，　，　，　，　,2

(1.玉溪中煙種子有限責(zé)任公司，　云南 玉溪 653100；　2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，　云南 玉溪 653100)

煙草是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，也是我國(guó)財(cái)政收入的重要支撐。目前我國(guó)煙草種植面積為世界最大[1-2]，2016年烤煙種植面積達(dá)127.73 hm2。要滿(mǎn)足如此大面積的種植，必須要有高質(zhì)量的煙草種子作為保證[3]。煙草是自花授粉作物，天然異交率一般為1%～2%[4]，但為了保證煙草品種純度，在煙草良種生產(chǎn)過(guò)程中一般采用的是人工輔助授粉的方式。

授粉對(duì)植物的生殖生長(zhǎng)具有重要意義。有活力的花粉授到具有可授性的柱頭上才算完成授粉過(guò)程，保證生殖生長(zhǎng)正常進(jìn)行[5]。柱頭發(fā)育到一定時(shí)期后可以接受花粉，并隨著柱頭的老化接受花粉的能力也隨之降低，這段時(shí)期就是柱頭的可授期[6]?；ǚ壑荒茉谥^的可授期內(nèi)接觸柱頭才能完成授粉。近些年，有較多學(xué)者在花卉、林木及藥用植物等的花柱和柱頭及花粉方面做了大量研究。紅雨等研究發(fā)現(xiàn)，不同品種芍藥的柱頭可授性及可授期均存在明顯差異[7]。劉林德等的研究表明，錦帶花在開(kāi)花3 h后才具有柱頭可授性且可授期較短[8]。宋振巧等用田間授粉測(cè)定法對(duì)丹參的柱頭可授性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)丹參在花前2 d至花后6 h內(nèi)保持較強(qiáng)的柱頭可授性，自開(kāi)花至花后6 h內(nèi)的可授性最強(qiáng)[9]。王其剛等研究發(fā)現(xiàn)，月季柱頭形態(tài)發(fā)育與其可授性有直接關(guān)系[10]。同時(shí)Cai、Lush W等國(guó)外學(xué)者對(duì)煙草花粉管萌發(fā)伸長(zhǎng)、花粉與柱頭超微結(jié)構(gòu)及親和機(jī)制等進(jìn)行了大量研究[11-14]。鄭昀曄等[15]，廖雪芳等[16]，顏合洪等[17]也對(duì)煙草栽培種的花粉活力、授粉時(shí)期等進(jìn)行了相關(guān)研究。姚志敏等[18]也對(duì)煙草野生種花粉活力、柱頭可授性及結(jié)實(shí)性方面與常規(guī)品種進(jìn)行了比較研究。

同時(shí)不少學(xué)者對(duì)于常規(guī)品種與不育系品種在花柱與柱頭上的區(qū)別的研究也做了大量工作。李紅等研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿不育系與常規(guī)品種在花柱與柱頭在粗細(xì)、柱頭大小、分泌物等方面存在較大差別[19]。鄧群仙等研究發(fā)現(xiàn)，在枇杷中不同長(zhǎng)度花柱柱頭其可授性及分泌物形成的時(shí)間也不一致[20]。由于目前對(duì)煙草不育系與常規(guī)品種的花柱特性比較的研究較少，本實(shí)驗(yàn)對(duì)烤煙雄性不育系品種與其同型可育品種的雌蕊性狀進(jìn)行研究，比較其花柱與柱頭的特性，旨在為煙草雜交育種及良種生產(chǎn)提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　材　料

2017年3月將來(lái)源于玉溪中煙種子有限責(zé)任公司種質(zhì)庫(kù)中的K 326和MSK 326播種于公司溫室大棚中，經(jīng)過(guò)育苗、剪葉、鍛苗等一系列管理，在5月移栽，于花期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2　方　法

1.2.1K 326與MSK 326柱頭可授性比較

煙草花的發(fā)育過(guò)程從花蕾形成到花開(kāi)時(shí)間為12 d左右[21]，從能夠進(jìn)行試驗(yàn)操作的第3天開(kāi)始對(duì)于整個(gè)花朵柱頭的可授性進(jìn)行觀(guān)察比較。由于花粉會(huì)影響柱頭可授性的試驗(yàn)結(jié)果，因此K 326的花朵在開(kāi)花前1 d花藥尚未散開(kāi)時(shí)去雄。

