歐洪，李娜，徐小山，王光志

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烏頭霜霉病病原菌DNA提取方法初步研究

歐洪，李娜，徐小山，王光志

［摘要］目的：微量提取烏頭霜霉病病原菌DNA，為專性寄生菌的DNA提取提供技術(shù)參考，為后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的展開提供理論基礎(chǔ)。方法：無菌毛刷刷取烏頭霜霉病病原菌，用OMEGA真菌DNA提取試劑盒提取DNA，用真菌通用引物ITS4/5 PCR擴(kuò)增。結(jié)果：此方法提取的烏頭霜霉病病原菌DNA濃度均值為122ng/μL，A260/280均值為1.82，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在500bp有明亮條帶。實(shí)驗(yàn)成功提取出了烏頭霜霉菌病原菌DNA。結(jié)論：此方法提取的DNA濃度及A260/280值均能滿足后期實(shí)驗(yàn)要求，為后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)提供保障。不同組織提取的DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增比較后，能夠初步得出烏頭霜霉病病原菌的特異性片段，能為此類專性寄生菌的DNA提取提供基礎(chǔ)。

［關(guān)鍵詞］烏頭；霜霉病；DNA；PCR；微量提取

［作者單位］成 都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

Email:kzwon@163.com

毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx.為常用藥用植物，其母根川烏，子根附子，均為知名川產(chǎn)道地藥材［1］。烏頭霜霉病是附子種植區(qū)最為重要的病害之一。在附子道地產(chǎn)區(qū)四川省江油市的調(diào)查過程中，霜霉病的發(fā)病率最高能達(dá)到20%～30%［2］。同時(shí)，霜霉病常和其它幾種病害交互作用導(dǎo)致藥材大量減產(chǎn)，嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)馗阶赢a(chǎn)業(yè)的發(fā)展。霜霉菌的孢子能隨著空氣氣流以及雨水傳播，傳播極為廣泛?？焖?、準(zhǔn)確對(duì)霜霉菌的鑒定以及其發(fā)病機(jī)制的研究，揭示病原菌的遺傳結(jié)構(gòu)變化和傳播的規(guī)律，能為烏頭霜霉菌群體生物學(xué)和流行學(xué)的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)；對(duì)指導(dǎo)烏頭抗霜霉育種和抗病基因的合理布局具有重要意義；為烏頭霜霉病的病害過程控制以及防治提供科學(xué)基礎(chǔ)。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究人員把分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用到相關(guān)的研究中。通過對(duì)病原菌的轉(zhuǎn)錄組分析以及功能基因組學(xué)的研究，可以顯著提高我們對(duì)病原菌的認(rèn)識(shí)［3-4］。提取DNA是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)和前提，目前的DNA提取方法大多采用提取物的純化體進(jìn)行提?。?］。

烏頭霜霉菌屬于專性寄生菌，目前該菌還未能進(jìn)行離體培養(yǎng)，導(dǎo)致其病原菌的獲得和純化過程較為困難，嚴(yán)重影響了后續(xù)病原菌的群體遺傳結(jié)構(gòu)變化和毒性演化等相關(guān)研究工作的進(jìn)展。目前，對(duì)烏頭霜霉菌的研究甚少，對(duì)其DNA的提取研究更是幾乎沒有，只有在其他植株的霜霉菌的文獻(xiàn)中提到霜霉菌的DNA提?。?-8］。本實(shí)驗(yàn)建立了一種快速提取烏頭霜霉菌微量DNA的方法，具有簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)有效的原則。該方法用無菌毛刷直接從烏頭患霜霉病的葉片上刷取少量菌絲后用真菌試劑盒提取病原菌的DNA，經(jīng)過質(zhì)量檢測(cè)和PCR擴(kuò)增，該方法提取的DNA滿足后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的需要，從而實(shí)現(xiàn)了微量烏頭霜霉病病原菌菌絲DNA的提取。

1　材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病菌來源 烏頭霜霉病植株采自于四川省江油市普照村雅安三九優(yōu)質(zhì)無公害附子GAP生產(chǎn)基地。同時(shí)采取霜霉病葉片和健康葉片作對(duì)照。烏頭霜霉病病菌經(jīng)由成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定教研室依據(jù)癥狀以及病原菌形態(tài)特征認(rèn)定其為霜霉科霜霉屬烏頭霜霉菌。

