李景艷，高　飛，周宜君，王　榮

(1 安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230601；2 阜陽(yáng)師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽(yáng) 236037；3 中央民族大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081)

鹽芥GRP7基因的克隆和逆境表達(dá)分析

李景艷1，2，高飛3，周宜君3，王榮2

(1 安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230601；2 阜陽(yáng)師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽(yáng) 236037；3 中央民族大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081)

[摘要]【目的】 從抗逆植物鹽芥中分離GRP7(glycine-rich RNA-binding protein7，GRP7)基因，為進(jìn)一步揭示GRPs基因在鹽芥逆境應(yīng)答中的作用機(jī)制及生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?利用鹽芥GRP7基因的EST序列設(shè)計(jì)特異引物，克隆GRP7基因的全長(zhǎng)序列，對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行分析，并對(duì)TsGRP7基因的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用qRT-PCR技術(shù)，檢測(cè)GRP7基因在不同逆境脅迫、不同組織中的表達(dá)情況。【結(jié)果】 TsGRP7基因編碼區(qū)全長(zhǎng)522 bp，編碼173個(gè)氨基酸；TsGRP7蛋白的N端第9～82位氨基酸之間有1個(gè)RNA識(shí)別基序(RRM)，RRM中含有保守的RNP-1和RNP-2亞結(jié)構(gòu)域；多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，鹽芥和擬南芥親緣關(guān)系較近；啟動(dòng)子序列分析表明，鹽芥GRP7啟動(dòng)子區(qū)含有HSE熱激響應(yīng)元件、LTR低溫應(yīng)答元件等多個(gè)逆境相關(guān)的順式作用元件，表明鹽芥GRP7基因參與逆境響應(yīng)。qRT-PCR分析表明，鹽芥GRP7基因在不同逆境脅迫條件及不同組織中表達(dá)不同。【結(jié)論】 鹽芥GRP7基因參與低溫、高鹽、PEG等逆境響應(yīng)。

[關(guān)鍵詞]鹽芥；GRP7；qRT-PCR；逆境脅迫

真核生物中，基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上均受到嚴(yán)格的調(diào)控?；虮磉_(dá)調(diào)控的第一步，即轉(zhuǎn)錄調(diào)控曾被認(rèn)為是基因表達(dá)調(diào)控的主要環(huán)節(jié)，通過對(duì)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制越來越深入的了解，現(xiàn)在逐漸認(rèn)識(shí)到轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平上的調(diào)控對(duì)基因表達(dá)同樣起著重要的作用。有研究表明，轉(zhuǎn)錄后和翻譯后的調(diào)控對(duì)真核生物適應(yīng)生物及非生物脅迫有一定的幫助[1]，這個(gè)過程主要通過不同的RNA結(jié)合蛋白來進(jìn)行，尤其在調(diào)控涉及RNA的以下幾個(gè)過程，如mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)、mRNA穩(wěn)定性的維持、mRNA的翻譯控制等[1-5]。典型的RNA結(jié)合蛋白(RBPs)含有1個(gè)或2個(gè)RNA識(shí)別基序(RNA-recognition motif)，主要位于其N-末端和各種輔助基序或區(qū)域的C-末端，例如富含谷氨酸的區(qū)域、富含精氨酸的基序、RGG box、鋅指結(jié)構(gòu)基序及SR或RD重復(fù)區(qū)域等[6]。最新研究表明，RBPs在不同的植物基因組序列中被發(fā)現(xiàn)，包括擬南芥、水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum)、煙草、油菜和亞麻[6]，這表明RBPs參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性等代謝過程[3,7-8]。

現(xiàn)已在許多植物中鑒定出富含甘氨酸的RNA結(jié)合蛋白(GRPs)，其N端含有1個(gè)或多個(gè)RNA識(shí)別基序(RRM)，在C端有1個(gè)富含甘氨酸的區(qū)域[9-10]。盡管對(duì)GRPs的功能研究還不是特別深入，但已有研究表明，GRPs的表達(dá)受一系列的外部刺激調(diào)控，包括寒冷、水分、植物激素脅迫、損傷、病毒感染等[10]。

