余志芳，羅婷婷，歐泉，馬云桐

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虎杖生長發(fā)育過程中有效成分變化規(guī)律的研究

余志芳，羅婷婷，歐泉，馬云桐

［摘要］目的：研究不同栽培年限虎杖發(fā)育過程有效成分含量的變化規(guī)律，確定最佳采收時(shí)間，為規(guī)范化種植虎杖提供理論依據(jù)。方法：以采收年限為主因素，采收月份為副因素，采用HPLC法測定虎杖中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃苷、大黃素及大黃素甲醚的含量。結(jié)果：無論2年生虎杖還是3年生虎杖，虎杖苷和大黃苷含量兩次高峰期均出現(xiàn)在幼苗期和果期；白藜蘆醇含量在花期和枯萎期時(shí)含量最高；大黃素和大黃素甲醚在秋季達(dá)到最高。結(jié)論：虎杖采收無論2年或3年均可，采挖時(shí)期方面，從有效成分考慮，虎杖可在春季采挖，從產(chǎn)量考慮應(yīng)在秋季采挖。

［關(guān)鍵詞］虎杖；栽培年限；采收期；有效成分；HPLC法

［作者單位］成 都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

Tel:18380191389 Email:zhengnlyzf@163.com

虎杖為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb. Et Zucc.的干燥根莖和根，具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰之功效，中醫(yī)臨床用于治療濕熱黃疸、淋濁、帶下、風(fēng)濕痹痛、癰腫瘡毒、水火燙傷、跌打損傷、肺熱咳嗽等癥［1］。其主要活性成分為虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（以下稱大黃苷）、大黃素、大黃素甲醚［2-5］。白藜蘆醇及其苷虎杖苷具有抗腫瘤、降血脂、抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)脂蛋白代謝、保肝、抗氧化、抑菌等多種藥理作用［6-8］，而以大黃素、大黃素甲醚為代表的蒽醌類化合物具有抗菌、保肝、瀉下、抗癌等功能［9，10］。目前，虎杖苷注射液用于治療心肌缺血和腦缺血等疾?。?1］，大黃素甲醚作為一種新型植物源農(nóng)藥使用［12，13］。近年，人工栽培虎杖已成為虎杖藥材的主要來源，但是關(guān)于虎杖的采收季節(jié)及采收年限缺少研究，采收年限和采收期是影響藥材質(zhì)量的重要因素，明確不同栽培年限（一般栽培2或3年）和采收時(shí)間對虎杖藥材質(zhì)量影響，對于虎杖的優(yōu)質(zhì)栽培具有重要意義。

截止目前，對虎杖不同年限有效成分差異有所報(bào)道，但是其［14］僅對比了一年生植株與多年生植株中白藜蘆醇的含量，未通過其他有效成分進(jìn)行評價(jià)，且未有關(guān)于不同采收期有效成分含量變化的研究。本文以2、3年生虎杖為研究對象測定不同生育期5種有效成分（虎杖苷、白藜蘆醇、大黃苷、大黃素、大黃素甲醚）的含量差異，從而確定其最佳采收期。

1　材料與試劑

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料取自四川省巴中市虎杖種植基地，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)馬云桐教授鑒定為蓼科虎杖屬植物虎杖，樣品通過根莖繁殖，株行距為40cm×65cm，由于一年生樣品生物量積累只占其總重的39.95%，因此未采集1年生植株，而是以2年生和3年生植株為研究對象，采挖時(shí)期分別為：4月2日（幼苗期），5 月22日（全分枝期），6月21日（花前期），7月30日（花期），9月19日（果期），10月26日（倒苗期），11月20日（枯萎期）。將植株采挖后清洗干凈并切片后50℃烘干，粉碎過3號篩備用。

1.2 儀器與試劑

電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)（上海將任試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；KQ5200E型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；高效液相分析系統(tǒng)配雙波長檢測器和在線脫氣系統(tǒng)（日本島津公司）； 色譜柱Agilent Zorbax XDB-C18（4.6×250mm，5μm）（安捷倫公司）；BT-457型電子天平（深圳市博途電子科技公司）；QUINTIX224-1CN型電子分析天平（北京sartorius天平有限公司）。

