王蕊，王江濤*，沙相宇，孫本晶，馬海力

(1.中國海洋大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山東 青島266100)

中肋骨條藻與微小亞歷山大藻間的他感作用研究

王蕊1，王江濤1*，沙相宇1，孫本晶1，馬海力1

(1.中國海洋大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山東 青島266100)

摘要：在f/2全營養(yǎng)培養(yǎng)條件下，采用共培養(yǎng)以及濾液交叉培養(yǎng)的方法研究了中肋骨條藻(Skeletonema costatum)和微小亞歷山大藻(Alexandrium minutum)之間的競爭作用，結(jié)果表明: 微小亞歷山大藻指數(shù)生長后期的無藻細胞濾液對中肋骨條藻的生長沒有抑制作用，但中肋骨條藻濾液明顯抑制了微小亞歷山大藻的生長，且抑制作用隨著中肋骨條藻濾液比例的增大而增大，他感作用是影響這兩種微藻間競爭的重要方式之一；通過向培養(yǎng)基中添加自他感物質(zhì)標(biāo)準品15S-hydroxy-5Z，8Z，11Z，13E，17Z-eicosapentaenoic acid (15(S)-HEPE)考察其對中肋骨條藻自身以及微小亞歷山大藻生長的影響，發(fā)現(xiàn)15(S)-HEPE在中肋骨條藻濾液中并不是能夠抑制微小亞歷山大藻生長的他感物質(zhì)，今后應(yīng)進一步深入分析中肋骨條藻釋放的抑制微小亞歷山大藻生長的他感物質(zhì)。

關(guān)鍵詞：種間競爭；他感作用；中肋骨條藻；微小亞歷山大藻；自他感作用

1引言

作為種間競爭的方式之一，他感作用是浮游植物群落發(fā)展及演變的重要原因，是引起赤潮藻相對于其他競爭者取得生長優(yōu)勢的一個關(guān)鍵因素，在赤潮形成過程中發(fā)揮了重要的作用[1—2]。近幾年來對浮游植物他感作用的研究呈越來越多的趨勢，Liu等[3]發(fā)現(xiàn)Phaeocystisglobosa獲取競爭優(yōu)勢的主要原因是通過他感作用來實現(xiàn)的。Zak和Kosakowska[4]發(fā)現(xiàn)Microcystisaeruginosa的細胞濾液有效抑制了Chlorellavulgaris的生長。張議文等[5]通過濾液培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)Chaetoceroscurvisetus分泌的他感物質(zhì)抑制Skeletonemacostatum的生長，因此研究水域浮游植物間的他感作用對于了解赤潮的發(fā)生機制和生態(tài)調(diào)控具有非常重要的意義。

中肋骨條藻是一種廣溫、廣鹽性的硅藻[6—7]，在世界大洋中廣泛分布，大量繁殖可以形成翠綠色的赤潮[8]。李慧在研究中肋骨條藻與東海原甲藻時發(fā)現(xiàn)，中肋骨條藻的無藻細胞濾液對自身具有一定的抑制作用[9]。自他感作用是浮游植物間他感作用的特殊形式，植物通過生產(chǎn)和分泌一些化學(xué)物質(zhì)抑制自身的發(fā)展和種群的擴大，從而使群體保持平衡[10—12]。

微小亞歷山大藻作為一種典型的可以形成有毒孢囊的甲藻，曾經(jīng)在荷蘭、黑海等地發(fā)生過大面積的有毒赤潮。在東海長江口海域，近20年來，逐步有從中肋骨條藻赤潮向東海原甲藻赤潮演替的趨勢，微小亞歷山大藻雖然間斷被發(fā)現(xiàn)，但尚不能形成規(guī)模。因此研究中肋骨條藻和微小亞歷山大藻之間的他感效應(yīng)，對于揭示長江口海區(qū)微小亞歷山大藻這一有毒有害藻種不能規(guī)模發(fā)展的原因，具有重要的意義。

2材料與方法

2.1微藻培養(yǎng)

中肋骨條藻取自中國海洋大學(xué)海洋污染生態(tài)化學(xué)實驗室藻種室，微小亞歷山大藻取自國家海洋局第一海洋研究所藻種室。置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，f/2 培養(yǎng)基，培養(yǎng)的中肋骨條藻光暗比為12 h∶12 h，微小亞歷山大藻光暗比為16 h∶8 h，光強(以photons計)70 μmol/(m2·s)，培養(yǎng)溫度為 (20±1)℃。自他感物質(zhì)15(S)-HEPE購買于Cayman Chemical Company，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1　15(S)-Hydroxy-5Z，8Z，11Z，13E，17Z-eicosapentaenoic acid(15(S)-HEPE)結(jié)構(gòu)式Fig.1　The structure of 15(S)-Hydroxy-5Z，8Z，11Z，13E，17Z-eicosapentaenoic acid (15(S)-HEPE)