近年來，一種新的抗非生物逆境研究模式植物，即鹽芥(Thellungiellasalsugineum)越來越受到人們的關(guān)注。鹽芥是擬南芥的近緣植物，表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)分析表明，鹽芥和擬南芥cDNA和氨基酸序列的同源性高達(dá)90%～95%[11]，鹽芥在植物抗非生物逆境方面有廣闊的應(yīng)用前景，能耐受較高程度的高鹽、低溫和干旱脅迫[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥8個(gè)GRP家族中的AtGRP2和AtGRP7[13]在寒冷脅迫中起作用[14-16]，推測(cè)鹽芥中的TsGRP7基因可能也參與逆境響應(yīng)。本研究擬從鹽芥中克隆GRP7基因，用生物信息學(xué)方法分析其結(jié)構(gòu)特征進(jìn)而推測(cè)其蛋白序列特征，對(duì)其8種同源蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，利用qRT-PCR分析TsGRP7基因在高鹽、低溫、干旱條件下的基因表達(dá)模式，以期為GRPs的功能研究提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

Trizol試劑，購(gòu)于invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶及qRT-PCR試劑盒，均購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司；膠回收試劑盒，購(gòu)自百泰克生物技術(shù)有限公司；T4DNA連接酶及pGEM?-T載體，購(gòu)自Promega公司。引物合成及片段測(cè)序由華大科技有限公司完成。

1.2試驗(yàn)材料的處理

鹽芥種子播種在培養(yǎng)基質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)土、蛭石、珍珠巖 (質(zhì)量比質(zhì)量比為2∶1∶1)的混合土中，每3 d澆1次水。生長(zhǎng)條件為：溫度23 ℃(光)/18 ℃(暗)，光照周期16 h(光)/8 h(暗)，相對(duì)濕度60%(光)/80%(暗)。待其生長(zhǎng)4周后移栽至新的培養(yǎng)基質(zhì)中(m(蛭石)∶m(珍珠巖)=1∶1)，期間每3 d澆1次Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。待其生長(zhǎng)至6周后，取少量葉片迅速凍于液氮中，用于基因克隆。用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配制300 mmol/L NaCl溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%PEG6000溶液，然后將鹽芥在配制好的NaCl溶液、PEG6000溶液及4 ℃低溫條件下分別處理0，1，3，6和24 h，分別模擬高鹽、干旱和低溫脅迫處理，同時(shí)以正常培養(yǎng)鹽芥為對(duì)照，之后取各處理鹽芥的適當(dāng)葉片和根迅速凍于液氮中，用于基因的組織特異性表達(dá)分析。

1.3TsGRP7基因的克隆

用Trizol法提取鹽芥的總RNA，并用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)其完整性，用NanoDrop 2000測(cè)定DNA濃度和OD260/280。以RNA為模板，根據(jù)天根FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明書操作得到cDNA后，低溫保存用于后續(xù)試驗(yàn)。

利用擬南芥AtGRP7序列(序列注冊(cè)號(hào)為AT4G13850)進(jìn)行Blast分析，找到與AtGRP7序列同源性最高的鹽芥GRP7的EST序列，根據(jù)TsGRP7的CDS序列，用Primer3.0軟件(http://primer3.ut.ee/)在線設(shè)計(jì)基因克隆引物，所得引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，36個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。PCR反應(yīng)體系50 μL：cDNA模板2 μL，上、下游引物各2 μL，2×TaqPCR MasterMix 25 μL，ddH2O 19 μL。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分離后進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物與pGEM?-T載體在T4DNA連接酶作用下4 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過藍(lán)白斑篩選得到陽(yáng)性克隆，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，將得到的單一條帶所對(duì)應(yīng)的菌落挑出送華大科技有限公司測(cè)序。