大黃素（批號：131009）、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷（以下稱大黃苷，批號：141209）、大黃素甲醚（批號：140820）、白藜蘆醇（批號：150122）、虎杖苷（140828）對照品（以上均購自成都克洛瑪生物科技有限公司，純度均≥98%）；無水乙醇（分析純，成都科龍化學(xué)試劑廠）；甲醇、乙腈（色譜純，美國賽默飛世爾有限公司）。

2.3 色譜條件

Agilent Zorbax XDB-C18柱（4.6×250 mm，5μm）；流動(dòng)相乙腈-0.5%乙酸水；洗脫梯度（以乙腈濃度表示）：0-10 min，15%；10～18 min，15% ～ 25%；18～35 min，25%～35%；35～48 min，35%～70%；48～65 min，70%～78%，流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長290 nm；進(jìn)樣體積10μL。按照此色譜條件分析得到的樣品和對照品色譜圖見圖1。

2　方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備

分別稱取虎杖苷4.87 mg 、白藜蘆醇0.08 mg、大黃苷0.75 mg 、大黃素0.23 mg 、大黃素甲醚0.38 mg 至10 mL容量瓶，以甲醇為溶劑定容，稀釋2倍后配成混合對照品溶液備用。

2.2 樣品溶液制備

稱取0.2 g藥材粉末，加入60%乙醇25 mL，超聲（50kHz）提取30 min，過濾后定容至50 mL容量瓶備用，進(jìn)樣前過0.45 μm濾膜。

圖1 虎杖樣品中5種有效成分的HPLC圖譜

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取混合對照品溶液分別進(jìn)樣2μL，4μL，6 μL，8μL，12μL，15μL，分別計(jì)算各化合物濃度與色譜峰面積之間的回歸方程，結(jié)果見表1，各成分濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r值均大于0.999。

表1 虎杖中5種活性成分的回歸方程

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取虎杖樣品，按照“2.2”項(xiàng)下制備供試品，按照“2.3”項(xiàng)下色譜方法連續(xù)進(jìn)樣6次，測定虎杖苷、白藜蘆醇、大黃苷、大黃素、大黃素甲醚5種成分的峰面積，計(jì)算得各化合物峰面積的RSD（n=6）分別為0.1%，0.3%，0.2%，0.4%，2.0%。

2.4.3 重復(fù)性考察 稱取5份虎杖樣品，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分析得到樣品中虎杖苷、白藜蘆醇、大黃苷、大黃素、大黃素甲醚的含量分別為23.763、0.441、7.941、0.596、0.507mg/g，RSD （n=5）分別為2.0 %、1.3%、1.3%、1.7%、2.0%。

2.4.4 穩(wěn)定性考察 取虎杖樣品，按照“2.2”項(xiàng)下制備供試品，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下色譜方法每隔6 h進(jìn)樣，分別計(jì)算各化合物色譜峰面積RSD，各化合物RSD（n=6）分別為0.1%、1.1%、1.1 %、1.8%、2.1%，表明各化合物在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 回收率試驗(yàn) 分別稱取虎杖苷10.010mg、白藜蘆醇0.312mg、大黃苷3.960mg、大黃素0.390mg、大黃素甲醚0.49mg至100mL容量瓶中，60%乙醇定容，得到混合儲(chǔ)備液。取已知含量（含量由“2.4.3”所得）的樣品6份，分別加上述儲(chǔ)備液10mL，再加60%乙醇15mL，按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品，經(jīng)“2.3”色譜方法分析得到各樣品色譜峰面積，根據(jù)峰面積與回歸方程計(jì)算回收率，結(jié)果見表2，虎杖苷、白藜蘆醇、大黃苷、大黃素、大黃素甲醚回收率分別為96.7 %、95.2 %、98.1 %、98.2 %、101.0 %。