2.2中肋骨條藻與微小亞歷山大藻之間的競爭關(guān)系

2.2.1中肋骨條藻與微小亞歷山大藻共培養(yǎng)的相互影響

共培養(yǎng)實驗分為3個實驗組：(1) 中肋骨條藻單獨培養(yǎng)，接種后初始藻密度為1.0×104cells/mL; (2)微小亞歷山大藻單獨培養(yǎng)，接種后初始藻密度為5×104cells/mL; (3)中肋骨條藻與微小亞歷山大藻共培養(yǎng)，在混合培養(yǎng)的過程中將接種后初始藻密度分別調(diào)整為1.0×104cells/mL和5×104cells/mL，接種比例微小亞歷山大藻∶中肋骨條藻(A∶S)=5∶1，光暗比16 h∶8 h，培養(yǎng)14 d。每組設(shè)置3個平行樣，每天定時取樣并用顯微鏡計數(shù)。

2.2.2中肋骨條藻濾液對微小亞歷山大藻生長的影響

培養(yǎng)中肋骨條藻至指數(shù)生長末期(藻密度為8×106cells/mL)，取指數(shù)生長末期的培養(yǎng)液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，得無藻細胞濾液，測定NO3-N、NO2-N、NH4-N、PO4-P和SiO4-Si五項營養(yǎng)鹽濃度，測定方法分別為銅-鎘還原法、重氮-偶氮法、次溴酸鈉氧化法、磷鉬藍分光光度法和硅鉬藍分光光度法[13]。中肋骨條藻無藻細胞濾液和滅菌海水均加富至 f/2 培養(yǎng)基，將濾液和海水按濾液占總體積的0%、67%和100%配制微小亞歷山大藻培養(yǎng)液。微小亞歷山大藻初始藻密度為5×104cells/mL，每天定時取樣用于細胞計數(shù)，每實驗組設(shè)3個平行樣。

2.2.3微小亞歷山大藻濾液對中肋骨條藻生長的影響

微小亞歷山大藻培養(yǎng)至指數(shù)生長末期(藻密度為2×105cells/mL)，取無藻細胞濾液測定其營養(yǎng)鹽濃度，然后將微小亞歷山大藻無藻細胞濾液和滅菌海水均加富至f/2 培養(yǎng)基，按濾液占總體積的0%、30%、60%、100%配制中肋骨條藻培養(yǎng)液。中肋骨條藻初始藻密度為1.0×104，其他條件同2.2.2。

2.3中肋骨條藻自他感物質(zhì)對兩種藻生長的影響

Imada等從中肋骨條藻濾液中分離得到 3.1 mg 抑制自身生長的自他感物質(zhì)，確定為15 S-hydroxy-5Z，8Z，11Z，13E，17Z-eicosapentaenoic acid，簡稱 15(S)-HEPE，在中肋骨條藻濾液中的近似濃度為 6.2×10-3μg/mL[14]。在本實驗中為進一步考察中肋骨條藻分泌的自他感物質(zhì)對中肋骨條藻和微小亞歷山大藻生長的影響，將購買的標(biāo)準品15(S)-HEPE添加到 24 孔生物培養(yǎng)板中，培養(yǎng)體積為2.4 mL，濃度分別設(shè)置為 0、6.2×10-5、6.2×10-3、0.62 μg/mL。在孔板培養(yǎng)過程中，取樣前用槍頭攪拌1 min，使培養(yǎng)液混合均勻，取樣體積為 0.1 mL，每次取樣后變換孔板角度，排除光照影響，實驗分為4組，每組含6孔，中肋骨條藻初始藻密度為 1.4×104cells/mL，微小亞歷山大藻初始藻密度為 7×104cells/mL，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組設(shè)3個平行樣，每天定時取樣，顯微鏡計數(shù)。

2.4數(shù)據(jù)處理

2.4.1相對抑制率(IR)

采用下式計算相對抑制率[15]：

(1)

式中，IR為相對抑制率，T為實驗組生物量，C為對照組生物量。

2.4.2顯著性檢驗

通過每個實驗組的平行樣計算平均值及標(biāo)準偏差(n=3)。各組間的顯著性差異用one-way ANOVA進行分析[16]，P<0.05為具有顯著性差異的標(biāo)準。

