張紹彬，唐海芹，陳德碧，蘭建彬

（1.重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，重慶402160；2.重慶文理學(xué)院特色植物研究院，重慶402160）

園藝·中藥材

生姜辛香物質(zhì)合成途徑關(guān)鍵基因ZoHMGR的克隆及表達(dá)

張紹彬1，唐海芹1，陳德碧1，蘭建彬2＊

（1.重慶文理學(xué)院林學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，重慶402160；2.重慶文理學(xué)院特色植物研究院，重慶402160）

為探明3－羥基－3－甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGR）在生姜（Zingiber officinale Roscoe）倍半萜合成途徑的調(diào)節(jié)作用，根據(jù)在竹根姜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中HMGR不同轉(zhuǎn)錄本序列，經(jīng)比對(duì)分析后利用RT－PCR技術(shù)克隆HMGR基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析；再利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)目的基因在竹根姜不同組織和葉組織在不同誘導(dǎo)條件下的表達(dá)特性，同時(shí)分析其生成的倍半萜物質(zhì)。結(jié)果表明：克隆的竹根姜ZoHMGR基因編碼562個(gè)氨基酸，其與姜科植物陽(yáng)春砂的親緣關(guān)系最近。ZoHMGR基因主要在根莖中表達(dá)，其次是葉，而莖和根中的表達(dá)量最低，符合生姜不同組織中倍半萜物質(zhì)的含量特征；該基因同時(shí)受物理傷害和茉莉酸甲酯處理的誘導(dǎo)，分別在6h和12h達(dá)最高表達(dá)水平，同時(shí)有倍半萜類(lèi)物質(zhì)生成。

生姜；倍半萜；HMGR基因

生姜（Zingiber officinale Roscoe）為姜科多年生草本宿根植物，原產(chǎn)東南亞。自古以來(lái)，中國(guó)和印度將其作為一種重要的蔬菜和藥材［1］。倍半萜類(lèi)物質(zhì)是生姜根莖部位辛香物質(zhì)最重要成分之一，同時(shí)也是其精油的主要成分［2－3］。植物體內(nèi)的倍半萜物質(zhì)生物合成通常存在兩條途徑：包括丙酮酸（MEP）途徑和甲羥戊酸（MVA）途徑。倍半萜生物合成中C5單位主要來(lái)源于甲羥戊酸途徑［4］，但兩條途徑存在一定程度地交叉［5］。在富含萜類(lèi)物質(zhì)的器官和組織中，有部分倍半萜類(lèi)物質(zhì)的合成前體底物在丙酮酸（MEP）途徑生成［4，6］。在MVA途徑中，5種酶依次參與催化acetylCoA生成IPP，分別為HMGS、 HMGR、MVK、MVD和PMK。其中，3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR，EC：1.1.1.34）催化3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A（HMG－CoA）形成甲羥戊酸。因此，HMGR被認(rèn)為是在MVA途徑中第1個(gè)限速關(guān)鍵酶，是倍半萜類(lèi)化合物合成中的重要調(diào)控節(jié)點(diǎn)之一［7－8］。

多數(shù)研究表明，植物體內(nèi)的HMGR基因表達(dá)呈現(xiàn)組織和器官特異性，如橡膠HbHMGR1主要在其乳膠中進(jìn)行大量表達(dá)［9］，而大戟EpHMGR1主要在根中大量表達(dá)［10］，同樣丹參SmHMGR主要在根部表達(dá)［11］，這些組織中主要富含相應(yīng)的萜類(lèi)化合物。在不同誘導(dǎo)條件下，植物體內(nèi)HMGR基因的表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其對(duì)應(yīng)的倍半萜類(lèi)物質(zhì)生成量也隨之顯著提高，表明其含量變化與HMGR活性呈正相關(guān)［12－13］。此外，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將HMGR基因轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物能提高有效成分的產(chǎn)量［10－11］。

