李春沁，劉美琳，董佳悅，王紫燕，張梅

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波棱瓜子中總木脂素含量測(cè)定方法研究

李春沁，劉美琳，董佳悅，王紫燕，張梅

［摘要］目的：建立一種波棱瓜子中總木脂素含量測(cè)定的方法。方法：以木脂素balanophonin為對(duì)照品，采用變色酸-硫酸顯色體系，于566 nm下測(cè)定波棱瓜子總木脂素含量。結(jié)果：木脂素balanophonin在5.01～17.535 μg.mL-1與吸光度呈良好線性關(guān)系（n=6，r=0.999 1），平均加樣回收率為98.36%，RSD=2.33%（n=6）。結(jié)論：該含量測(cè)定方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，適用于波棱瓜子總木脂素的含量測(cè)定。

［關(guān)鍵詞］波棱瓜子；總木脂素；balanophonin；含量測(cè)定；分光光度法

［作者單位］成都中醫(yī)藥大學(xué) 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

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波棱瓜子系葫蘆科波棱瓜屬植物波棱瓜（又名“塞季美朵”）Herpetospermum caudigerum Wall.（H. pedunculosum（Ser.）Baill）的干燥成熟種子，是一種常用藏藥。具有清熱解毒、去火降熱、助消化之功效，治療肝熱、黃疸型傳染性肝炎等癥［1］?；瘜W(xué)研究表明，波棱瓜子中含有木脂素類(lèi)、香豆素類(lèi)、生物堿、多糖、鞣質(zhì)、氨基酸、油脂及微量元素等多種成分，其中又以木脂素類(lèi)成分及脂肪油類(lèi)成分研究最多。藥理研究表明，波棱瓜子中木脂素類(lèi)成分為其抗肝損傷主要活性成分［2-3］。然而波棱瓜子中總木脂素類(lèi)成分含量及測(cè)定方法尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究基于其含有的特殊基團(tuán)酚羥基（若選擇該法則考慮排除其他大類(lèi)成分的干擾）及文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定木脂素類(lèi)成分的含量測(cè)定方法對(duì)波棱瓜子中總木脂素含量測(cè)定方法進(jìn)行了研究，旨在建立一種快速、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便的測(cè)定波棱瓜子中總木脂素含量的方法。

1　材料

1.1 藥材

波棱瓜子，2014年3月購(gòu)于四川甘孜，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院裴瑾教授鑒定為葫蘆科植物波棱瓜Herpetospermum caudigerum Wall.的干燥成熟種子。

1.2 儀器

UV-2600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；BT 125D型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.3 試劑

對(duì)照品balanophonin（實(shí)驗(yàn)室自制）；蒸餾水（實(shí)驗(yàn)室自制）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取波棱瓜子藥材粉末（過(guò)50目篩）約1.5 g，加60 mL石油醚加熱回流脫脂，重復(fù)兩次，每次1 h，將脫脂后殘?jiān)鼡]干，加95%乙醇60 mL，加熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液，過(guò)濾，濾液蒸干，用甲醇溶解定容至25 mL，備用。2.1.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取對(duì)照品balanophonin適量，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，制成質(zhì)量濃度為0.501 mg.mL-1的balanophonin對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2 顯色方法和測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

福林酚顯色法［4］：精密吸取供試品溶液50 μL，加入福林酚試劑0.1 mL，搖勻后加入10%Na2CO35 mL，加水定容至10 mL。試劑空白同法操作。200～800 nm掃描測(cè)定吸收光譜，見(jiàn)圖1。

普魯士藍(lán)顯色法［5］：精密吸取供試品溶液100 μL，依次加入0.1 mol.L-1三氯化鐵溶液0.1 mL、0.08 mol.L-1鐵氰化鉀溶液0.1 mL、0.1 mol.L-1鹽酸0.1 mL，加水定容至10 mL，試劑空白同法操作。200～800 nm掃描測(cè)定吸收光譜，見(jiàn)圖1。

