B320.0020.6719.3322.3314.675.00~9.008.00~12.0012.00~14.0014.00~17.0015.00~18.00平均Average14.9418.5016.8916.9412.785.00~8.008.00~11.0011.00~14.0013.00~16.0014.00~17.00
注:平均值為花粉管伸長最多最集中處的長度
Note:Theaveragelengthisthelengthofthepollentubesmostcentralizedplace
2.4多花刺槐授粉親和性情況
在以多花刺槐和刺槐無性系(‘魯刺152’)2個品種為母本進行人工授粉,樣樹上多花刺槐花粉萌發(fā)情況差異較為明顯(表2)。授粉后2h時,多花刺槐花粉粒在2種樣樹的柱頭上均已萌發(fā),但‘魯刺152’的柱頭上花粉管的萌發(fā)量明顯比多花刺槐多,伸長快(柱頭下部照片圖4,2h)。但是由于‘魯刺152’的雌蕊比多花刺槐的短,所以花粉管的長度相對要比多花刺槐稍短一些。授粉后6h,2種樣樹柱頭處都有大量花粉管繼續(xù)萌發(fā)和伸長,多花刺槐樣樹萌發(fā)的花粉管有少量伸長至子房頭部;‘魯刺152’樣樹花粉管有部分伸長至子房中部(子房頭部照片見圖4,6h)。授粉后10h,多花刺槐的花粉管多伸長至子房頭部,也有部分至子房中部,‘魯刺152’樣樹則多數(shù)集中于子房頭部至中部處,部分已到達末端(子房中部照片見圖4,10h)。授粉后24h,多花刺槐樣樹花粉管多至子房中部處,‘魯刺152’樣樹則多分布在子房中下部,很多已至子房末端(子房末端照片見圖4,24h)。授粉后48h,2種樣樹的柱頭處仍有花粉管萌發(fā),但萌發(fā)數(shù)量已很少(柱頭處照片見圖4,48h)。
總體而言,多花刺槐的花粉在異株多花刺槐和刺槐優(yōu)良無性系(‘魯刺152’)分別為母本的植株上均可萌發(fā),并伸長至子房,但是多花刺槐的花粉在‘魯刺152’的柱頭上萌發(fā)的較早,且伸長速度也相對較快,其親和性更好。
圖4 多花刺槐授粉親和情況Fig. 4 The pollination affinity situation of R. neo-mexicana var. luxurians
3結(jié)論與討論
在人工控制授粉時,植物花粉的成熟度對授粉結(jié)果存在一定的影響[16]。孫鵬等[17]對刺槐的開花傳粉方式研究得出,花粉粒形態(tài)飽滿、表面具褶皺與紋飾、萌發(fā)孔發(fā)育良好(容易與柱頭粘黏,利于傳粉)時是采集花粉的最佳時間。根據(jù)對多花刺槐的花粉形態(tài)、大小的試驗觀察發(fā)現(xiàn),在開花前24h花粉粒還未完全成熟,開花前12h花粉粒已基本發(fā)育成熟,但這并不是采集花粉的最佳時期。開花當時,多花刺槐花粉粒發(fā)育成熟,形態(tài)良好。這之后,花粉?;盍p弱,大小減小,表面的紋飾褶皺變少,對傳粉過程和與柱頭粘黏產(chǎn)生阻礙。因此,多花刺槐在開花當時,即花朵的旗瓣微微張開,花粉開始散出時,是采集花粉的最佳時間,進行雜交育種、人工授粉時,應在父本開花當時采集花粉。
在王其剛等[18]對月季柱頭形態(tài)發(fā)育進程與可授性研究和紅雨等[19]對蒙古扁桃的研究中都指出,授粉時柱頭的發(fā)育情況會影響授粉后的結(jié)實率,柱頭的形態(tài)與分泌粘液的情況可以反映柱頭最佳授粉期。根據(jù)對不同發(fā)育時期柱頭形態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn),多花刺槐柱頭可授期在開花前24h至開花后24h的2~3d時間。開花前12h左右的一段時間柱頭形態(tài)飽滿、表面充滿粘液,發(fā)育良好,且自花雄蕊的花粉還沒有散出,柱頭處幾乎沒有粘黏的花粉粒,是進行雜交育種、人工授粉的最佳時間[20]。在開花當時,柱頭上已粘黏有很多自花的花粉粒,這時進行人工授粉為時已晚。
結(jié)合花粉與柱頭形態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn),多花刺槐花粉成熟與柱頭最佳授粉期之間有時間差,花粉成熟的時間為開花當時,而柱頭的最佳授粉時間是開花前12h左右,即雌蕊先于雄蕊成熟。因此,在實際的雜交育種、人工授粉操作時,對采集父本花粉與授粉母本花序應當進行合理的選擇,恰當掌握時間。
根據(jù)本試驗可知,多花刺槐與異株多花刺槐和刺槐無性系(魯刺152)授粉均具有親和性,只是與前者的親和性較低。用多花刺槐做父本進行人工雜交授粉是可行的。試驗發(fā)現(xiàn),多花刺槐花粉粒表面布滿紋飾、褶皺和萌發(fā)孔,這利于昆蟲攜帶傳播,是蟲媒傳粉的特征之一[17]。由此推測,自然條件下多花刺槐結(jié)實率很低而非不結(jié)實[6]的內(nèi)在機理為:開花后花朵旗瓣與翼瓣張開,部分蟲媒進行異花傳粉,但此時柱頭的可授性已很低,少數(shù)可授性較好的柱頭接受蟲媒傳粉,進行異花授粉后可結(jié)實。由于特殊的蝶形花結(jié)構(gòu),多花刺槐的雌、雄蕊被花瓣包裹,花粉成熟散出和柱頭最佳可授粉期都是在花瓣未完全張開時就已完成,這種閉花自交授粉也降低植物結(jié)實率[21]。袁存權(quán)等[22]和Surles等[23]都認為自交會嚴重降低刺槐的結(jié)實率。
由于多花刺槐花粉成熟與柱頭最佳授粉時間存在差異及兩者親和性較低等原因,多花刺槐做母本雜交的成功率與結(jié)實率相對較低。另外,授粉后雌雄配子的受精情況、胚珠敗育等對多花刺槐有性生殖的實現(xiàn)也有較大的影響,這還需要后續(xù)試驗進一步研究。
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(編輯:潘新社)