表 1　TsGRP7基因克隆和熒光定量PCR相關(guān)的引物序列

1.4生物信息學(xué)分析

運(yùn)用生物信息學(xué)軟件DNAMAN7.0查找TsGRP7基因全長(zhǎng)序列的開放閱讀框(ORF)，翻譯成氨基酸序列并分析等電點(diǎn)、氨基酸數(shù)目、相對(duì)分子質(zhì)量等理化性質(zhì)。利用在線工具NetPhos2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos)分析其氨基酸序列潛在的磷酸化位點(diǎn)；用在線工具TMHMM2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)；用在線工具SignaIP3.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)分析其信號(hào)肽；用在線工具WoLF PSORT(http://wolfpsort.org)進(jìn)行亞細(xì)胞定位；用在線程序SMART進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析；利用NCBI的BlastP功能獲得與TsGRP7氨基酸序列同源性較高的其他植物的氨基酸序列，用DNAMAN和MEGA5.0軟件進(jìn)行蛋白多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

用Phytozome網(wǎng)站和TsGRP7 CDS序列找到TsGRP7基因的啟動(dòng)子序列，運(yùn)用在線工具PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析TsGRP7基因編碼序列上游1 000 bp啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)存在的順式作用元件。

1.5表達(dá)模式分析

從低溫、高鹽、PEG6000脅迫處理的鹽芥中提取RNA，電泳檢測(cè)其完整性，根據(jù)天根FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明轉(zhuǎn)錄成cDNA，用NanoDrop 2000測(cè)定cDNA濃度，稀釋成統(tǒng)一濃度后用于熒光定量PCR。利用在線工具Primer 3.0軟件(http://primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，并以鹽芥的Ubiquitin10基因?yàn)閮?nèi)參基因，所用引物序列如表1所示。按照天根FastFire qPCR PreMix試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，用2-ΔΔCt法對(duì)熒光定量PCR的結(jié)果進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1TsGRP7基因的克隆

Trizol法提取鹽芥的總RNA，用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)其完整性，結(jié)果得到28S、18S、5S共3條清晰條帶，且28S條帶亮度約是18S的2倍。用NanoDrop 2000檢測(cè)提取的RNA濃度，OD260/280為 2.10，說明提取的RNA完整性較好、純度較高，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，使用克隆引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果(圖1)表明，PCR產(chǎn)物為單一、明亮的條帶，大小為500～600 bp。PCR產(chǎn)物膠回收后，與T載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞。取5個(gè)陽(yáng)性菌落培養(yǎng)后測(cè)序，測(cè)序得到的序列與TsGRP7 EST序列中的相應(yīng)區(qū)域完全相同，確認(rèn)該片段為鹽芥TsGRP7基因序列。

2.2TsGRP7基因的序列分析

TsGRP7基因編碼區(qū)全長(zhǎng)522 bp，編碼173個(gè)氨基酸(圖2)，其中19個(gè)為酸性氨基酸，18個(gè)為堿性氨基酸。DNAMAN7.0軟件分析表明，預(yù)測(cè)的蛋白分子質(zhì)量為16.62 ku，等電點(diǎn)為5.54。

NetPhos 2.0 Server分析表明，TsGRP7蛋白有13個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，包括8個(gè)Ser、3個(gè)Thr和2個(gè)Tyr位點(diǎn)；TMHMM 2.0 Server在線預(yù)測(cè)表明，該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)，不是跨膜蛋白；在線工具SignaIP3.0 Server分析表明，TsGRP7蛋白無信號(hào)肽，不是分泌蛋白；使用WoLF PSORT進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，預(yù)測(cè)該蛋白定位于細(xì)胞核中；用在線工具SMART對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域的分析表明，TsGRP7蛋白的N端第9～82位氨基酸之間有1個(gè)RNA識(shí)別基序(RRM)；由氨基酸序列可知，其C端有富含甘氨酸的區(qū)域。RRM中含有保守的RNP-1 (GFGFVTF，50～56位氨基酸)和RNP-2(CFVGGL， 10～15位氨基酸)亞結(jié)構(gòu)域，在C端有1個(gè)arginine-glycine-rich (RGG)位點(diǎn)，這是核定位GRP蛋白的特征位點(diǎn)。以上分析結(jié)果表明，TsGRP7蛋白是一個(gè)典型的富含甘氨酸的RNA結(jié)合蛋白。