采用聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法進(jìn)行煙草柱頭可授性觀(guān)察[22]。在每天柱頭活力最強(qiáng)的14：00時(shí)隨機(jī)篩選符合要求的花將其柱頭切下，浸入含有聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫反應(yīng)液[V(1%聯(lián)苯胺)∶V(W=3%過(guò)氧化氫)∶V(水)=4∶11∶22]的凹面載玻片的凹陷處， 20 min后用放大鏡觀(guān)察柱頭染色與氣泡出現(xiàn)情況。柱頭顏色越深、氣泡越多表示可授性越強(qiáng)，反之，柱頭無(wú)顏色變化、無(wú)氣泡冒出，表示無(wú)可授性。柱頭可授性強(qiáng)弱根據(jù)柱頭顯色程度與氣泡數(shù)量進(jìn)行判斷。

1.2.2去雄對(duì)雌蕊發(fā)育的影響

在花開(kāi)前4 d對(duì)K 326的花朵進(jìn)行去雄處理，設(shè)計(jì)對(duì)照試驗(yàn)，在盛花期對(duì)花柱長(zhǎng)度，柱頭表面積，柱頭顏色及柱頭可授性等方面進(jìn)行比較。

1.2.3花柱長(zhǎng)度與柱頭表面積比較

在盛花期隨機(jī)選取10朵花進(jìn)行觀(guān)察，在顯微鏡下進(jìn)行測(cè)量。每瓣柱頭表面積公式按照橢圓球體表面積公式計(jì)算，柱頭總表面積為柱頭分瓣數(shù)與每瓣表面積相乘所得。多瓣柱頭選取中間大小的分瓣進(jìn)行測(cè)量。橢圓球體面積公式計(jì)算為：S=4π(ab+bc+ac)/3，式中：a、b、c分別代表柱頭的長(zhǎng)、寬、高。

1.3　統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2013和SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行后期數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　柱頭分瓣數(shù)

對(duì)隨機(jī)選取的100朵K 326的花進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，K 326的柱頭全部為常規(guī)2瓣柱頭，無(wú)其他形狀柱頭出現(xiàn)。但是如圖1所示，MSK 326的柱頭與K 326的柱頭性狀有所差異，除了有與K 326相同的2瓣柱頭之外，還會(huì)有3、4、5、6瓣柱頭。在對(duì)隨機(jī)選取的145朵MSK 326花進(jìn)行觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，其中以3瓣柱頭最高，為32.41%，其次是4瓣柱頭，占比為30.34%，5瓣柱頭占20.69%，略高于2瓣柱頭的15.86%，6瓣柱頭雖然存在，但是數(shù)量極少，只占0.70%(表1) 。

表1不育系品種中不同分瓣數(shù)柱頭個(gè)數(shù)

柱頭分瓣數(shù)23456個(gè)數(shù)234744301占比(%)15．8632．4130．3420．690．70

圖1　不育系品種不同分瓣數(shù)柱頭

2.2　花柱長(zhǎng)度比較

從圖2可以看出，在K 326的花柱和MSK 326的2瓣到5瓣柱頭的花柱中K 326的花柱是最長(zhǎng)的。MSK 326的4種分瓣數(shù)柱頭中最長(zhǎng)的是2瓣柱頭，最短的是5瓣柱頭，其長(zhǎng)度隨著分瓣數(shù)的增加而降低。但是MSK 326的最長(zhǎng)花柱仍然比K 326的花柱要短。通過(guò)方差分析得知，K 326花柱、2瓣柱頭花柱、3瓣柱頭花柱與4瓣柱頭花柱和5瓣柱頭花柱長(zhǎng)度之間的差異性顯著。同時(shí)K 326與MSK 326的3瓣柱頭長(zhǎng)度的也具有顯著的差異性。只有K 326花柱與MSK 326的2瓣柱頭花柱之間無(wú)顯著性差異。