表2 虎杖中5種有效成分加樣回收率（n=6）

0.10865　0.065　0.039　0.104　100.7大黃素0.10216　0.061　0.039　0.100　101.5 0.12179　0.073　0.039　0.110　95.3 0.12345　0.074　0.039　0.114　103.9 0.10395　0.062　0.039　0.097　90.0 0.12265　0.073　0.039　0.111　97.6 98.2　4.6大黃素甲醚0.10865　0.055　0.049　0.106　103.6　100.9　3.6 0.10216　0.052　0.049　0.103　105.3 0.12179　0.062　0.049　0.109　95.4 0.12345　0.063　0.049　0.113　103.1 0.10395　0.053　0.049　0.100　96.8 0.12265　0.062　0.049　0.112　101.4

2.5 樣品測定

2.5.1 不同生育期5種活性成分含量變化 將不同年限的各生育期樣品粉末按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下色譜方法分析，得到各樣品中所需化學(xué)成分的峰面積，根據(jù)“2.4.1”項(xiàng)中曲線回歸方程，得樣品中各化學(xué)成分含量，并根據(jù)2015版《中國藥典》中烘干法測得各樣品中含水量，得以干燥品計(jì)各樣品中5種活性成分的含量見變3，表4。

表3 二年生虎杖不同生育期5種活性成分含量

表4 三年生虎杖不同生育期5種活性成分含量

由表3和表4可知二年生植株和三年生植株虎杖苷含量從幼苗期到花期均呈現(xiàn)下降趨勢，花期含量最低，花期到果期含量大幅升高，果期之后趨于平緩。白藜蘆醇從幼苗期開始逐漸升高，到花期達(dá)到第一次高峰值，花期后開始下降，11月地上部分完全干枯時(shí)達(dá)到第二次高峰。大黃苷含量的變化趨勢與虎杖苷的趨勢相近，幼苗期含量較高，之后開始下降，二年生植株至花期降到最低，三年生植株在現(xiàn)蕾期已降到最低；大黃素含量的變化趨勢不明顯，但是綜合2年生植株和3年生植株分析其主要積累發(fā)生在花期之后，枯萎期時(shí)積累量達(dá)到最大。2年生植株和3年生植株大黃素甲醚含量三次高峰期均出現(xiàn)在幼苗期、花期、枯萎期。

虎杖中5種活性成分存在一定轉(zhuǎn)化，因白藜蘆醇是虎杖苷的苷元，大黃素是大黃苷的苷元，筆者前期研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)虎杖藥材干燥緩慢，含水量較高時(shí)其轉(zhuǎn)化越多，即虎杖苷和大黃苷的含量下降而白藜蘆醇和大黃素的含量會(huì)升高，Tianli Tian［15］等人的研究也發(fā)現(xiàn)虎杖中虎杖苷和大黃苷在其根霉微生物作用下可轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇和大黃素，因此不能通過某個(gè)單一的成分來判斷虎杖有效成分的含量，而應(yīng)該通過主要活性成分總含量來判斷虎杖的質(zhì)量?；⒄戎熊晤惓煞郑ɑ⒄溶蘸桶邹继J醇）和蒽醌類成分（大黃苷、大黃素及大黃素甲醚）含量變化趨勢圖見圖2。

圖2 不同生長年限虎杖生育期芪類成分和蒽醌類成分含量變化

圖2所示，除花期外，2年生虎杖芪類成分比3年生芪類成分含量略高，2年生植株和3年生植株蒽醌類成分含量變化趨勢相似?；⒄葟挠酌缙诘交ㄆ诨钚晕镔|(zhì)總含量表現(xiàn)出下降趨勢，果期達(dá)到最高，果期到枯萎期趨于平衡，這說明虎杖有效成分的積累不在營養(yǎng)生長階段，而在生殖生長階段。這與藥典［1］所載常規(guī)的“春、秋季采挖”相一致。

