楊容孑，劉柿良，宋會(huì)興，楊亞男，潘遠(yuǎn)智

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，四川 成都 611130

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不同氮形態(tài)對(duì)龍葵鎘積累、抗氧化系統(tǒng)和氮同化的影響

楊容孑，劉柿良，宋會(huì)興，楊亞男，潘遠(yuǎn)智*

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，四川 成都 611130

摘要：以鎘超積累植物龍葵（Solanum nigrum L.）為材料研究了不同氮形態(tài)對(duì)其鎘（Cd）積累的影響及其生理響應(yīng)機(jī)制，為今后利用龍葵進(jìn)行植物冶金和鎘污染土壤修復(fù)提供理論依據(jù)。采用龍葵室內(nèi)盆栽控制試驗(yàn)，采用不同濃度3種氮形態(tài)［銨態(tài)氮（NH4）2SO4、硝態(tài)氮NaNO3、硝態(tài)-銨態(tài)氮NH4NO3］處理，以植株生長(zhǎng)為重要參考，研究其對(duì)鎘積累、抗氧化系統(tǒng)和氮同化的影響。結(jié)果表明，（1）鎘（10～160 mg·kg-1）顯著影響龍葵生長(zhǎng)，降低生物量積累；外施3種形態(tài)氮均能緩解40 mg·kg-1鎘毒害，提高地上部生物量、葉綠素含量和鎘累積量，且銨態(tài)氮對(duì)生物量增產(chǎn)與鎘累積效果優(yōu)于其他形態(tài)氮肥，其中400 mg·kg-1的NH4SO4最為明顯。（2）植株葉片過(guò)氧化氫（H2O2）水平隨施銨態(tài)氮和銨態(tài)-硝態(tài)氮量增加而降低，隨施硝態(tài)氮量增加而先降后升。（3）過(guò)氧化氫酶（CAT）和過(guò)氧化物酶（POD）隨施硝態(tài)氮與硝態(tài)-銨態(tài)氮濃度增加而減低，超氧化物歧化酶（SOD）活性隨施硝態(tài)氮量增加先升后降；POD活性隨施加銨態(tài)氮濃度增加而逐漸升高，顯示銨態(tài)氮能顯著提升幼苗抗氧化能力。（4）隨硝態(tài)氮施加量增加，硝酸還原酶（NR）和谷氨酰胺合成酶（GS）活性先升后降；而GS活性在銨態(tài)氮施加量為100 mg·kg-1時(shí)達(dá)到最大，隨后逐漸降低。同時(shí)，谷氨酸脫氫酶（GDH）活性隨著3種不同形態(tài)氮施加量的增加逐漸降低。從植物修復(fù)角度出發(fā)，銨態(tài)氮對(duì)龍葵的強(qiáng)化修復(fù)效果優(yōu)于硝態(tài)氮與硝態(tài)-銨態(tài)氮，尤其是400 mg·kg-1的NH4+為龍葵鎘修復(fù)的最佳濃度。

關(guān)鍵詞：龍葵；氮形態(tài)；鎘脅迫；氮同化；抗氧化系統(tǒng)

引用格式：楊容孑，劉柿良，宋會(huì)興，楊亞男，潘遠(yuǎn)智.不同氮形態(tài)對(duì)龍葵鎘積累、抗氧化系統(tǒng)和氮同化的影響［J］.生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2016，25（4）:715-723.

YANG Rongjie，LIU Shiliang，SONG Huixing，YANG Yanan，PAN Yuanzhi.Impacts of Different Nitrogen Forms on Cadmium Accumulation，Antioxidant System and Nitrogen Assimilation in Hyperaccumulator Solanum Nigrum L.［J］.Ecology and Environmental Sciences，2016，25（4）:715-723.

