郭樹奇,許　鵬，魯　梅，王澤宇，王永宏，張　興

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心，陜西 楊凌 712100；2 陜西省楊凌區(qū)高新中學(xué)，陜西 楊凌 712100)

初始pH對(duì)嗜線蟲致病桿菌YL001菌株抑菌活性及代謝的影響

郭樹奇1,許鵬1，魯梅1，王澤宇2，王永宏1，張興1

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心，陜西 楊凌 712100；2 陜西省楊凌區(qū)高新中學(xué)，陜西 楊凌 712100)

[摘要]【目的】 研究初始培養(yǎng)pH對(duì)Xenorhabdus neamatophila YL001發(fā)酵液抑菌活性的影響，為進(jìn)一步提高YL001的抑菌活性提供理論依據(jù)?！痉椒ā?采用生長速率法、瓊脂擴(kuò)散法、活體組織法，分別測(cè)定了初始pH 4.5,5.5,6.5,7.0,7.5和8.5培養(yǎng)條件下，X.neamatophila YL001發(fā)酵液及其乙酸乙酯提取物的抑菌活性；同時(shí)采用HPLC、LC-MS分析了乙酸乙酯提取物中代謝物的差異?！窘Y(jié)果】 隨著初始pH的升高，共生菌發(fā)酵液及其乙酸乙酯提取物的抑菌活性也逐步提高。pH8.5時(shí)，YL001發(fā)酵液對(duì)水稻瘟疫病菌(Magnaporthe grisea)、辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、蘋果輪紋病菌(Physalospora piricola)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、甘藍(lán)黑斑病菌(Alternaria brassicae)以及枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)均具有最強(qiáng)的抑制作用，發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對(duì)番茄灰霉病的EC50為1.29 mg/mL，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為14.65 mm。隨著初始培養(yǎng)pH的升高，YL001發(fā)酵液及乙酸乙酯提取物對(duì)番茄灰霉病的治療和保護(hù)作用也逐漸提高，保護(hù)作用明顯優(yōu)于治療作用。HPLC和LC-MS代謝分析表明，pH8.5、pH 7.0及pH 4.5培養(yǎng)條件下發(fā)酵液乙酸乙酯提取物中代謝物含量存在顯著差異?！窘Y(jié)論】 初始培養(yǎng)pH可以顯著影響X.neamatophila YL001的抑菌活性及代謝能力，堿性條件更有利于活性物質(zhì)的產(chǎn)生及其穩(wěn)定性的保持。

[關(guān)鍵詞]嗜線蟲致病桿菌；初始pH；胞外產(chǎn)物；抑菌活性

昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌是一種寄生于昆蟲病原線蟲腸道內(nèi)的革蘭氏陰性細(xì)菌，屬腸桿菌科(Enteobacteriaceae)，包括致病桿菌屬(Xenorhabdus)和發(fā)光桿菌屬(Photorhabdus)，分別與斯氏線蟲(Steinernema)和異小桿線蟲(Heterorhabditis)共生[1]。產(chǎn)生具有抗菌活性的次生代謝產(chǎn)物是共生菌的普遍特征，到目前為止，已從致病桿菌和發(fā)光桿菌中分離鑒定出30多種生物活性成分(主要為乙腈類、酰胺類、吲哚類、二硫吡咯類、水溶性苯并芘類、羥化二苯乙烯類、蒽醌類、肽類化合物),其中從致病桿菌中分離的生物活性成分主要有乙腈類化合物Rhabduscin、 酰胺類化合物Nematophin、 吲哚類化合物Indoles等[2]，這些代謝產(chǎn)物不僅具有多種化學(xué)結(jié)構(gòu)，而且在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)上具有廣泛的生物活性，如抗腫瘤[3-5]、殺蟲[6]、殺線蟲[7]、抑菌[8-9]等。同時(shí)，這些化合物結(jié)構(gòu)新穎、生物活性高，具備開發(fā)新型農(nóng)藥的潛質(zhì)，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域應(yīng)用前景方闊。