2.5.2 不同部位5種活性成分變化 虎杖屬于根莖類藥材，植物不同部位次生代謝產(chǎn)物積累量不同，筆者將枯萎期采收的2年生及3年生虎杖藥材根和根莖中5種活性成分進(jìn)行對比，以干燥品計(jì)不同部位5種活性成分含量結(jié)果見表5。

表5 虎杖不同部位5種活性成分含量

表5所示，二年生植株根與根莖中虎杖苷和白藜蘆醇差異較小，但是三種蒽醌類成分差異較大，根莖中含量分別達(dá)到根中含量的3.3倍、2.1倍和1.6倍。三年生虎杖根與根莖中虎杖苷的含量差異較大，根莖中含量是根中含量的1.4倍，白藜蘆醇的含量差異不明顯，根莖中三種蒽醌類物質(zhì)較根中高，分別是根中含量的1.5倍、1.4倍和1.4倍。

3　討論

從“2.5.1”不同生育期5種活性成分的含量變化可知，2年生和3年生虎杖均在營養(yǎng)生長階段總活性成分呈降低趨勢，花期時(shí)出現(xiàn)最小值，之后開始積累到果期呈現(xiàn)最大值，果期之后趨于穩(wěn)定，從活性成分考慮最佳采收期應(yīng)選春季，考慮到產(chǎn)量采收期應(yīng)選秋季，這符合虎杖藥材的常規(guī)采收時(shí)間。若在秋季采挖，以活性成分含量最高的果期為例，從“圖2”知2年生植株芪類含量（39.82mg/g）高于3年生植株含量（36.00mg/g），而其蒽醌類含量（11.45mg/g）低于3年生植株含量（12.36mg/g），但是差異均較小，故從活性成分考慮，虎杖藥材2年或3年采挖均可。圖2所示虎杖藥材中芪類成分含量沒有因生長年限而升高，原因可能是“表4”所示的虎杖根中活性成分含量低于根莖中的含量，尤其3年生植株與根莖中含量差異較大，而3年生植株根的生物量對總生物量（根及根莖）的百分占有量（38.0%）高于2年生植株根的百分占有量（21.2%），因此虎杖2年或3年采收還受其產(chǎn)量和藥材的市場價(jià)格影響。

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（責(zé)任編輯：胡慧玲）

Research of active components change of Huzhang during the growth process

YU Zhi-fang， LUO Ting-ting， OU Quan，MA Yun-tong//（School of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine； Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine， Ministry of Education； National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research， Development and Utilization of Chinese Medicine Resources， Chengdu 611137，Sichuan）

［Abstract］Objective: In order to provide a basis for good agriculture practice for Huzhang， the influence of different cultivation years and harvesting period on active components was studied. Method: The cultivation year was used as a main factor，and harvesting period as second factor. The contents of polydatin， resveratrol， emodin-8-O-glucoside， emodin and physcion in Huzhang were determined by HPLC. Result: The highest contents of polydatin and emodin-8-O-glucoside of the biennial and three year-old Huzhang appeared in seeding period and fruit period. The highest contents of resveratrol appeared in blooming period and withered period. The highest contents of emodin and physcion occurred in autumn. Conclusion: Huzhang can be cultivated two or three years. Considering the content of active components， it can be harvested in spring. While considering the productivity， it can be harvested in autumn.

［Key words］Huzhang； cultivation period； harvesting period； active component； HPLC

［中圖分類號］R 282.4

［文獻(xiàn)標(biāo)識碼］A

［文章編號］1674-926X（2016）02-001-04

［基金項(xiàng)目］巴 州區(qū)道地中藥材虎杖種植技術(shù)集成及產(chǎn)業(yè)化示范項(xiàng)目（編號：313-672）

［作者簡介］余 志芳（1989-），女，碩士生，從事中藥品種、質(zhì)量及資源研究

［通訊作者］馬 云桐（1963-），男，教授，從事中藥種質(zhì)及資源研究工作 Email:mayuntong06@163.com

［收稿日期］2016-03-04