近年來(lái)，土壤重金屬污染已成為危害人類(lèi)健康的重大因素（劉柿良等，2013；張永平等，2014；Liu et al.，2016）。植物修復(fù)技術(shù)，尤其利用超積累植物（Hyperaccumulators）對(duì)土壤重金屬進(jìn)行植物提取，已被認(rèn)為是成本最低且對(duì)環(huán)境無(wú)二次污染的友好型治理技術(shù)（Wang et al.，2008）。然而，目前發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)超積累植物生長(zhǎng)緩慢，生物量較?。▌⑹亮嫉?，2014；Liu et al.，2015；李虹穎等，2016），修復(fù)效率低且不適宜大面積使用，從而限制了該技術(shù)的應(yīng)用和推廣。同時(shí)，植物吸取修復(fù)效率與土壤污染物濃度及其有效性相關(guān)，即污染物濃度越高，修復(fù)效率越低（胡鵬杰等，2014）。研究表明，通過(guò)增施肥料、土壤改良等農(nóng)藝措施可提高修復(fù)植物生長(zhǎng)速度、生物量及重金屬積累量（Xu et al.，2010；Li et al.，2014），是提高植物修復(fù)效率最有效手段之一。

土壤-植物系統(tǒng)中，氮（N）素是植物必需“生命元素”和生長(zhǎng)限制元素（Vitousek et al.，2010；張敏等，2013；陳久耿等，2014）。氮肥作為最常用的化肥，在提高作物產(chǎn)量、改善品質(zhì)和培肥地力等方面作用顯著（Maier et al.，2002；張敏等，2013；張永平等，2014）；且能影響植物生物分配格局，以及土壤重金屬生物有效性和植物對(duì)重金屬的吸收能力（胡鵬杰等，2014；劉柿良等，2015）。因此，通過(guò)合理施用氮肥，提高重金屬污染土壤的修復(fù)效率，是目前植物修復(fù)的重要強(qiáng)化措施之一。研究表明，隨氮肥用量的增加，土壤鎘的生物有效性提高，但不同形態(tài)氮肥對(duì)其影響差異顯著（Maier etal.，2002）。例如，施用銨態(tài)氮肥（NH4+-N）降低鉛（Pb）對(duì)魚(yú)腥草（Houttuynia cordata）的毒害，促進(jìn)玉米（Zea mays）對(duì)重金屬的吸收；硝態(tài)氮肥（NO3--N）則利于Pb2+由魚(yú)腥草根部向上轉(zhuǎn)移（樓玉蘭等，2005；楊剛等，2007），其原因是由于不同形態(tài)氮對(duì)植物生長(zhǎng)的表型影響不盡相同（楊剛等，2007）。目前，有關(guān)氮肥對(duì)超積累植物重金屬積累及氮同化的影響極少報(bào)道，其對(duì)植物的調(diào)節(jié)機(jī)理也尚未明了。

龍葵（Solanum nigrum L.）是我國(guó)新近發(fā)現(xiàn)的鎘超積累植物（Wei et al.，2004），不僅生物量大，對(duì)土壤鎘具超積累特性，且具有多年生、無(wú)性繁殖、適于刈割的特點(diǎn)，是實(shí)施植物修復(fù)和研究植物超積累機(jī)制的優(yōu)良材料。然而，目前對(duì)優(yōu)化龍葵修復(fù)效率的農(nóng)藝措施研究不多，施用不同形態(tài)氮對(duì)鎘積累的促進(jìn)作用及其機(jī)理也尚未報(bào)道。因此，本文通過(guò)盆栽控制試驗(yàn)，比較研究不同形態(tài)氮肥對(duì)龍葵幼苗鎘積累、抗氧化系統(tǒng)和氮同化的影響，以期為龍葵進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)推動(dòng)重金屬污染土壤的植物修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用推廣具有重要意義。

1　材料與方法

1.1供試材料

供試龍葵種子由北京醫(yī)科院藥用植物研究所提供。試供土壤采于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)實(shí)驗(yàn)基地（103o51'E，30o42'N）周邊自然土壤［黃壤（紫色土），即園土］，不含腐葉根，采樣深度為表層0～20 cm；發(fā)酵土由成都溫江區(qū)花木交易中心提供。氮肥為：銨態(tài)氮［（NH4）2SO4］、硝態(tài)氮（NaNO3）、硝態(tài)-銨態(tài)氮（NH4NO3），不含結(jié)晶水；試驗(yàn)試劑為氯化鎘（CdCl2·2.5H2O），均為分析純。