圖 1　鹽芥TsGRP7基因PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

圖 2　TsGRP7基因的ORF序列及編碼的氨基酸序列

2.3TsGRP7氨基酸序列同源性及進(jìn)化樹分析

將TsGRP7氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行BlastP比對(duì)，找到其在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、油菜(Brassicacampestris)、毛果楊(Populustrichocarpa)、高山離子芥(Chorisporabungeana)、水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)、煙草(Nicotianatabacum)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)中的同源蛋白。對(duì)這9種蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖3所示。再進(jìn)一步構(gòu)建TsGRP7蛋白和其他8種同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖4。結(jié)果表明，鹽芥的GRP7蛋白與油菜中同源蛋白的同源性最高，其次是高山離子芥、擬南芥，與水稻中同源蛋白的同源性最低，說明鹽芥與蕓苔屬、擬南芥屬親緣關(guān)系較近。

圖 3　TsGRP7與其他8同源性蛋白氨基酸序列的多重比較

圖 4　TsGRP7與其他8種同源性蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.4TsGRP7基因啟動(dòng)子序列分析

順式作用元件(cis-acting element)是啟動(dòng)子區(qū)域中序列特異性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的精確起始和轉(zhuǎn)錄效率，從而在基因表達(dá)調(diào)控過程中起著重要的作用。使用plantCARE軟件預(yù)測(cè)TsGRP7基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件的種類和作用，有助于揭示TsGRP7基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。分析結(jié)果(表2)表明，TsGRP7基因啟動(dòng)子區(qū)含有多種與植物非生物脅迫、生物脅迫和激素應(yīng)答有關(guān)的順式作用元件，表明TsGRP7參與了鹽芥的非生物脅迫和生物脅迫應(yīng)答。

2.5TsGRP7的逆境表達(dá)模式分析

為進(jìn)一步揭示TsGRP7應(yīng)答逆境的表達(dá)模式，以鹽芥Ubiquitin10為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR方法分析高鹽、干旱、低溫逆境條件下TsGRP7基因在鹽芥根和葉中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖5所示。

表 2　TsGRP7基因啟動(dòng)子區(qū)中可能參與逆境脅迫的順式作用元件

圖 53種逆境脅迫下鹽芥葉和根中TsGRP7基因的表達(dá)分析

A.20% PEG6000模擬干旱處理；B.300 mmol/L NaCl處理；C.4 ℃低溫處理

Fig.5Expression patterns ofTsGRP7 in response to three stresses

A.20% PEG treatment;B.300 mmol/L NaCl treatment;C.4 ℃ cold treatment

從圖5-A可知，在20%PEG6000模擬干旱處理鹽芥的24 h中，鹽芥葉片中的TsGRP7表達(dá)量總體呈下調(diào)趨勢(shì)，干旱處理6 h時(shí)表達(dá)量最低，為對(duì)照的0.06倍；24 h時(shí)表達(dá)量有所提高，為對(duì)照的0.86倍。鹽芥根中的TsGRP7表達(dá)量整體表現(xiàn)為下調(diào)趨勢(shì)，與葉中不同，干旱處理1，3 h時(shí)的TsGRP7表達(dá)量分別為對(duì)照的1.24，2.02倍，6 h時(shí)下調(diào)為對(duì)照的0.26倍，24 h時(shí)為對(duì)照的0.74倍。

圖5-B顯示，在300 mmol/L NaCl處理鹽芥過程中，鹽芥葉中的TsGRP7表達(dá)量下調(diào)，高鹽處理24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最低，為對(duì)照的0.23倍；與葉相反，鹽芥根中的TsGRP7表達(dá)量上調(diào)，高鹽處理1 h時(shí)表達(dá)量最高，為對(duì)照的8.5倍，24 h時(shí)仍為對(duì)照的3.67倍。

圖5-C表明，在4 ℃低溫脅迫處理過程中，鹽芥葉中的TsGRP7表達(dá)量于處理3 h時(shí)達(dá)到最高水平，為對(duì)照的2.45倍，處理24 h時(shí)表達(dá)量又有所下降，但仍為對(duì)照的2.14倍；鹽芥根中的TsGRP7表達(dá)量上調(diào)，6 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，為對(duì)照的16.86倍。上述結(jié)果表明，在不同逆境脅迫下TsGRP7的表達(dá)趨勢(shì)不同，而在同一脅迫條件下，不同組織中TsGRP7的表達(dá)趨勢(shì)也不相同。