3結(jié)果

3.1中肋骨條藻與微小亞歷山大藻之間的競爭關(guān)系

3.1.1中肋骨條藻與微小亞歷山大藻共培養(yǎng)的相互影響

中肋骨條藻與微小亞歷山大藻共培養(yǎng)時，共培養(yǎng)組和單獨培養(yǎng)組的中肋骨條藻的生長曲線沒有明顯差別(P=0.99)，兩組同時進入了指數(shù)生長期，生長狀況良好，如圖2所示。而共培養(yǎng)組中的微小亞歷山大藻在第4天之后，藻密度迅速下降，與對照組相比具有顯著性的差異(P<0.05)，如圖3所示。因此在中肋骨條藻與微小亞歷山大藻共培養(yǎng)時，微小亞歷山大藻的生長受到了顯著的抑制。

圖2　中肋骨條藻單獨培養(yǎng)與共培養(yǎng)的生長Fig.2　The growth curves of S. costatum in mono-culture and co-culture

圖3　微小亞歷山大藻單獨培養(yǎng)與共培養(yǎng)的生長Fig.3　The growth curves of A. minutum in mono-culture and co-culture

3.1.2中肋骨條藻與微小亞歷山大藻間的他感作用

中肋骨條藻在不同比例的微小亞歷山大藻無藻細胞濾液中，生長均沒有受到顯著的影響，接種后迅速進入指數(shù)生長期，圖4所示。微小亞歷山大藻在中肋骨條藻濾液中相比于對照組，從第3天就受到了明顯的抑制(P<0.05)，并且抑制作用隨著中肋骨條藻濾液比例的增大而增大，如圖5所示。

圖4　中肋骨條藻在不同微小亞歷山大藻濾液比例條件下的生長Fig.4　The growth curves of S. costatum in different proportions of A. minutum filtrate

圖5　微小亞歷山大藻在不同中肋骨條藻濾液比例條件下的生長Fig.5　The growth curves of A. minutum in different in different proportions of S. costatum filtrate

3.2中肋骨條藻自他感物質(zhì)對兩種微藻生長的影響

3.2.1中肋骨條藻自他感物質(zhì)對自身生長的影響

添加不同濃度的中肋骨條藻自他感物質(zhì)，中肋骨條藻表現(xiàn)出了不同的抑制作用，如圖6所示。從接種后的第6天開始各組之間表現(xiàn)出了顯著的差別(P<0.05)：對照組以指數(shù)形式增長，第10天藻密度達到1.3×106cells/mL；其余各組第10天的藻密度分別為6.8×105cells/mL、5.5×105cells/mL、2.4×105cells/mL，添加的自他感物質(zhì)濃度越高，抑制作用越強烈。

圖6　添加不同濃度的自他感物質(zhì)15(S)-HEPE對中肋骨條藻生長的影響Fig.6　The growth curves of S. costatum in cultures with different concentration of 15(S)-HEPE added

3.2.2中肋骨條藻自他感物質(zhì)對微小亞歷山大藻生長的影響

添加不同濃度的15(S)-HEPE于培養(yǎng)基中，微小亞歷山大藻各實驗組生長曲線如圖7所示。高濃度(0.62 μg/mL)條件下，微小亞歷山大藻的生長從第四天開始受到了明顯的抑制(P<0.05)；當(dāng)自他感物質(zhì)的濃度降低為6.2×10-3μg/mL時，微小亞歷山大藻的生長略高于對照組；當(dāng)自他感物質(zhì)的濃度繼續(xù)降低為6.2×10-5μg/mL時，在整個實驗過程中微小亞歷山大藻的藻密度是最高的，說明低濃度的15(S)-HEPE明顯促進了微小亞歷山大藻的生長。

圖7　添加不同濃度的15(S)-HEPE對微小亞歷山大藻生長的影響Fig.7　The growth curves of A. minutum in cultures with different concentration of 15(S)-HEPE added