目前，對(duì)生姜根莖中倍半萜類(lèi)物質(zhì)的提取和鑒定研究報(bào)道較多［14－15］。但尚未見(jiàn)對(duì)生姜倍半萜的生物合成途徑中關(guān)鍵基因的分子調(diào)控機(jī)制的研究報(bào)道。因此，解析關(guān)鍵基因在生姜倍半萜物質(zhì)的生物合成途徑調(diào)控作用，能為揭示其辛香品質(zhì)形成分子調(diào)節(jié)機(jī)制的奠定基礎(chǔ)。筆者在課題組利用最新的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)生姜（竹根姜品種）不同組織的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了鑒定分析。筆者在此研究的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的序列比對(duì)和分析，采用RT－PCR的方法克隆竹根姜ZoHMGR基因的全長(zhǎng)序列，并分析其在不同組織中及葉組織誘導(dǎo)條件下的表達(dá)特性與其對(duì)應(yīng)的倍半萜物質(zhì)含量變化情況，為后續(xù)深入研究其在竹根姜倍半萜物質(zhì)合成途徑的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

重慶文理學(xué)院花卉研究所大棚栽培的當(dāng)年生竹根姜的根、莖、嫩葉及根狀莖。

1.2 RNA處理及倍半萜物質(zhì)的提取

提取總RNA和分離倍半萜物質(zhì)，檢測(cè)ZoHMGR基因的組織表達(dá)特異性和倍半萜物質(zhì)含量特性。對(duì)竹根姜當(dāng)年生嫩葉進(jìn)行機(jī)械傷害和茉莉酸甲酯處理，分別于處理后2h、4h、6h、8h、12h 和6h、12h、24h取樣，用于提取相應(yīng)的總RNA，檢測(cè)目的基因在不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)差異。以吐溫－80為助溶劑，配制20μmol／L濃度的溶液［16］。對(duì)葉中表達(dá)量最高時(shí)6h和12h，取樣收集倍半萜物質(zhì)，用GC－MS鑒定和分析倍半萜類(lèi)物質(zhì)［17］。

1.3 ZoHMGR基因全長(zhǎng)的分離

根據(jù)序列分析的ZoHMGR基因的ORF序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)全長(zhǎng)引物：F（5′－AC CACCATGTACCTCCGTCGTC－3′）和R（5′－GAT CGGTTAGGGGGCAACTTTG－3′），以反轉(zhuǎn)錄的單鏈cDNA為模板，PCR驗(yàn)證拼接序列的正確性。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)、回收、克隆和測(cè)序驗(yàn)證［17］。

1.4 ZoHMGR的相關(guān)生物信息學(xué)分析

目的基因編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)采用ExPASy Proteomics Server提供在線工具Protparam （http：／／www.expasy.ch／tools／protparam.html）進(jìn)行，采用TMHMM 2.0軟件進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，同時(shí)采用SWISS－MODEL（http：／／swissmodel.expasy.org／）的保守結(jié)構(gòu)域作圖工具中，以人類(lèi)的HMGR （PDB No.：2q6bA）為參照對(duì)象，對(duì)ZoHMGR編碼蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)建模。

1.5 ZoHMGR的進(jìn)化樹(shù)分析

將ZoHMGR與GenBank中19種不同物種，包括12種植物的HMGR蛋白進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)和聚類(lèi)關(guān)系的分析，進(jìn)一步通過(guò)MEGA 4軟件分析構(gòu)建Neighbor－joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real－time PCR）

利用熒光定量PCR分析檢測(cè)目的基因在不同組織及葉組織中不同傷害處理下的表達(dá)量。熒光引物：F（5′－GCGTAAAGGGTGCAAACC－3′）和R（5′－CCTCCCATCACAGCTATAAAC－3′）。PCR反應(yīng)以生姜肌動(dòng)蛋白基因（ZoActin）為內(nèi)參引物：F（5′－CTTGCTGGTCGTGATCTTACAG－3′）和R（5′－GAAAAGAACCTCTGGGCATCTA－3′）引物［17］。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZoHMGR基因全長(zhǎng)cDNA的克隆和序列

在竹根姜的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中有不同轉(zhuǎn)錄本被注釋為HMGR基因。經(jīng)序列分析和比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該數(shù)據(jù)能組裝成含有1個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）。經(jīng)擴(kuò)增獲得1條長(zhǎng)為1 695bp的序列，測(cè)序結(jié)果與拼接序列完全一致。將該基因命名為ZoHMGR，該基因與已經(jīng)克隆姜科植物陽(yáng)春砂的AvHMGR的蛋白同源性為86%。經(jīng)BLAST顯示，該蛋白與其他物種的HMGR家族蛋白具有較高的同源性，ZoHMGR與海棗（Phoenix dactylifera）、高粱（Sorghum bicolor）、煙草（Nicotiana tabacum）和葡萄（Vitis vinifera）中HMGR蛋白分別有78%、75%、68%和68%的相似性。ZoHMGR與其他物種的HMGRs相同，均具有HMG－CoA結(jié)合基序和2個(gè)NADP（H）結(jié)合基序（圖1）。其中，TTEGCLVA的谷氨酸（G）對(duì)HMGR蛋白的催化作用至關(guān)重要。ZoHMGR起催化作用的活性中心是其功能主要作用部位，在高等植物中具有很高的保守性。