3討論

植物中存在兩大類GRP蛋白：一類在N端具有典型的真核生物信號(hào)肽序列，信號(hào)肽序列引導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并最終經(jīng)細(xì)胞分泌系統(tǒng)定位于質(zhì)膜外的細(xì)胞壁中；另一類在N端含有90～100個(gè)氨基酸組成的RNA結(jié)合功能域保守序列(RRM)，其中包括2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域RNP-1和RNP-2，它們定位于細(xì)胞核中，可與新生mRNA前體分子結(jié)合，參與形成異源核糖核蛋白復(fù)合體[17]。本研究從鹽芥中克隆了富含甘氨酸的RNA結(jié)合蛋白(TsGRP7)，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對(duì)其氨基酸序列特征進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：TsGRP7蛋白無信號(hào)肽，不是分泌蛋白；TsGRP7蛋白N端有1個(gè)典型的RNA識(shí)別基序(RRM)，RRM中含有保守的RNP-1(GFGFVTF，50～56位氨基酸)和RNP-2(CFVGGL，10～15位氨基酸)亞結(jié)構(gòu)域，在C-端有arginine-glycine-rich (RGG)位點(diǎn)，這是核定位GRP蛋白的特征位點(diǎn)。缺失分析表明，RNP-1、RNP-2和富含甘氨酸結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基是RNA結(jié)合活性所必需的[17]。許多逆境因子，包括冷害、致傷、干旱、脫落酸(ABA)處理等均能有效誘導(dǎo)GRPs基因家族的RNA表達(dá)水平顯著提高[14,18]。鹽芥與擬南芥近緣，鹽芥具有很強(qiáng)的抗低溫、抗干旱和耐鹽的能力。本研究通過鹽芥TsGRP7和其他8種同源蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)鹽芥GRP7與擬南芥同源蛋白的一致性高達(dá)94%；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析也表明，鹽芥與擬南芥有較近的親緣關(guān)系。

有研究表明，AtGRP7影響擬南芥的生長(zhǎng)及其在高鹽、干旱、低溫下的耐受性，尤其于低溫時(shí)通過調(diào)控mRNA在細(xì)胞中的輸出增加擬南芥的耐受性[19]。GRP7的表達(dá)受到不同脅迫因素的調(diào)節(jié)，低溫脅迫會(huì)顯著提高GRP7的表達(dá)水平[14,20]，而高鹽和干旱脅迫則會(huì)下調(diào)擬南芥中GRP7的表達(dá)[21]。本研究用生物信息學(xué)方法對(duì)TsGRP7基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)含有多個(gè)響應(yīng)逆境脅迫的順式作用元件，說明這些順式作用元件可能與相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合進(jìn)而調(diào)節(jié)非生物脅迫下鹽芥TsGRP7基因的表達(dá)。RT-PCR分析結(jié)果表明，在24 h 20% PEG6000模擬干旱處理鹽芥的過程中，其葉和根中的TsGRP7表達(dá)量下調(diào)；在300 mmol/L NaCl處理鹽芥的24 h中，其葉中的TsGRP7表達(dá)量下調(diào)，而根中的TsGRP7表達(dá)量上調(diào)，說明鹽芥根和葉對(duì)逆境脅迫的耐受程度不同；在24 h 4 ℃低溫脅迫鹽芥的過程中，其葉和根中的TsGRP7表達(dá)量均上調(diào)。TsGRP7基因的表達(dá)也受到不同脅迫因素的調(diào)節(jié)，TsGRP7基因啟動(dòng)子預(yù)測(cè)得到的順式作用元件在基因表達(dá)調(diào)控過程中起著重要作用，尤其是在逆境脅迫中。