4討論

浮游植物的他感作用是通過向環(huán)境中釋放他感物質(zhì)實現(xiàn)的，近年來有毒有害的甲藻等引發(fā)赤潮的比例逐漸增大，關(guān)于硅藻與甲藻之間的他感作用也受到越來越多的重視，張培玉等利用共培養(yǎng)體系，通過接種不同比例的塔瑪亞歷山大藻和中肋骨條藻，發(fā)現(xiàn)它們之間的相互競爭關(guān)系與他感作用有關(guān)[17]；陳玫玫和趙衛(wèi)紅發(fā)現(xiàn)東海原甲藻無藻細胞濾液對中肋骨條藻的生長具有促進作用[18]。本研究選取兩種常見的赤潮藻種，一種赤潮硅藻——中肋骨條藻，一種有毒甲藻——微小亞歷山大藻，為了研究兩者之間的競爭關(guān)系，首先采用了共培養(yǎng)的實驗方法，由于中肋骨條藻是一種廣溫廣鹽性的藻，生長速度快，增殖能力強[19—20]，因此適當(dāng)增加了微小亞歷山大藻的比例，設(shè)置共培養(yǎng)時的初始藻密度比(A∶S)為5∶1，光暗比16 h∶8 h。在適宜且相同的實驗條件下，中肋骨條藻單獨培養(yǎng)和共培養(yǎng)的中肋骨條藻生長情況大致相同，生長曲線未有明顯差別；但微小亞歷山大藻在共培養(yǎng)過程中卻受到了明顯的抑制，可見微小亞歷山大藻的競爭能力明顯低于中肋骨條藻。

很多研究表明，浮游植物通過釋放胞外活性物質(zhì)，直接影響不同藻類種群之間的相互作用[21—22]。在共培養(yǎng)實驗的基礎(chǔ)上，本研究還采用了濾液交叉培養(yǎng)的方法，在濾液培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)微小亞歷山大藻的無藻細胞濾液對中肋骨條藻的生長沒有顯著影響，中肋骨條藻的無藻細胞濾液對微小亞歷山大藻有顯著的抑制作用，且抑制作用隨著中肋骨條藻濾液比例的增大而增大，最大抑制率可達到70%，因此中肋骨條藻分泌的他感物質(zhì)對微小亞歷山大藻的生長具有重要的影響，中肋骨條藻通過產(chǎn)生與釋放他感物質(zhì)到周圍水體環(huán)境中從而獲得了相對微小亞歷山大藻的生長優(yōu)勢。然而與共培養(yǎng)的抑制率相比(表1)，在共培養(yǎng)4 d后，其抑制率一直高于濾液培養(yǎng)實驗組，說明在共培養(yǎng)體系中，引起微小亞歷山大藻和中肋骨條藻的種群競爭關(guān)系發(fā)生變化的原因除營養(yǎng)鹽、生存空間等資源競爭外，他感作用對二者的競爭結(jié)果同樣起著重要的作用，另外Gross表明他感物質(zhì)能通過細胞接觸起作用，即生物分泌的他感物質(zhì)能通過細胞接觸直接傳遞至目標(biāo)生物，從而引起抑制作用加強[23]。

表1　微小亞歷山大藻在共培養(yǎng)和濾液培養(yǎng)中抑制率對比

近年來隨著長江口海域營養(yǎng)鹽環(huán)境的變化，長江口海域東海原甲藻赤潮爆發(fā)的規(guī)模呈現(xiàn)越來越大的趨勢，該海域正經(jīng)歷著由中肋骨條藻單一優(yōu)勢藻種向硅藻和甲藻混合赤潮的方向發(fā)展。如果營養(yǎng)鹽條件沿著這一方向進一步變化，中肋骨條藻的增殖必然受到減弱。從上面的研究結(jié)果可以看到，中肋骨條藻的他感作用明顯抑制著微小亞歷山大藻這一有毒有害藻種的生長。一旦中肋骨條藻的規(guī)模減弱到一定程度，不能夠再抑制微小亞歷山大藻的生長，東海有可能會暴發(fā)微小亞歷山大藻赤潮。

中肋骨條藻分布極其廣泛，由于自他感作用可以抑制其自身的發(fā)展和種群的擴大，從而保持了生態(tài)系統(tǒng)的種群平衡。Imada等[14]發(fā)現(xiàn)中肋骨條藻對自身生長產(chǎn)生抑制作用的他感物質(zhì)是15(S)-HEPE。為了驗證這種物質(zhì)對中肋骨條藻和微小亞歷山大藻的生長是否產(chǎn)生影響，進行了該物質(zhì)的添加實驗。在添加自他感物質(zhì)實驗中，隨著15(S)-HEPE濃度的增加，中肋骨條藻受到的抑制作用也明顯增強。而15(S)-HEPE對微小亞歷山大藻生長的影響則不同，在低濃度時其生長被促進，在高濃度時被顯著抑制，因此相同濃度的他感物質(zhì)對不同藻類的影響是不同的，他感作用具有一定的特異性和一定的濃度作用范圍，例如，Mulderij等[24]發(fā)現(xiàn)輪藻屬Chara對Selenastrumcapricornutum和Chlorellaminutissima都有一定的他感作用，而對Scenedesmusobliquus則沒有影響。胡光濟等[25]和李慶華等[26]發(fā)現(xiàn)菖蒲和柳樹葉浸提液低濃度時促進蛋白核小球藻的生長，高濃度時則起到抑制作用。Tillmann等[27—28]發(fā)現(xiàn)多種亞歷山大藻對Rhodomonassalina具有他感作用，并且他感物質(zhì)在一定的濃度范圍內(nèi)才發(fā)揮作用。