近年來X.nematophilaATCC 19061、X.bovienii和PhotorhabdusluminescensTT01全基因組序列已經(jīng)完成并公布[10-11]。全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，共生菌中含有的次生代謝產(chǎn)物生物合成基因簇的數(shù)量遠(yuǎn)多于已分離鑒定的次生代謝產(chǎn)物的數(shù)量，大量的次生代謝產(chǎn)物生物合成基因簇沒有表達(dá)，處于隱藏狀態(tài)，共生菌次生代謝產(chǎn)物的多樣性有進(jìn)一步挖掘的潛力[2,9-11]。昆蟲病原線蟲共生菌次生代謝物的產(chǎn)生與菌種、菌株及培養(yǎng)條件密切相關(guān)。不同種的致病桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)有較大差異，同一菌株在不同培養(yǎng)條件下的代謝也有一定差異[12-17]。培養(yǎng)條件的改變不僅可以影響X.nematophila代謝產(chǎn)物含量的變化，而且還可影響其總體的代謝特征，有利于促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的生物合成及隱藏天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)與挖掘[2,18-19]。初始pH作為細(xì)菌生長的重要影響因子，對(duì)共生菌細(xì)胞生長、代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生以及生物活性同樣具有重要作用[20-22]。

X.nematophilaYL001是從陜西楊凌土壤中篩選的昆蟲病原線蟲Steinernemasp.YL001中分離獲得的1株共生菌[23]，前期研究已證明其具有廣泛的抑菌活性，特別是對(duì)番茄灰霉病和辣椒疫霉病具有很強(qiáng)的抑制作用[24]。為進(jìn)一步提高YL001菌株的抗菌活性，促進(jìn)其隱藏天然產(chǎn)物的開發(fā)，本研究采用生長速率法、瓊脂擴(kuò)散法、活體組織法，分別測(cè)定了初始pH 4.5,5.5,6.5,7.0,7.5和8.5培養(yǎng)條件下X.neamatophilaYL001發(fā)酵液及其乙酸乙酯提取物的抑菌活性，并采用HPLC、LC-MS分析了初始pH對(duì)X.nematophilaYL001代謝的影響，旨在為進(jìn)一步提高YL001的抑菌活性提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試菌株與培養(yǎng)基

1.1.1供試菌株XenorhabdusnematophilaYL001(簡稱YL001)，來源于共生線蟲Steinernemasp(采自楊凌)，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心提供。

1.1.2供試病原菌辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、水稻瘟疫病菌(Magnaporthegrisea)、蘋果輪紋病菌(Physalosporapiricola)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、棉花黃萎病菌(Fusariumoxysporiumf.sp.vasinfectum)、蘋果炭疽病菌(Clomerelacinyulate)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、棉花枯萎病菌(Verticilliumdahliae)、甘藍(lán)黑斑病菌 (Alternariabrassicae)、玉米彎孢病菌(Curvularialunata(Wakker) Boed)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、白菜軟腐病菌(Erwiniacarotorora)、水稻白葉枯病菌(Xanthomonascampestris)、獼猴桃潰瘍病菌(Pseudomonassyringae)，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心提供。

1.1.3培養(yǎng)基菌種活化培養(yǎng)基為NB培養(yǎng)基；鑒別培養(yǎng)基為NBTA培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 6.13 g/L，蛋白胨21.29 g/L，MgSO41.50 g/L，(NH4)2SO42.46 g/L，KH2PO40.86 g/L，K2HPO41.11 g/L，Na2SO41.72 g/L；病原真菌培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基；病原細(xì)菌培養(yǎng)基為NA培養(yǎng)基。各處理發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH分別用0.1 mol/L NaOH及0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為4.5，5.5，6.5，7.0，7.5和8.5；其余培養(yǎng)基pH為7.2～7.4。