1.1.2 試驗(yàn)儀器和試劑 試劑：OMEGA真菌DNA提取試劑盒，β-巰基乙醇，異丙醇，RNA裂解酶，無水乙醇，ddH2O。

儀器：全自動(dòng)樣品快速研磨儀（型號(hào)TISSUELYSER-48 SOP），高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)：Allegra X-30R Centrifuge SOP），PCR擴(kuò)增儀（型號(hào)：T100TMThermai Cycler Bio-Rad ），干式恒溫器（型號(hào)MK2000-2），微波爐（型號(hào)M1-211），凝膠電泳，電子天平（型號(hào)YP20001），WH-2微型旋渦混合儀，ND2000 核酸蛋白檢測(cè)儀。

1.2 基因組DNA的制備

選擇健康烏頭葉片、輕微發(fā)病的綠色葉片、發(fā)病嚴(yán)重枯黃的烏頭葉片分別剪成2×2cm小段裝入2mL離心管中并稱重編號(hào)，用OMEGA真菌DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.Fungal DNA Min Kit）對(duì)葉片進(jìn)行基因組DNA的提取。同時(shí)用無菌毛刷從發(fā)病嚴(yán)重枯黃的葉背上刷下菌絲霉層到離心管中稱重編號(hào)，用OMEGA真菌DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取。具體DNA提取步驟參照OMEGA真菌DNA提取試劑盒提取手冊(cè)上的說明。

1.3 DNA的檢測(cè)

將提取的DNA用核酸蛋白檢測(cè)儀進(jìn)行DNA質(zhì)量的檢測(cè)。

1.4 DNA的PCR擴(kuò)增

選用真菌通用引物ITS4/ ITS5（由上海生工公司合成）對(duì)烏頭霜霉病病原菌DNA在 PCR 擴(kuò)增儀器（BIO-RAD）上進(jìn)行反應(yīng)。引物序列（5'端-3'端）如下：

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’

PCR擴(kuò)增體系：25μL體系，2×Taq PCR Master Mix 13μL，引物ITS4和引物ITS5各 1μL，DNA模板2μL，雙蒸水補(bǔ)至25μL。

PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性溫度94℃ 3min；變性溫度94℃30s， 復(fù)性溫度 55℃1min，延伸溫度 72℃1min，共30次循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖1× TBE 緩沖系統(tǒng)中電泳， 每孔加樣5μL， 用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。

2　結(jié)果與分析

2.1 DNA的質(zhì)量檢測(cè)

四種不同實(shí)驗(yàn)材料提出的DNA用核酸蛋白儀檢測(cè)DNA濃度及其A260/280值，結(jié)果如下表1。其中健康烏頭葉片的DNA濃度為128～169ng/μL，輕微發(fā)病的烏頭葉片的DNA濃度為113～180ng/μL，發(fā)病嚴(yán)重的烏頭葉片的DNA濃度為96～166ng/μL，霜霉病病原菌的DNA濃度為106～147ng/μL。所有組DNA的A260 /A280值均在1.8左右，可以滿足后面實(shí)驗(yàn)所需的DNA質(zhì)量要求。為了明確提取出的DNA是烏頭葉片的還是霜霉病病原菌的，所以試驗(yàn)中選取了真菌通用引物ITS4/5對(duì)提取出的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表1 DNA濃度以及A260/280值

2.2 DNA的PCR擴(kuò)增

分別對(duì)健康烏頭葉片、輕微染病病葉、嚴(yán)重染病病葉以及霜霉病病原菌菌絲提取的DNA用真菌通用引物ITS4/5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2。結(jié)果表明真菌通用引物ITS4/5均能擴(kuò)增出明亮的條帶，健康烏頭葉片和輕微染病葉片DNA在750bp均有一條明亮條帶，嚴(yán)重染病的烏頭病葉DNA在750bp和500bp位置出現(xiàn)兩條條帶，霜霉病病原菌DNA在500bp位置出現(xiàn)一條明亮條帶。經(jīng)過對(duì)照分析，可以初步確認(rèn)從烏頭霜霉病病葉上用無菌毛刷刷下的病原菌菌絲提出的DNA為霜霉病病原菌的DNA?？梢姶朔椒軌蛱崛〕鰹躅^霜霉病病原菌的DNA，只是方法需要更進(jìn)一步的完善。