MorphologyandPollinationCompatibilityofthePollenandStigmainRobinia neo-mexicanavar. luxurians
JIANGLina1,XUNShouhua2*,ZHANGYuanshuai3,MAOXiuhong2,QIAOYuling2,DONGYuanfu3,SUNBaiyou3
(1ShandongAgriculturalUniversity,Tai’an,Shandong271018,China; 2ShandongAcademyofForestry,Ji’nan250014,China; 3DaqingshanForestFarm,Linyi,Shandong273402,China)
Abstract:We used scanning electron microscopy (SEM) in this experiment to observe the pollen and stigma morphology of Robinia neo-mexicana var. luxurians in different periods of development, and had taken photos for analysis. Besides, we pollinated the pollens of R. neo-mexicana var. luxurian to the stigmas of another R. neo-mexicana var. luxurian and high-quality clone of R. pseudoacacia (R. pseudoacacia ‘Luci 152’), and we used aniline blue stain to observe the germination process of pollen tubes in vivo. And then, we analyzed the pollination compatibility of this species. The results show that: (1) The average size of the pollen is 32.08 μm×19.55 μm (poleaxis length × equatorial axes length). The shape of the pollen is long spheroidicity with three germinal furrow, a little square. At the flowering moment, the pollen grows to the maximum, its microscopy becomes full. This is the best time to collect the pollen of R. neo-mexicana var. luxurians. (2) The surface of the stigma has mucilage and bulges. It has much mucilage at 12 h before flowering and the receptivity is the best. At 48 h after flowering, the stigma begins to break, the receptivity is already very bad, and the whole receptive period of the stigma is about three days from 24 h before flowering to 24 h after flowering. (3) The pollen of R. neo-mexicana var. luxurian could germinate in both R. neo-mexicana var. luxurian and R. pseudoacacia ‘Luci 152’ treated as the female parent, but the former germinates later and elongates slower, which illustrates that the pollen of R. neo-mexicana var. luxurian has affinity with both the stigmas of R. neo-mexicana var. luxurian and R. pseudoacacia ‘Luci 152’, but the affinity with the former is worse.
Key words:Robinia neo-mexicana var. luxurians; pollen; stigma; SEM; pollination compatibility
文章編號:1000-4025(2016)05-0938-07
doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.05.0938
收稿日期:2015-10-12;修改稿收到日期:2016-04-11
基金項目:國家林業(yè)公益性行業(yè)專項“刺槐屬種質(zhì)資源收集保存與創(chuàng)新利用研究”(201304116)
作者簡介:姜麗娜(1989-),女,在讀碩士研究生主要從事園林植物生物學特性研究。E-mail:1562637702@qq.com。 *通信作者:荀守華,碩士生導師,研究員,主要從事林木遺傳育種和新品種保護研究。E-mail:xshsdxpz@163.com。
中圖分類號:Q321;Q944.58
文獻標志碼:A