注：a、b、c表示不同材料之間的差異顯著性(p<0.05)。圖2　不同分瓣數(shù)柱頭花柱長(zhǎng)度

2.3　柱頭表面積

從圖3中可以看出，K 326的柱頭表面積最小，MSK 326的柱頭表面積整體上均要大于K 326，但是MSK 326的2瓣柱頭與K 326的柱頭表面積相差不大。在MSK 326中，隨著柱頭分瓣數(shù)的增多，柱頭表面積也隨之增大，5瓣柱頭表面積最大，比K 326的柱頭表面積大了21.16%，2瓣到4瓣柱頭表面積增長(zhǎng)不是很明顯，基本呈等差數(shù)列增大。

表2MSK 326與K 326柱頭可授性比較

品種花朵發(fā)育時(shí)間(d)3456789101112131415161718MSK326+++++++++++++++++++++++++++++++++++K326++++++++++++++++++++++++--

注：“-”不具可授性，“+”具可授性，“++”具較強(qiáng)可授性，“+++”具強(qiáng)可授性。

圖3　不同分瓣數(shù)柱頭表面積

圖4　煙草花發(fā)育過(guò)程

2.4　柱頭可授性檢測(cè)

如圖4所示，煙草花朵從現(xiàn)蕾到盛開(kāi)共需要12 d，由于前期花朵發(fā)育不完全，無(wú)法進(jìn)行試驗(yàn)操作，因此從花朵發(fā)育的第3天進(jìn)行柱頭可授性檢測(cè)。結(jié)果如表2所示，MSK 326的柱頭在花朵發(fā)育第3天開(kāi)始就具有一定的可授性，但是聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫溶液檢測(cè)時(shí)顏色基本無(wú)變化且氣泡較少。從第5天開(kāi)始，MSK 326的柱頭可授性就開(kāi)始增強(qiáng)，顏色變化明顯，氣泡較多；從第9天開(kāi)始，柱頭顏色為深藍(lán)色，并有大量氣泡冒出，柱頭可授性達(dá)到最強(qiáng)；從第15天才開(kāi)始柱頭可授性減弱，但減弱趨勢(shì)較為平緩；從第18天開(kāi)始柱頭可授性變?nèi)醣憩F(xiàn)較為明顯。與MSK 326相比K 326的柱頭同樣是從第3天就具有一定的可授性，且可授性能力同樣表現(xiàn)為微弱；從第8天開(kāi)始柱頭可授性增強(qiáng)；從第11天開(kāi)始柱頭表現(xiàn)出最強(qiáng)的可授性；從第14天柱頭可授性開(kāi)始下降；從第15天開(kāi)始可授性急劇下降；從第17天開(kāi)始不具有可授性。

結(jié)果可以看出，MSK 326的柱頭在開(kāi)花前3 d就具有最強(qiáng)的可授性，持續(xù)到開(kāi)花后2 d，持續(xù)時(shí)間為6 d；K 326柱頭在開(kāi)花前1 d，柱頭表現(xiàn)最強(qiáng)可授性，到花后1 d開(kāi)始下降，持續(xù)時(shí)間為3 d。

圖5　提前去雄對(duì)花柱長(zhǎng)度與柱頭表面積的影響

2.5　去雄處理對(duì)雌蕊的影響

在花開(kāi)前4 d對(duì)K 326的花進(jìn)行去雄處理，設(shè)置同期對(duì)照，在花盛開(kāi)時(shí)期進(jìn)行花柱性狀調(diào)查。從圖5和圖6中可以看出，試驗(yàn)材料花柱長(zhǎng)度較正常花柱短了22.05%，柱頭長(zhǎng)度和寬度分別縮小了15.84%和58.64%，高度基本無(wú)變化，柱頭表面積降低了50.44%。從顏色上觀(guān)察柱頭兩側(cè)部分顏色變成褐色或黑色。從結(jié)果可以看出，柱頭寬度變化最為明顯，表明煙草柱頭在發(fā)育受阻或萎縮時(shí)先是從柱頭兩側(cè)開(kāi)始。柱頭可授性試驗(yàn)結(jié)果顯示，無(wú)明顯顏色變化，具有少量氣泡冒出，可授性比正常對(duì)照花朵柱頭弱很多，不建議進(jìn)行授粉。因此，提前去雄對(duì)煙草花柱的影響較大，雌蕊發(fā)育受到抑制，柱頭接受花粉的能力大幅度降低，因此在進(jìn)行煙草人工輔助授粉時(shí)最好是選擇邊去雄邊授粉。