根據(jù)Imada的研究結(jié)果，添加實驗中6.2×10-3μg/mL的濃度即近似為中肋骨條藻培養(yǎng)過程中濾液產(chǎn)生的自他感物質(zhì)的最大濃度，然而該濃度下微小亞歷山大藻的生長并沒有受到抑制，反而略微受到了促進，因此在濾液培養(yǎng)中抑制微小亞歷山大藻生長的物質(zhì)不是中肋骨條藻分泌的自他感物質(zhì)15(S)-HEPE，因此在以后的研究中，應(yīng)進一步分析中肋骨條藻濾液中對微小亞歷山大藻起抑制作用的他感物質(zhì)。

5結(jié)論

(1)濾液交叉培養(yǎng)表明中肋骨條藻抑制微小亞歷山大藻的生長主要是通過他感作用來實現(xiàn)的，抑制作用隨著中肋骨條藻濾液比例的增大而增大，但抑制程度不如共培養(yǎng)實驗中的抑制程度強烈，推測中肋骨條藻和微小亞歷山大藻除了化感作用這一重要因素影響兩種微藻之間的種間競爭外，細胞接觸、營養(yǎng)鹽等資源的競爭也影響了兩種微藻之間的競爭關(guān)系，這一發(fā)現(xiàn)對于東海近岸海域赤潮發(fā)展的走勢具有警示意義；然而，微小亞歷山大藻對中肋骨條藻沒有抑制作用。

(2)自他感物質(zhì)15(S)-HEPE對中肋骨條藻自身有顯著的抑制作用，隨著該物質(zhì)濃度的增加，中肋骨條藻受到的抑制作用增加；而添加的自他感物質(zhì)只有在高濃度時才可以抑制微小亞歷山大藻的生長。

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The allelopathy between Skeletonema costatum and Alexandrium minutum

Wang Rui1，Wang Jiangtao1，Sha Xiangyu1，Sun Benjing1，Ma Haili1

(1.CollegeofChemistryandChemicalEngineering，OceanUniversityofChina，Qingdao266100，China)

Abstract:Interaction between Skeletonema costatum and Alexandrium minutum was investigated by bi-algal culture，filtrate culture in f/2 medium. The results showed that the cell-free filtrate of the S. costatum culture in later exponential growth phase inhibited the growth of A. minutum apparently，and the effect of inhibition was related to the proportion of S. costatum cell-free filtrate in the culture. The inhibited effect was more significant on the process of mixed culture，however there was no allelopathic effect of A. minutum on S. costatum. Moreover，the influence of self-allelochemical—15(S)-HEPE on the growth microalgae was studied by adding standard substance into the cultures of S. costatum and A. minutum. While this substance was not the allelochemical that inhibit the growth of A. minutum. Further studies would be focused on analyzing allelochemicals released by S. costatum in the filtrate culture．

Key words:interaction; allelopathy; Skeletonema costatum; Alexandrium minutum; auto-allelopathy

收稿日期：2015-10-20；

修訂日期：2016-02-04。

基金項目：全球變化與海氣相互作用專項項目“氣候變化對熱帶大洋上層營養(yǎng)鹽供給的影響”(GASI-03-01-02-01)。

作者簡介：王蕊(1989—)，女，山東省菏澤市人，博士，主要從事浮游植物間的他感作用以及他感物質(zhì)的提取研究。E-mail:15192157523@163.com *通信作者：王江濤(1967—)，男，河北省承德市人，教授，主要從事海洋化學(xué)和生態(tài)學(xué)研究。E-mail:jtwang@ouc.edu.cn

中圖分類號:X173

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：0253-4193(2016)06-0062-07

王蕊，王江濤，沙相宇，等. 中肋骨條藻與微小亞歷山大藻間的他感作用研究[J].海洋學(xué)報，2016，38(6)：62—68，doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2016.06.007

Wang Rui，Wang Jiangtao，Sha Xiangyu，et al. The allelopathy betweenSkeletonemacostatumandAlexandriumminutum[J]. Haiyang Xuebao，2016，38(6)：62—68，doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2016.06.007