1.2不同初始pH條件下X.nematophilaYL001胞外代謝產(chǎn)物的制備

取種管保存的共生菌，分別挑取單菌落于NB培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min活化24 h后劃線于NBTA平板，28 ℃培養(yǎng)48 h，挑取藍(lán)色初生型單菌落接種于NB培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，以9%接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基，同樣條件下培養(yǎng)72 h，得共生菌發(fā)酵液，9 000 r/min、4 ℃離心30 min，然后取上清液用于抑菌活性測(cè)定。乙酸乙酯提取物分別用等體積乙酸乙酯萃取3次，濃縮后置40 ℃烘箱烘干，干物質(zhì)獲得率為545 mg/L。

1.3YL001菌株發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制作用

1.3.1對(duì)植物病原真菌的抑制作用采用生長速率法[24-25]測(cè)定發(fā)酵液對(duì)13種植物病原真菌菌絲生長的抑制作用。菌餅直徑4 mm，以無菌水為對(duì)照。

1.3.2對(duì)植物病原細(xì)菌的抑制作用采用瓊脂擴(kuò)散法[23-24]測(cè)定共生菌胞外代謝物對(duì)6種供試病原細(xì)菌的抑制作用。供試發(fā)酵液測(cè)定用量為60 μL，以發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)48 h，十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

1.4YL001菌株發(fā)酵液及其乙酸乙酯提取物對(duì)番茄灰霉病的抑制作用

1.4.1發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病的抑制作用采用活體組織法分別測(cè)定 YL001菌株發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病防治的保護(hù)作用及治療作用，以50%腐霉利可濕性粉劑1 000倍稀釋液為藥劑對(duì)照，無菌水為空白對(duì)照，5 d后調(diào)查防治效果[24]。

1.4.2發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對(duì)番茄灰霉病的抑制作用采用活體組織法分別測(cè)定乙酸乙酯提取物對(duì)番茄灰霉病防治的保護(hù)作用及治療作用，以80%多菌靈可濕性粉劑800倍稀釋液為藥劑對(duì)照，無菌水為空白對(duì)照，5 d后調(diào)查防治效果。

1.4.3發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對(duì)番茄灰霉病菌的毒力采用生長速率法測(cè)定，以無菌水為空白對(duì)照。乙酸乙酯提取物毒力測(cè)定設(shè)6.81，3.41，1.70，0.85和0.43 mg/mL 5個(gè)質(zhì)量濃度。

1.5YL001菌株乙酸乙酯提取物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用

采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定，參見1.3.2節(jié)的方法。

1.6不同初始pH條件下 YL001菌株胞外代謝產(chǎn)物的差異分析

采用HPLC[2]及LC-MS分析不同初始pH培養(yǎng)條件下共生菌發(fā)酵液代謝產(chǎn)物乙酸乙酯提取物成分的差異。將乙酸乙酯提取所得的粗提物蒸干溶于8 mL甲醇，進(jìn)樣。色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18 column (250 mm×4.6 mm,3.5 μm) HPLC 柱；流速：1 mL/min ；流動(dòng)相：0～2 min 10%乙腈，2～20 min 10%～40%乙腈，20～40 min 40%～100%乙腈，40～45 min 100%～10%乙腈，45～55 min 10%乙腈；檢測(cè)波長：280 nm；液相進(jìn)樣量：5 μL。LC-MS體系選用Thermo ion trap LC-MS 系統(tǒng) (Thermo Scientific,USA)，離子源工作用陽離子模式，色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18 column (250 mm×4.6 mm,3.5 μm)；梯度洗脫條件同HPLC；流速0.4 mL/min；系統(tǒng)運(yùn)行溫度25 °C，進(jìn)樣體積10 μL。LC-MS條件：ESI噴霧電壓，一級(jí)質(zhì)譜(MS1)掃描范圍選擇m/z100～1 000。數(shù)據(jù)使用Xcalibur 2.1軟件分析。