圖1 ZoHMGR與其他物種HMGR合成酶基因的氨基酸序列Fig.1 The amino acid sequence of ZoHMGRand HMGR from other species

2.2 ZoHMGR的生物信息學(xué)性質(zhì)

2.2.1 理化性質(zhì)ZoHMGR蛋白質(zhì)的分子式為C2631H4263N719O799S26，分子量為59.58kD，等電點(diǎn)pI為6.23。負(fù)電殘基（Asp＋Glu）為54，帶正電殘基（Arg＋Lys）為51。表明，該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為46.37，脂肪系數(shù)為101.39，親水性系數(shù)為0.183。2.2.2跨膜區(qū)及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 該蛋白含有2個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，分別位于31～53位和74～96位氨基酸間。由圖2可見(jiàn)，ZoHMGR編碼的蛋白與新智人類(lèi)的HMGR具有53.6%的序列同一性的類(lèi)似空間結(jié)構(gòu)。

圖2 生姜ZoHMGR編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 The tertiary structure of ZoHMGRencoded protein

2.2.3 信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位及跨膜區(qū)ZoHMGR蛋白自身不具有信號(hào)肽。綠體定位系數(shù)為10.0 （chlo：9.0）；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位系數(shù)為3.0（E.R.：3.0），表明該蛋白最可能定位在葉綠體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。該基因編碼蛋白具有2個(gè)跨膜區(qū)的結(jié)構(gòu)。

2.2.4 分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 由圖3可見(jiàn)，目的蛋白與姜科植物陽(yáng)春砂（A.villosum）的HMGR聚為一類(lèi)［18］，說(shuō)明二者的親緣關(guān)系最近，和高粱等同屬于單子葉植物一類(lèi)。

圖3 生姜ZoHMGR與其他物種HMGR合成酶基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.3 The phylogenetic tree of ZoHMGR and HMGR from other species

2.3 ZoHMGR基因不同組織表達(dá)的特異性

由圖4A可見(jiàn)，目的基因在根狀莖中的表達(dá)量最高，其次為葉、在莖和根中表達(dá)最低。結(jié)合其不同組織中倍半萜物質(zhì)的總含量（圖4B），說(shuō)明ZoHMGR可能主要在根狀莖中發(fā)揮基因自身的生物學(xué)功能。

圖4 不同組織中ZoHMGR基因表達(dá)量和倍半萜物質(zhì)含量Fig.4 Expression of ZoHMGRand sesquiterpenes content in different tissues

2.4 ZoHMGR基因響應(yīng)不同傷害處理的表達(dá)特性

正常生長(zhǎng)的竹根姜葉組織中，只含有少量的倍半萜物質(zhì)，當(dāng)受到外界傷害后生成一定量的倍半萜類(lèi)物質(zhì)（圖5）。由圖5A表明，ZoHMGR基因均能受機(jī)械傷害和茉莉酸甲酯處理的誘導(dǎo)，且二者呈現(xiàn)相似的誘導(dǎo)表達(dá)模式。但經(jīng)機(jī)械傷害，目的基因表達(dá)升高較快，且在6h時(shí)達(dá)最高的表達(dá)水平，而后呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，但仍高于對(duì)照條件下的表達(dá)量；茉莉酸甲酯處理對(duì)ZoHMGR基因的誘導(dǎo)時(shí)間比物理傷害遲，表達(dá)在12h時(shí)到最大，然后保持較高的水平。

圖5 葉組織中不同條件處理下ZoHMGR基因表達(dá)量和倍半萜物質(zhì)含量Fig.5 Expression of ZoHMGRand sesquiterpenes content in leaves under different treatments