磷鉬酸顯色法［6］：精密吸取供試品溶液50 μL，加入磷鉬酸顯色劑0.1 mL，搖勻后于70 ℃水浴揮干溶劑，然后沸水浴15 min，流水冷卻至室溫后加水定容至10 mL，試劑空白同法操作。200～800 nm掃描測(cè)定吸收光譜，見(jiàn)圖1。

沒(méi)食子酸-硫酸顯色法：精密吸取供試品溶液50 μL 置10 mL刻度試管中，于70℃水浴揮干溶劑后，依次加入沒(méi)食子酸0.5 mL、濃硫酸3 mL、蒸餾水1.5 mL，搖勻，沸水浴30 min后取出流水冷卻至室溫，試劑空白同法操作。200～800 nm掃描測(cè)定吸收光譜，見(jiàn)圖1。

變色酸-硫酸顯色法［7］：精密吸取對(duì)照品溶液200 μL和供試品溶液50 μL分別置10 mL刻度試管中，于70 ℃水浴揮干溶劑后，依次加入10%變色酸水溶液0.5 mL、濃硫酸3 mL、蒸餾水1.5 mL，搖勻，沸水浴30 min后取出流水冷卻至室溫，試劑空白同法操作。400～800 nm掃描測(cè)定吸收光譜，見(jiàn)圖2。綜合比較上述5種顯色方法吸收光譜圖及專屬性，用變色酸-硫酸顯色后，balanophonin對(duì)照品、供試品吸收光譜圖基本一致，且均在566 nm處有最大吸收，專屬性良好。故選擇變色酸-硫酸反應(yīng)顯色法，在566 nm波長(zhǎng)處測(cè)定波棱瓜子總木脂素含量。

圖1 吸收光譜圖（“a”福林酚顯色法，“b”普魯士藍(lán)顯色法，“c”磷鉬酸顯色法，“d”沒(méi)食子酸-硫酸顯色法）

圖2 變色酸-硫酸顯色法吸收光譜圖（“e”對(duì)照品， “f”供試品）

2.3 顯色條件考察

2.3.1 濃硫酸用量考察 精密吸取6份供試品溶液，每份60 μL，于70℃水浴揮干溶劑后，各加入10%變色酸水溶液0.5 mL，再分別加入濃硫酸3，4，5，6，7，8 mL，并加蒸餾水定容至10 mL，搖勻，沸水浴30 min后取出流水冷卻至室溫，試劑空白同法操作。依法于566 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果表明濃硫酸用量為7 mL時(shí)，A最大（表1）。

2.3.2 變色酸用量考察 精密吸取6份供試品溶液，每份60 μL，于70 ℃水浴揮干溶劑后，分別加入10%變色酸水溶液0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，再依次加入濃硫酸7 mL，并加蒸餾水定容至10 mL，搖勻，沸水浴30 min后取出流水冷卻至室溫，試劑空白同法操作。依法于566 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果表明變色酸用量為1.5 mL時(shí)，A最大（表1）。

2.3.3 顯色時(shí)間考察 精密吸取6份供試品溶液，每份60 μL，于70 ℃水浴揮干溶劑后，依次加入10%變色酸水溶液1.5 mL、濃硫酸7 mL，并加蒸餾水定容至10 mL，搖勻，置沸水浴中分別加熱10，20，30，40，50，60 min后取出流水冷卻至室溫，試劑空白同法操作。依法于566 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果表示顯色時(shí)間為40 min時(shí)，A最大（表1）。

表1 顯色條件考察

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品溶液100，150，200，250，300，350 μL于70 ℃水浴揮干溶劑后，依次加入10%變色酸水溶液1.5 mL、濃硫酸7 mL，并加蒸餾水定容至10 mL，搖勻，置沸水浴中加熱40 min后取出流水冷卻至室溫，于566 nm處測(cè)定吸光度。以balanophonin對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程Y=0.0464X-0.0202（n=6，r=0.999 1）。結(jié)果表明balanophonin在5.01～17.535 μg.mL-1的線性關(guān)系良好。