1.7數(shù)據(jù)分析

作圖采用Excel 2007及Empower軟件，方差分析采用SPSS18.0軟件。

2結(jié)果與分析

2.1不同初始pH條件下X.nematophilaYL001發(fā)酵液對(duì)病原真菌的抑制作用

由表1可以看出，在不同初始pH條件下，X.nematophilaYL001發(fā)酵液對(duì)13種病原真菌菌絲生長均有不同程度的抑制作用，除小麥赤霉病菌外，隨著初始pH的增加，X.nematophilaYL001發(fā)酵液對(duì)各病原真菌的抑制作用也逐漸增強(qiáng)，尤其是對(duì)水稻瘟疫病菌、辣椒疫霉病菌、番茄灰霉病菌、蘋果輪紋病菌、番茄早疫病菌、甘藍(lán)黑斑病菌的抑制作用均有顯著提高。pH 8.5時(shí)YL001菌株發(fā)酵液對(duì)水稻瘟疫病菌、辣椒疫霉病菌、番茄灰霉病菌、蘋果輪紋病菌、番茄早疫病菌、甘藍(lán)黑斑病菌的抑制率分別為100.0%，91.34%，100.0%，100.0%，97.84%和99.28%。pH 4.5與pH 8.5時(shí)YL001發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病菌和油菜菌核病菌的抑制作用表現(xiàn)出極顯著差異，堿性初始培養(yǎng)條件更有利于X.nematophilaYL001發(fā)酵液胞外抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生。

表 1　不同初始pH條件下Xenorhabdus nematophila YL001發(fā)酵液對(duì)病原真菌的抑制作用

注：同行數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母者代表(DMRT 法)方差分析在P0.05水平上差異顯著。表2同。

Note:Different lowercase letters in each row mean significant difference atP0.05level by Duncan’s Multiple Range Test.The same for Table 2.

2.2不同初始pH條件下X.nematophilaYL001發(fā)酵液對(duì)病原細(xì)菌的抑制作用

從表2可以看出，隨著初始pH的升高，X.nematophilaYL001發(fā)酵液對(duì)植物病原細(xì)菌的抑制作用逐漸增強(qiáng)。在pH 8.5時(shí)，60 μL發(fā)酵液作用48 h后對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑達(dá)到21.00 mm。從測(cè)定結(jié)果可以看出,YL001發(fā)酵液對(duì)于革蘭氏陽性細(xì)菌具有較好的抑制作用。

表 2　不同初始pH 條件下Xenorhabdus nematophila YL001發(fā)酵液對(duì)病原細(xì)菌的抑制作用

2.3X.nematophilaYL001發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病的防治效果

由圖1可知，隨著初始pH的升高，X.nematophilaYL001發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病的防治效果也呈上升趨勢(shì)。各處理對(duì)番茄灰霉病菌的治療作用為16.83%～44.81%，均低于50%，且低于對(duì)照藥劑 (50%腐霉利1 000倍液)的治療作用(83.22%)；對(duì)番茄灰霉病的保護(hù)作用為45.17%～89.54%，其中在pH 8.5時(shí)保護(hù)作用達(dá)到89.54%，高于對(duì)照藥劑的保護(hù)作用(78.69%)。不同初始pH下YL001發(fā)酵液對(duì)番茄灰霉病的治療作用和保護(hù)作用存在差異，各處理對(duì)番茄灰霉病的保護(hù)作用優(yōu)于治療作用。

圖 1　不同初始pH條件下Xenorhabdus nematophila

2.4X.nematophilaYL001發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對(duì)番茄灰霉病的防治效果