3 結(jié)論與討論

生姜倍半萜類(lèi)物質(zhì)是其辛香品質(zhì)形成的主要成分之一，解析生姜倍半萜類(lèi)物質(zhì)合成途徑中關(guān)鍵基因的功能及其調(diào)節(jié)機(jī)制，是闡明其辛香品質(zhì)形成機(jī)制和建立分子調(diào)控機(jī)制的基礎(chǔ)。高通量測(cè)序技術(shù)是對(duì)富含次生代謝物質(zhì)的非模式植物中調(diào)控次生代謝合成關(guān)鍵基因挖掘的有效手段之一，在諸多研究中已有報(bào)道，如積雪草和沉香［19－20］。本課題組前期對(duì)竹根姜不同組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析，從中獲得大量倍半萜合成途徑中關(guān)鍵合成酶基因的相關(guān)序列。而HMGR基因是植物萜類(lèi)合成中甲羥戊酸途徑的第1個(gè)關(guān)鍵限速酶，R決定“碳硫”的流向。本研究根據(jù)測(cè)序得到的HMGR基因的部分轉(zhuǎn)錄本信息，成功從竹根姜根莖中克隆了1個(gè)HMGR基因的全長(zhǎng)cDNA（ZoHMGR），同時(shí)對(duì)其進(jìn)行相關(guān)的生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，竹根姜的ZoHMGR和其他植物中HMGR具有較高的同源性和相類(lèi)似的理化特性，說(shuō)明克隆獲得的目的基因?qū)儆贖MGR基因家族。目前已發(fā)現(xiàn)歐榛、銀杏和丹參等多種植物，在HMGR的氨基酸序列中包含2個(gè)HMGHMG－CoA結(jié)合基序和2個(gè)NADP（H）結(jié)合基序；這4個(gè)區(qū)域在HMGR蛋白中具有重要功能并高度保守［11，13］。在基因組水平上對(duì)玉米、雷蒙德氏棉、楊樹(shù)和大豆等物種的HMGR基因進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，HMGR基因家族的功能和進(jìn)化上在植物界中相當(dāng)保守［21］。

大量研究表明，植物中HMGR基因的表達(dá)具有組織器官特異性，且這些組織中含有大量相關(guān)的萜類(lèi)物質(zhì)，特別是在重要藥食兩用植物丹參、甘草和紅豆杉中［9－11，20－21］。ZoHMGR組織表達(dá)分析顯示，該基因在根莖中表達(dá)量最高，其次在葉組織中低表達(dá)，而在根和莖中表達(dá)量最低，說(shuō)明ZoHMGR可能主要在生姜的根莖和葉組織中發(fā)揮其本身的生物學(xué)功能，這也與生姜倍半萜類(lèi)物質(zhì)的形成部位特性相符［3，15］，推測(cè)其可能與倍半萜物質(zhì)的形成相關(guān)。植物的HMGR基因通常受到細(xì)胞和環(huán)境信號(hào)的調(diào)節(jié)，如光照、植物激素、病菌及外部傷害［22］。人參HMGR的啟動(dòng)子活性在擬南芥中能被黑暗處理誘導(dǎo)［23］。生姜根莖的生長(zhǎng)通常在黑暗條件下，其倍半萜物質(zhì)的合成與大戟的抗腫瘤和丹參的丹參酮等相關(guān)萜類(lèi)物質(zhì)主要在根中存在［10－11］，而人參的三萜類(lèi)物質(zhì)人參皂苷主要在根組織中［23］，表明在黑暗條件下能誘導(dǎo)植物的HMGR參與相關(guān)萜類(lèi)物質(zhì)的合成。

在正常生長(zhǎng)的姜科植物白姜花的葉組織只有少量倍半萜類(lèi)物質(zhì)，只有受到傷害后才能被誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的倍半萜類(lèi)物質(zhì)，同時(shí)倍半萜途徑中另一關(guān)鍵基因的HcFPPS受機(jī)械傷害和蟲(chóng)害的誘導(dǎo)表達(dá)，表明HcFPPS在葉組織中可能起一定的生態(tài)功能［17］。本研究采用典型的物理傷害兩種方法處理健康的葉組織，檢測(cè)目的基因在葉組織中的表達(dá)變化情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，ZoHMGR基因和其對(duì)應(yīng)的倍半萜物質(zhì)生成顯著受這2種傷害的誘導(dǎo)，該研究結(jié)果能進(jìn)一步揭示目的基因在竹根姜的倍半萜類(lèi)物質(zhì)形成中可能參與調(diào)控作用。在其他植物中，如白木香的AsHMGR1與AsHMGR2同樣具有相似的組織表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)特異性，且與其目的萜類(lèi)物質(zhì)的生產(chǎn)對(duì)應(yīng)，說(shuō)明二者可能共同協(xié)調(diào)其生長(zhǎng)發(fā)育和次生代謝物質(zhì)合成［24－25］。本研究為進(jìn)一步鑒定ZoHMGR基因在竹根姜倍半萜合成中的調(diào)控機(jī)制及后續(xù)分子育種奠定基礎(chǔ)。

［1］李錄久，劉榮樂(lè)，陳 防，等.生姜的功效及利用研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（30）：14656－14657.