圖1 DNA樣品PCR擴(kuò)增電泳圖

3　討論

烏頭霜霉病是烏頭的常見病害，具有傳播廣，危害性強(qiáng)，難以控制等特點(diǎn)，對(duì)中藥附子的種植影響甚大，嚴(yán)重限制了附子栽培產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。霜霉病病原菌是完全寄生菌（或稱單純寄生菌），在人工合成培養(yǎng)基上難以培養(yǎng)，研究病原菌的群體遺傳結(jié)構(gòu)和生理小種變化，需要擴(kuò)繁大量病原菌，所用周期長(zhǎng)，導(dǎo)致對(duì)霜霉菌的研究水平受到很大程度的限制。本研究提取不同發(fā)病狀況的烏頭葉片與病原菌菌絲DNA，然后用真菌的通用引物ITS4/5擴(kuò)增比較，初步確認(rèn)提取出了烏頭霜霉病病原菌的DNA。

本研究采用微量提取的方法提取烏頭葉片中霜霉病病原菌的DNA，具有快速方便，所需材料較少，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，能夠提取出符合后期實(shí)驗(yàn)要求的DNA。在此實(shí)驗(yàn)中，健康烏頭葉片DNA與嚴(yán)重染病病葉DNA擴(kuò)增出在750bp的位置條帶一致，嚴(yán)重染病病葉DNA與霜霉病病原菌DNA擴(kuò)增出在500bp的位置條帶一致，由此可以初步判定500bp位置的條帶為烏頭霜霉病病原菌的特異條帶。實(shí)驗(yàn)中輕微染病病葉DNA擴(kuò)增出只有在750bp的位置有明顯條帶，可能是由于輕微患病的葉片上菌絲量太少，提出的菌絲DNA量太小，擴(kuò)增出的大部分是烏頭葉片的DNA。

微量提取烏頭霜霉病DNA 的方法具有重大的意義，能為這類專性寄生菌提供分子生物學(xué)研究源頭上的保證。本研究?jī)H初步證明了烏頭霜霉菌的微量提取和PCR的可行性，后期需要再進(jìn)一步完善該方法，減少PCR過程中的非特異性擴(kuò)增，擴(kuò)大研究病原菌群體的基礎(chǔ)上，可將此方法逐步推廣到其他專性寄生菌的分子生物學(xué)研究中， 同時(shí)也能為微量提取DNA的技術(shù)提供基礎(chǔ)。

［參考文獻(xiàn)］

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［8］乾義柯，張祥林，克衣木，等.甜菜霜霉病菌形態(tài)鑒定及28SrDNA序列分析［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，49（2）:249.

（責(zé)任編輯：胡慧玲）

Preliminary study on extraction method of Aconitum carmichaeli Debx.downy mildew pathogen bacteria DNA/

OUHong， LI Na， XU Xiao-shan， WANG Guang-zhi//（School of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine； Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine， Ministry of Education； National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research， Development and Utilization of Chinese Medicine Resources， Chengdu 611137，Sichuan）

［Abstract］Objective: Microscale DNA of downy mildew pathogen from Aconitum carmichaeli Debx. was extracted to provide technical references for extracting DNA from obligate parasites and theoretical evidence for follow-up molecular biological experiments. Method: Pathogen of downy mildew from Aconitum carmichaeli Debx. was taken with aseptic brush. The universal fungal primers ITS4/5 were chosen in PCR reactions after DNA was extracted with OMEGA fungi DNA extraction kit. Result: Extracted by this method， the average DNA concentration of downy mildew pathogen from Aconitum carmichaeli Debx. was 122 ng.μL-1. The mean value of A260/280 was 1.82. There was a bright strip in 500 bp of PCR products which suggested that the experiment extracted DNA successfully. Conclusion: The concentration and A260/280 of DNA extracted by this method can satisfy later test requirements which guarantee the following process of molecular experiment. Specific fragment of downy mildew pathogen from Aconitum carmichaeli Debx. is analyzed by comparing DNA extracted from different organizations after PCR reactions， which offers basis of DNA extraction of this kind of obligate parasites.

［Key words］Aconitum carmichaeli Debx.； downy mildew； DNA； PCR； microscale extraction

［中圖分類號(hào)］R 282

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1674-926X（2016）02-003-03

［基金項(xiàng)目］四 川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目

［作者簡(jiǎn)介］歐 洪（1989-），男，碩士研究生在讀，中藥資源開發(fā) Tel:15928114716 Email:ouhome@163.com

［通訊作者］王 光志（1976-），男，博士，中藥資源開發(fā)

［收稿日期］2016-06-06