由圖2可知，隨著初始pH的升高，X.nematophilaYL001發(fā)酵液乙酸乙酯提取物(2.5 mg/mL)對(duì)番茄灰霉病的防治效果也逐漸提高。各處理對(duì)番茄灰霉病的治療作用為3.91%～39.94%，均低于50%，且低于對(duì)照藥劑 (80%多菌靈1 mg/mL)的治療作用(56.63%)；對(duì)番茄灰霉病的保護(hù)作用為14.81%～61.22%，其中在初始pH 8.5時(shí)保護(hù)作用最好，防效為61.22%，但仍低于對(duì)照藥劑的保護(hù)作用(72.86%)。不同初始pH條件下，YL001發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對(duì)番茄灰霉病的治療作用和保護(hù)作用存在差異，各處理對(duì)番茄灰霉病的保護(hù)作用優(yōu)于治療作用。

圖 2不同初始pH條件下Xenorhabdusnematophila

YL001發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對(duì)番茄灰霉病的防治效果

Fig.2Inhibitory effect of ethyl acetate extract of

XenorhabdusnematophilaYL001 fermentation

liquid onBotrytiscinereawith different initial pH values

2.5X.nematophilaYL001發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對(duì)番茄灰霉病菌的毒力

由表3可以看出，不同初始pH條件下 YL001菌株發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對(duì)番茄灰霉病菌菌絲生長有不同程度的抑制作用，其中在初始pH 8.5時(shí)，乙酸乙酯提取物對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用最強(qiáng)，EC50為1.29 mg/mL。

表 3　不同初始pH 條件下Xenorhabdus nematophila YL001發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對(duì)番茄灰霉病菌的毒力

2.6X.nematophilaYL001發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用

由圖3可見，不同初始pH培養(yǎng)條件下X.nema-tophilaYL001發(fā)酵液乙酸乙酯提取物(用甲醇溶解)對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用隨pH的增加逐漸遞增。pH 8.5時(shí)，乙酸乙酯提取物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為14.65 mm，遠(yuǎn)高于pH 4.5時(shí)的2.45 mm，表明堿性條件可以提高YL001的抑菌活性。

2.7不同初始pH下X.nematophilaYL001發(fā)酵液代謝產(chǎn)物的差異

從圖4可以看出，在不同初始pH條件下，X.nematophilaYL001發(fā)酵液乙酸乙酯提取物成分中乙腈類化合物(Rhabduscin)、酰胺類化合物(Nematophin)和吲哚類化合物(Indole6、Indole7、Indole8)的含量具有明顯差異。

圖 3　不同初始pH條件下Xenorhabdus nematophila

圖 4pH 4.5、pH 7.0和pH 8.5培養(yǎng)條件下XenorhabdusnematophilaYL001發(fā)酵液代謝產(chǎn)物的差異

Fig.4Differential metabolite profiles ofXenorhabdusnematophilaYL001 fermentation liquid at pH of 4.5,7.0 and 8.5

保留時(shí)間在29.2 min(代謝峰1-Nematophin)、28.8 min(代謝峰2-Xenamatide)和16.77 min(代謝峰12-Rhabduscin)時(shí)，pH 8.5條件下的代謝峰高于pH 7.0和pH 4.5條件下；同時(shí)pH 4.5條件下，保留時(shí)間在29.2 min時(shí)沒有代謝峰，說明pH 4.5條件下基本沒有酰胺類化合物Nematophin生成。在保留時(shí)間分別為25.1 min(代謝峰6-Indole6)、26.6 min(代謝峰5-Indole7)、22.6 min(代謝峰7-Indole8) 時(shí)，pH 8.5、pH 7.0和pH 4.5培養(yǎng)條件下的代謝物輪廓存在明顯差異。與pH 7.0和pH 4.5相比，在pH 8.5培養(yǎng)條件下多產(chǎn)生了代謝峰8,10和15，說明pH 8.5培養(yǎng)條件下有新物質(zhì)產(chǎn)生。同時(shí)各培養(yǎng)條件下，其他代謝峰均存在顯著差異，也進(jìn)一步說明各培養(yǎng)條件下的次級(jí)代謝物種類和含量存在明顯差異。從表4中LC-MS分析結(jié)果可以看出，在pH 8.5、pH 7.0和pH 4.5條件下各活性物質(zhì)的相對(duì)含量也存在差異，尤其是在X.nematophilaYL001中起主要抑菌作用的活性物質(zhì)，如乙腈類化合物和酰胺類化合物的含量， 在pH 8.5時(shí)分別比在pH 4.5時(shí)高28.50和17.52倍。