［2］Onyenekwe P C，Hashimoto S.The composition of the essential oil of dried Nigerian ginger（Zingiber officinale Roscoe）［J］.Eur Food Res Technol，1999，209：407－410.

［3］Pino J A，Marbo R，Rosado A，et al.Chemical composition of the essential oil of Zingiber officinale Roscoe L.from Cuba［J］.Journal of Essential Oil Research，2004，16（3）：186－188.

［4］Natalia D，Susanna A，Irina O，et al.The nonmevalonate pathway supports both monoterpene and sesquiterpene formation in snapdragon flowers［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102：933－938.

［5］Aule O，F(xiàn)urholz A，Chang H S，et al.Crosstalk between cytosolic and plastidial pathways of isoprenoid biosynthesis in Arabidopsis thaliana［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100：6866－6871.

［6］Huang M S，Abel C，Sohrabi R，et al.Variation of Herbivore－Induced Volatile Terpenes among Arabidopsis Ecotypes Depends on Allelic Differences and Subcellular Targeting of Two Terpene Synthases，TPS02and TPS03［J］.Plant Physiology，2010，153：1293－1310.

［7］Chappell J，Wolf F，Proulx J，et al.Is the reaction catalyzed by 3－h(huán)ydroxy－3－methylglutaryl coenzyme A reductase a rate－limiting step for isoprenoid biosynthesis in plants［J］.Plant Physioly，1995，109（4）：1337－1343.

［8］Aquil S，Husaini A M，Abdin M Z，et al.Overexpression of the HMG－CoA reductase gene leads to enhanced artemisinin biosynthesis in transgenic Artemisia annua plants［J］.Planta，2009，75：1453－1458.

［9］Venkatachalam P，Priya P，Jayashree R，et al.Molecular cloning and characterization of a 3－h(huán)ydroxy－3－methylglutaryl－coenzyme A reductase1（hmgr1）gene from rubber tree（Hevea brasiliensis Muell.Arg.）：a key gene involved in isoprenoid biosynthesis［J］.Physiol Mol Biol Plants，2009，15：133－143.

［10］Cao X Y，Zong Z M，Ju X Y，et al.Molecular cloning，characterization and functional analysis of the gene encoding HMG－CoA reductase from Euphorbia pekkinensis Rupr［J］.Molecular Biology Reports，2010，37：1559－1567.

［11］Dai Z B，Cui G H，Zhou S F，et al.Cloning and characterization of a novel 3－h(huán)ydroxy－3－methylglutaryl－coenzyme A reductase gene from Salvia miltiorrhiza involved in diterpenoid tanshinone accumulation［J］.J Plant Physioly，2011，168：148－157.

［12］Alam P，Abdin M Z.Over－expression of HMG－CoA reductase and amorpha－4，11－diene synthase genes in Artemisia annua L.and its influence on artemisinin content［J］.Plant Cell Rep，2011，30：1919－1928.

［13］Wang Y Y，Jing F Y，Yu S Y，et al.Co－overexpression of the HMGR and FPS genes enhances artemisinin content in Artemisia annua L［J］.J Med Plants Res，2011，5：3396－3403.

［14］林 茂，闞建全.鮮姜和干姜精油成分的GC－MS研究［J］.食品科學(xué)，2008，29（1）：283－285.

［15］熊運(yùn)海，彭小平.不同產(chǎn)地生姜揮發(fā)油共有成分的氣－質(zhì)聯(lián)用及化學(xué)計(jì)量學(xué)分析［J］.食品科學(xué)，2013，34 （16）：288－292.

［16］魏潔書(shū)，楊錦芬，凌 敏，等.茉莉酸甲酯調(diào)控陽(yáng)春砂HMGR，DXR和DXS基因表達(dá)［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，30（1）：88－92.

［17］Lan J B，Yu R C，Yu Y Y，et al.Molecular cloning and expression of Hedychium coronarium farnesyl pyrophosphate synthase gene and its possible involve－ment in the biosynthesis of floral and wounding／herbivory induced leaf volatile sesquiterpenoids［J］.Gene，2013，518：360－367.