圖6　提前去雄對(duì)柱頭的影響

3　結(jié)論與討論

花柱性狀受遺傳因素影響在不同品種當(dāng)中的表現(xiàn)存在差異[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，K 326的柱頭是常規(guī)2瓣柱頭，MSK 326柱頭有2～6瓣等不同分瓣形式。其中以3瓣和4瓣為主，2瓣為15.86%，6瓣最少，僅占0.7%?；ㄖL(zhǎng)度為K 326最長(zhǎng)，其次為MSK 326的2瓣柱頭花柱，5瓣最短。柱頭表面積表現(xiàn)為K 326最小，MSK 326中隨著柱頭分瓣數(shù)的增加，柱頭表面積也隨之增大。因此可以看出，煙草花柱長(zhǎng)度與分瓣數(shù)成反比，柱頭表面積與柱頭分瓣數(shù)成正比，可能是柱頭瓣數(shù)的增加影響了花柱長(zhǎng)度的發(fā)育。

柱頭表面積與授粉成功率相關(guān)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，煙草柱頭表面積隨著柱頭分瓣數(shù)的增加而增大，并且不育系品種的2瓣柱頭表面積也比常規(guī)品種2瓣柱頭表面積要大。這可能有利于不育系品種能更好的接受外來(lái)花粉，增加授粉成功率。

柱頭具有可授性是植物生殖成功的前提保證，而不同植物的柱頭可授性不同，不同品種間可授性也存在一定的差異。從柱頭可授性結(jié)果來(lái)看，不育系品種MSK 326的柱頭表現(xiàn)出較強(qiáng)可授性的時(shí)間更早，在最強(qiáng)可授性時(shí)期持續(xù)的時(shí)間也更長(zhǎng)。不育系品種在進(jìn)行人工授粉時(shí)可以選擇在開(kāi)花前3 d進(jìn)行，加快種子發(fā)育，縮短種子生產(chǎn)時(shí)間。常規(guī)品種進(jìn)行人工授粉時(shí)最好是選擇在開(kāi)花前1 d，花朵尚未開(kāi)發(fā)且頂端發(fā)紅時(shí)進(jìn)行。

對(duì)常規(guī)品種K 326在開(kāi)花前4 d進(jìn)行去雄處理后發(fā)現(xiàn)，去雄花朵雌蕊發(fā)育也受到影響，花柱長(zhǎng)度變短，柱頭長(zhǎng)度和寬度變小，表面積縮小50%以上。同時(shí)柱頭兩側(cè)或部分變成褐色或黑色，可授性極其微弱，已經(jīng)基本失去授粉能力。本研究發(fā)現(xiàn)，柱頭弱化基本是由柱頭兩側(cè)開(kāi)始，柱頭長(zhǎng)度和高度變化不大。同時(shí)表明提前進(jìn)行去雄能夠?qū)Υ迫锇l(fā)育產(chǎn)生影響，因此在常規(guī)種人工雜交時(shí)最好選擇邊去雄邊授粉的操作。

本研究通過(guò)對(duì)MSK 326和K 326雌蕊性狀進(jìn)行觀(guān)察，對(duì)柱頭分瓣數(shù)、柱頭表面積、花柱長(zhǎng)度、柱頭可授性等方面進(jìn)行了比較研究，有待通過(guò)內(nèi)含物、生理生化指標(biāo)等來(lái)進(jìn)行檢測(cè)對(duì)比，同時(shí)花柱長(zhǎng)度與授粉時(shí)間的相關(guān)性有待試驗(yàn)驗(yàn)證，從而更加明確常規(guī)品種與不育系品種在人工授粉進(jìn)行良種生產(chǎn)中的可用性，也能夠更好的服務(wù)于煙草良種繁殖與生產(chǎn)。

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