表 4　Xenorhabdus neamatophila YL001主要活性物質(zhì)的相對(duì)含量

注：pH 8.5時(shí)各活性物質(zhì)的含量被當(dāng)作100.00。 同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母代表(DMRT 法)在P0.05水平上有顯著差異。

Note:The active substance contents at pH 8.5 were regarded as 100.00. Different lowercase letters in each column mean significant difference atP0.05level by Duncan’s Multiple Range Test.

3討論

產(chǎn)生具有抑菌活性的次生代謝產(chǎn)物是線蟲共生菌的普遍特征，不同種的共生菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)有較大差異，同一菌株在不同培養(yǎng)條件下的抑菌活性也有一定差異。這些差異主要是由pH、接種量、攪拌速度、溶氧量、培養(yǎng)基等培養(yǎng)條件通過影響共生菌的生長與代謝，進(jìn)而影響抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生及其活性而造成的。嗜線蟲致病桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)主要包括苯并吡喃類抗菌物質(zhì)Xenocoumacin(XCN)、乙腈類化合物、酰胺類化合物、吲哚衍生物等，其中乙腈類化合物具有較強(qiáng)的抑制細(xì)菌活性，尤其是對(duì)枯草芽孢桿菌活性影響顯著[26-27]；Indole7對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用影響明顯[26]；酰胺類化合物對(duì)多種細(xì)菌和真菌表現(xiàn)出抗生素的活性，尤其是對(duì)枯草芽孢桿菌以及番茄灰霉病和辣椒疫霉病有明顯的抑制作用[14]。

本研究結(jié)果表明，在不同初始pH條件下，X.nematophilaYL001胞外代謝產(chǎn)物的抑菌活性有顯著差異，初始pH 8.5時(shí)YL001發(fā)酵液及其乙酸乙酯提取物離體及活體抑菌活性均最佳。這與李騫[28]的研究結(jié)果堿性條件更有利于保持X.nematophilaYL001代謝產(chǎn)物的穩(wěn)定性及抑菌活性結(jié)果相符。LC-MS分析表明，不同初始pH條件下，X.nematophilaYL001發(fā)酵液中乙腈類化合物、酰胺類化合物、Indole6、Indole7以及Indole8等主要活性物質(zhì)的含量均存在一定差異，其中在pH 8.5時(shí)乙腈類化合物和酰胺類化合物的含量分別比 pH 4.5 時(shí)高28.50和17.52倍，結(jié)合pH 8.5，7.0及4.5條件下HPLC代謝產(chǎn)物分析結(jié)果，進(jìn)一步說明pH 8.5條件下YL001抑菌活性的提高可能是由于主要活性物質(zhì)產(chǎn)量的升高或者新的活性物質(zhì)產(chǎn)生所致。另外，在pH 8.5時(shí)，YL001菌株發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對(duì)番茄灰霉病的EC50為1.29 mg/mL，低于Ng等[29]發(fā)現(xiàn)的X.bovieniiA2胞外代謝物乙酸乙酯提取物對(duì)病原真菌的EC50，但遠(yuǎn)高于Li等[14]發(fā)現(xiàn)的酰胺類化合物對(duì)番茄灰霉病的最小抑菌質(zhì)量濃度(12 μg/mL)。這可能是由于不同種的共生菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)存在較大差異，同時(shí)也說明X.nematophilaYL001發(fā)酵液中活性成分的種類多于乙酸乙酯提取物中的活性成分，而對(duì)發(fā)酵液水溶性活性物質(zhì)的含量和種類仍需進(jìn)一步探討。