2.5 精密度考察

精密吸取對(duì)照品溶液200 μL，按照2.4項(xiàng)下操作，于566 nm處，連續(xù)測(cè)定6次吸光度，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.15%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性考察

取波棱瓜子藥材粉末6份，每份約1.5 g，精密稱定，按2.1.1項(xiàng)下制備供試品溶液，分別精密吸取50 μL，按照2.4項(xiàng)下操作測(cè)定吸光度，RSD=2.52%，表明重現(xiàn)性較好。

2.7 穩(wěn)定性考察

精密吸取對(duì)照品溶液150 μL、供試品溶液50 μL，按照2.4項(xiàng)下操作顯色后放置0，0.5，1，2，4，12 h測(cè)定吸光度。結(jié)果表明balanophonin和供試品溶液顯色后12 h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD分別為0.91%，2.27%。

2.8 回收率試驗(yàn)

取已知含量波棱瓜子藥材粉末6份，每份約0.75 g，精密稱定，分別精密加入balanophonin對(duì)照品適量，按照2.1.1項(xiàng)下制備樣品溶液。精密吸取50 μL，按照2.4項(xiàng)下操作測(cè)定吸光度，并計(jì)算回收率為98.36%，RSD=2.33%，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)

2.9 樣品含量測(cè)定

分別取3批樣品，按照2.1.1項(xiàng)下制備供試品溶液，按照2.4項(xiàng)下操作測(cè)定吸光度，測(cè)定波棱瓜子中總木脂素的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 波棱瓜子總木脂素含量測(cè)定

3　討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，變色酸-硫酸反應(yīng)顯色法可用于測(cè)定某藥材中總木脂素含量是因?yàn)樵撍幉闹心局仡?lèi)化合物分子中均含有或大多數(shù)都含有亞甲二氧基基團(tuán)［7，8］，該基團(tuán)于強(qiáng)酸條件下水解生成甲醛，甲醛與變色酸（含酚羥基）反應(yīng)產(chǎn)生紫紅色。查閱文獻(xiàn)，從波棱瓜子中分離得到的木脂素類(lèi)化合物分子中基本不含亞甲二氧基，包括對(duì)照品balanophonin中也不含此基團(tuán)，然而本文方法研究中波棱瓜子供試品溶液以及對(duì)照品balanophonin均能在變色酸-硫酸體系中顯色，且吸收光譜基本一致，并均在566 nm處有最大吸收，從對(duì)照品balanophonin結(jié)構(gòu)式推測(cè)其反應(yīng)機(jī)理可能為：①分子中苯駢呋喃環(huán)遇強(qiáng)酸不穩(wěn)定，呋喃環(huán)中碳氧鍵斷裂，生成碳正離子，碳正離子進(jìn)攻帶有酚羥基的芳環(huán)，生成共軛系統(tǒng)顯色。②分子中與苯環(huán)連接的不飽和醛基在反應(yīng)中亦可生成碳正離子，再與一分子酚反應(yīng)生成共軛系統(tǒng)顯色。

沒(méi)食子酸-硫酸反應(yīng)顯色法原理類(lèi)似于變色酸-硫酸反應(yīng)顯色法，但對(duì)照品與供試品的吸收光譜圖中無(wú)明顯平坦的峰值作為測(cè)定總木脂素含量的波長(zhǎng)。福林酚顯色法、磷鉬酸顯色法以及普魯士藍(lán)顯色法均是針對(duì)樣品中的酚類(lèi)化合物而反應(yīng)顯色，而中藥中含酚羥基的化學(xué)成分主要包括木脂素類(lèi)、香豆素類(lèi)、黃酮類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)等成分，而這些成分在波棱瓜子藥材中均含有，此三種方法與變色酸-硫酸反應(yīng)顯色法相比較，其用于測(cè)定波棱瓜子藥材中總木脂素含量存在較大干擾，故本研究中最終選擇變色酸-硫酸顯色法作為波棱瓜子總木脂素含量測(cè)定的方法。