有研究表明，大腸桿菌在受到低溫脅迫時(shí)其GRP7蛋白發(fā)揮著RNA分子伴侶的作用[21]。對(duì)擬南芥GRP7蛋白細(xì)胞定位和功能的研究表明，在高鹽、干旱脅迫下，擬南芥GRP7蛋白表達(dá)會(huì)抑制種子的萌發(fā)、幼苗的生長(zhǎng)并增強(qiáng)植物的逆境耐受性，尤其可通過調(diào)節(jié)mRNA在保衛(wèi)細(xì)胞的輸送，以增強(qiáng)擬南芥的低溫耐受能力[19]。對(duì)高山離子芥低溫條件下基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)組的研究表明，CbGRP在低溫條件下表達(dá)量上調(diào)[10]。CbGRP是RNA的分子伴侶，在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。更有蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，TsGRP7蛋白通過在低溫脅迫下表達(dá)量上調(diào)來增強(qiáng)RNA的代謝，進(jìn)而賦予鹽芥低溫耐受能力[22]。本研究對(duì)TsGRP7表達(dá)模式的分析表明，鹽芥TsGRP7基因在4 ℃低溫條件下表達(dá)量上調(diào)，推測(cè)TsGRP7蛋白可能通過參與mRNA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的輸送，來增強(qiáng)鹽芥的低溫耐受性。

總之，本研究為進(jìn)一步了解鹽芥GRP7基因參與高鹽、干旱、低溫等逆境反應(yīng)的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，并且本研究從鹽芥中克隆了GRP7基因，為下一步構(gòu)建表達(dá)載體及進(jìn)行轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)的驗(yàn)證提供了條件。

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Cloning and stress expression ofGRP7 inThellungiellasalsugineum

LI Jing-yan1,2,GAO Fei3,ZHOU Yi-jun3,WANG Rong2

(1SchoolofLifeScience,AnhuiUniversity,Hefei,Anhui230601,China;2CollegeofLifeScience,FuyangNormalCollege,Fuyang,Anhui236037,China;3CollegeofLifeandEnvironmentalScience,MinzuUniversityofChina,Beijing100081,China)

Abstract:【Objective】 The glycine-rich RNA-binding protein7 (GRP7) gene was isolated from Thellungiella salsugineum to understand the role of GRPs and lay the foundation for further function analysis of GRPs in stress response.【Method】 In this experiment,specific primers of TsGRP7 were designed based on EST sequence and full-length cDNA of TsGRP7 gene was isolated.The conserved domain and potential cis-element in promoter region were analyzed and phylogenetic analysis was performed.Quantitative real-time PCR analysis was carried out under different stresses in different tissues.【Result】 The 522 bp coding region of TsGRP7 encoded 173 amino acid residues.The region between residues 9 and 82 was a typical RNA-recognition motif,containing conserved RNP-1 and RNP-2 subdomains.Multiple sequence alignment and system evolution analysis of TsGRP7 protein reveled that Thellungiella salsugineum had higher identity with homologous protein in Arabidopsis.Promoter sequence analysis by PlantCARE showed that multiple cis-elements were associated with abiotic and biotic stress localized in promoters,such as HSE,LTR,ABRE,Box-W1 and P-box,indicating that the TsGRP7 gene involved in stree response.Quantitative real-time PCR analysis revealed that the expression of TsGRP7 gene was specific under different stresses and in different tissues.【Conclusion】 The TsGRP7 gene involved in responses to low temperature,high salt and drought stress.

Key words:Thellungiella salsugineum;GRP7;qRT-PCR;stress

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-05-0314:0510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.06.021

[收稿日期]2015-12-25

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31070361)；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1408085MC44)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(1112KYQN31，0910KYZY43)；國(guó)家985工程項(xiàng)目(MUC98507-08)；高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃項(xiàng)目(B08044)；國(guó)家民委科研項(xiàng)目(10ZY01)

[作者簡(jiǎn)介]李景艷(1988―)，女，河南項(xiàng)城人，在讀碩士，主要從事生化與分子生物學(xué)研究。E-mail：602419592@qq.com E-mail：wangrbnu@aliyun.com

[通信作者]王榮(1968―)，女，河北石家莊人，教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物分子遺傳學(xué)研究。

[中圖分類號(hào)]Q945.78；Q943.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1671-9387(2016)06-0150-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160503.1405.042.html