共生菌中存在一種雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)CpxRA[30]，主要感應(yīng)細(xì)胞包膜壓力、堿性pH等信號(hào)并調(diào)控抵御這些壓力的相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)?；赬.nematophilaATCC 19061、X.bovienii和P.luminescens全基因組序列分析[10-11]，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種合成共生菌代謝產(chǎn)物的基因簇，如isnA、isnB編碼的活性物質(zhì)Isocyanide和Rhabduscin1[2,27]。本實(shí)驗(yàn)室也已研究證明共生菌YL001中存在isnA、isnB等生物合成基因簇[31-32]，今后需要在不同pH對(duì)共生菌抑菌活性影響的研究基礎(chǔ)上，通過分子生物學(xué)手段對(duì)不同pH條件下雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)CpxRA及次生代謝產(chǎn)物的生物合成基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)進(jìn)行分析，以期探明pH調(diào)控共生菌抑菌物質(zhì)產(chǎn)生的分子機(jī)理，為共生菌抑菌物質(zhì)產(chǎn)生的代謝調(diào)控奠定基礎(chǔ)，并有望獲得新的抑菌活性物質(zhì)。

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Effect of initial pH on antimicrobial activity and metabolism ofXenorhabdusneamatophilastrain YL001

GUO Shu-qi1,XU Peng1,LU Mei1,WANG Ze-yu2,WANG Yong-hong1,ZHANG Xing1

(1ResearchandDevelopmentCenterofBiorationalPesticides,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2High-TechSchool,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 This study aimed to provide theoretical basis for improving bacteriostatic activity of Xenorhabdus neamatophila YL001 strain through investigating the effect of initial pH on its antimicrobial activity.【Method】 Antifungal activities of fermented liquid and ethylacetate extract of X.nematophila YL001 under different initial pH values of 4.5,5.5,6.5,7.0,7.5 and 8.5 were measured using growth rate method,agar diffusion method,and biopsy method.The differences in metabolism of ethylacetate extract of X.neamatophila YL001 were also analyzed using HPLC and LC-MS.【Result】 Antimicrobial activities of fermented liquid and its ethylacetate extract were improved with the increase of initial pH.Fermented liquid of YL001 exhibited highest inhibitory effect on mycelia growth of Magnaporthe grisea,Phytophthora capsici,Botrytis cinerea,Physalospora piricola,Alternaria solani,Alternaria brassicae,and Bacillus subtilis at pH of 8.5.Ethylacetate extract of fermented liquid exhibited high inhibitory activity against Botrytis cinerea with EC50of 1.29 mg/mL and against Bacillus subtilis with antibacterial zone diameter of 14.65 mm.The therapeutic and protective effects of YL001 on B.cinerea were also improved with the increase of initial pH.The protective efficacy was higher than therapeutic efficacy.HPLC and LC-MS revealed that the production of metabolites was regulated by culture conditions.The metabolites of organic extracts from X.neamatophila YL001 had significant difference at pH values of 8.5,7.0 and 4.5.【Conclusion】 The initial pH significantly affected the antimicrobial activity and metabolism of X.neamatophila YL001,and alkaline condition was conductive to produce active substance.

Key words:Xenorhabdus neamatophila;initial pH;extracellular metabolites;antimicrobial activity

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-05-0314:0510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.06.019

[收稿日期]2014-10-11

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31171910)；陜西省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2014JZ004)；中央高校基本科研創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目(Z109021304)

[作者簡介]郭樹奇(1989-)，男，陜西武功人，在讀碩士，主要從事農(nóng)藥毒理學(xué)和微生物代謝研究。E-mail:guoshuqi1989@126.com [通信作者]王永宏(1968-)，男，陜西鳳翔人，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事微生物制藥及發(fā)酵技術(shù)研究。 E-mail：yhwang@nwsuaf.edu.cn

[中圖分類號(hào)]S482.2+92

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)06-0132-09

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160503.1405.038.html