波棱瓜子是藏藥中治療肝病的首選藥物之一，在用于治療肝病的藏藥成方制劑中，有一半以上入藥。研究表明，波棱瓜子治療肝病的主要活性成分為木脂素類(lèi)化合物，然藏藥存在生產(chǎn)技術(shù)含量低、生產(chǎn)成本高、市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力差等問(wèn)題，本研究建立的波棱瓜子總木脂素含量測(cè)定方法可為波棱瓜子藥材總木脂素的提取純化工藝奠定基礎(chǔ)。

［參考文獻(xiàn)］

［1］楊永昌.藏藥志［M］.青海人民出版社.第一版，1991:441.

［2］陳璐，張梅，李春沁，等.波棱瓜子乙酸乙酯提取物對(duì)小鼠免疫性肝損傷的影響［J］.中藥藥理與臨床，2014，30（3），111.

［3］顧健，李佳川，樊利娜.藏藥波棱瓜子總木脂素對(duì)刀豆球蛋白（ConA）致免疫性肝損傷小鼠保護(hù)作用及其機(jī)制探討［J］.西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，40（3）:375.

［4］李娟，麻曉雪，李順祥，等.鐵皮石斛中總酚的含量測(cè)定［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（24）:60.

［5］吳曉青，陳丹，邱紅鑫，等.芙蓉李中總多酚含量測(cè)定方法的優(yōu)選［J］.中國(guó)中醫(yī)藥科技，2011，18（2）:131.

［6］王 瑤，李多偉，沈曉東，等.正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化亞麻木酚素提取工藝［J］.西北藥學(xué)雜志，2011，26（3）:173.

［7］李曉光，高勤，翁文，等.廣東海風(fēng)藤中木脂素和五味子乙素的含量測(cè)定［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007，27（6）:726.

［8］劉旭，林森，趙余慶.北五味子不同部位總木脂素的含量測(cè)定［J］.中國(guó)現(xiàn)代中藥，2009，11（5）:39.

（責(zé)任編輯：傅舒）

Research on determination method of total lignans from Bolengguazi

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I Chun-qin， LIU Mei-lin， DONG Jia-yue，WANG Zi-yan， ZHANG Mei //（School of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicines of Ministry of Education， State Key Laboratory Breeding Base of Systematic research， development and Utilization of Chinese Medicine Resources， Chengdu 611137， China）

［Abstract］Objective: To establish a determination method for the extraction of total lignans from Bolengguazi. Method: Balanophonin was used as reference standard. The content of total lignans was determined by the chromotropic acid-H2SO4reaction colorimetry. Measurement wavelength was set at 566 nm. Result: Balanophonin calibration curve showed a good liner relationship in ranger of 5.01-17.535 μg.mL-1（n=6，r=0.999 1） and the average recovery was 98.36% with RSD of 2.33% （n=6）. Conclusion: The method established is reliable and accurate. It can be used to determine the content of total lignans in Bolengguazi.

［Key words］Bolengguazi； total lignans； balanophonin； content determination； spectrophotometry

［中圖分類(lèi)號(hào)］R 284.1

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1674-926X（2016）02-014-03

［基金項(xiàng)目］四 川省科技支撐項(xiàng)目（2013SZ0114）

［作者簡(jiǎn)介］李 春沁（1989-），女，碩士在讀，研究方向?yàn)橹兴幱行镔|(zhì)基礎(chǔ)研究

［通訊作者］張 梅（1963-），女，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥及其復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制方法研究

［收稿日期］2016-02-21