［18］楊錦芬，何國(guó)振，阿迪卡利，等.陽(yáng)春砂3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的克隆及分析［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（8）：1893－1897.

［19］Rajender S S，Sandhya T J.De novosequencing and assembly of Centella asiatica leaf transcriptome for mapping of structural，functional and regulatory genes with special reference to secondary metabolism［J］.Gene，2013，525：58－76.

［20］劉雨佳，張夏楠，程琪慶，等.藥用植物萜類(lèi)生物合成HMGR基因研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中藥雜志，2013，38 （19）：3226－3233.

［21］Li W，Liu W，Wei H L，et al.Species－Specific Expansion and Molecular Evolution of the 3－h(huán)ydroxy－3－methylglutaryl Coenzyme A Reductase（HMGR）Gene Family in Plants［J］.PLOS ONE，2014，9：1－10.

［22］Stermer B A，Bianchini G M，Korth K L.Regulation of HMG－CoA reductase activity in plants［J］.J Lipid Res，1994，35：1133－1140.

［23］Kim Y J，Lee O R，Oh J Y，et al.Functional analysis of 3－h(huán)ydroxy－3－methylglutaryl coenzyme A reductase encoding genes in triterpene saponin producing ginseng［J］.Plant Physiology，2014，165（1）：373－387.

［24］Xu Y H，Zhang Z，Wang M X，et al.Identification of genes related to agarwood formation：transcriptome analysis of healthy and wounded tissues of Aquilaria sinensis［J］.BMC Genomics，2013，14：227－243.

［25］Song A A－L，Abdullah J O，Abdullah M P，et al.Overexpressing 3－Hydroxy－3－Methylglutaryl Coenzyme A Reductase（HMGR）in the Lactococcal Mevalonate Pathway for Heterologous Plant Sesquiterpene Production［J］.PLOS ONE，2012，109：e51444.

（責(zé)任編輯：劉忠麗）

Cloning and Expression of ZoHMGR（a Key Gene for Synthesis of Spicy Substance）in Zingiber officinale

ZHANG Shaobin1，TANG Haiqin1，CHEN Debi1，LAN Jianbin2＊
（1，College of Life Science ＆Forestry，Chongqing University of Arts and Science，Chongqing402160；2，Institute of Characteristics Plant，Chongqing University of Arts and Science，Chongqing 402160，China）

The bioinformatics of full－length cDNA of ZoHMGR cloned by RT－PCR technology according to different transcript sequence of HMGR in the transcriptome database is analyzed.The expression characteristics of the target gene in different tissues and leaf of Zingiber officinale is detected by real－time PCR under different induction conditions and the synthetic sesquiterpene material is determined to explore the regulating effect of 3－Hydroxy－3－methylglutaryl－coenzyme A reductase（HMGR）in sesquiterpene synthesis of Zingiber officinale.Results：The cloned ZoHMGRhas 562amino acids，which is close to Amomum villosum.ZoHMGRexpresses in rhizome mainly，followed by leaves.The expression quantity of ZoHMGRin stem and roots is minimum，which accords with the characteristics of sesquiterpenes content in different tissues of Zingiber officinale.The maximum expression level of ZoHMGRtreated by wound and MeJA induction is at 6hand 12hrespectively and the sesquiterpenes material is synthesized at the same time.

Zingiber officinale；sesquiterpenes；HMGRgene

S632.5

A

1001－3601（2016）08－0344－0076－04

2016－03－03；2016－07－30修回

重慶市教委項(xiàng)目“利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序挖掘合成生姜辛香和辛辣品質(zhì)次生代謝物質(zhì)關(guān)鍵基因”（KJ1401104）；重慶文理學(xué)院校級(jí)項(xiàng)目“生姜辛香和辛辣品質(zhì)相關(guān)的次生代謝物質(zhì)測(cè)定與分析”（Z2013LX13）；重慶文理學(xué)院校級(jí)人才引進(jìn)項(xiàng)目“生姜辛香品質(zhì)形成的分子調(diào)控機(jī)制”（R2012LS02）

張紹彬（1983－），男，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事園藝植物品質(zhì)分析研究。E－mail：232400209＠qq.com

＊通訊作者：蘭建彬（1979－），男，副教授，博士，從事植物次生代謝分子生物學(xué)研究。E－mail：lanjb1013＠163.com