1.2試驗(yàn)方法

2014年6月中旬，將采集的園土自然風(fēng)干、搗碎、剔除雜物，研磨，過(guò)5 mm篩。按1∶1（W/W）將發(fā)酵土和園土均勻混合成試驗(yàn)種植土，在干燥的實(shí)驗(yàn)室堆積靜置45 d。然后將種植土（干土）按照每盆5.00 kg標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一裝入帶托盤(pán)塑料花盆。將裝有種植土的塑料花盆置于實(shí)驗(yàn)大棚，用不含鎘等干擾物質(zhì)的柱層析去離子水控制土壤含水量為田間持水量的60%。種植土（園土+發(fā)酵土）的基本理化性質(zhì)為：pH值6.8，全氮（N）0.73 g·kg-1，全磷（P）0.38 g·kg-1，全鉀（K）3.76 g·kg-1，有機(jī)碳（C）32.92 g·kg-1，總Cd為0.419 mg·kg-1。

2014年8月15日，將龍葵種子消毒后播種于穴盤(pán)。待幼苗長(zhǎng)出4片真葉時(shí)，挑選健壯且長(zhǎng)勢(shì)一致的植株移栽至塑料花盆，每盆3株，種植深度1.5～2.0 cm。植物恢復(fù)生長(zhǎng)后，于2013年9月29日開(kāi)始鎘處理。根據(jù)國(guó)家土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和四川盆地重金屬污染發(fā)展概況，以不添加鎘作為對(duì)照，鎘處理水平為：10、20、40、80和160 mg·kg-1（不含背景值，以Cd2+計(jì)），每處理3次重復(fù)。按預(yù)先設(shè)置水平于每盆中添加Cd2+，添加方法為以分析純CdCl2·2.5H2O與去離子水配制成500 mL溶液均勻施入塑料盆（滲出液反復(fù)回收澆灌）。2014年10月1日收獲不同處理下的龍葵植株，測(cè)定植株根長(zhǎng)、株高及各器官干重，獲得最佳鎘脅迫濃度以進(jìn)一步試驗(yàn)。

2014年10月5日，按照上述方法處理種植土和試供植物。待植物恢復(fù)生長(zhǎng)后，以固體形式施加氮肥和鎘（最佳濃度）。試驗(yàn)中，3種形態(tài)氮素的處理水平分別設(shè)定為：0［CK］、25［N25］、50［N50］、100［N100］、200［N200］、400［N400］ mg·kg-1（干土）。為保證最終施入土壤的氮量相同，施加硝態(tài)氮（NO3+-N，NaNO3）量分別為：795、1590、3180、6360和12720 mg；銨態(tài)氮［NH4+-N，（NH4）2SO4］量為：590、1180、2360、4720和9440 mg；硝態(tài)-銨態(tài)氮［NO3+/NH4+-N，NH4NO3］為：357、714、1428、2856和5712 mg。2014年11月7日收獲不同處理龍葵植株，蒸餾水?dāng)?shù)次洗凈（根系在20 mmol·L-1Na2-EDTA溶液中浸泡15 min），待測(cè)。測(cè)定均重復(fù)3次。

試驗(yàn)中，精心養(yǎng)護(hù)管理，視植物的生長(zhǎng)情況澆水，澆水時(shí)將溢出的水倒回盆內(nèi)。同時(shí)，若盆內(nèi)有雜草應(yīng)及時(shí)拔掉放回盆中，減少水分與養(yǎng)分的流失。為避免其他物質(zhì)影響結(jié)果，試驗(yàn)中不噴施農(nóng)藥，不追施化肥。該試驗(yàn)大棚中透光率為80%，溫度（26±3）℃，室內(nèi)外溫度接近，平均相對(duì)濕度約為70%。

1.3測(cè)定方法

選取不同處理下幼苗，采用游標(biāo)卡尺測(cè)量根長(zhǎng)（主根長(zhǎng)）、基徑和株高。同時(shí)，參照李合生等（2000）方法測(cè)定葉片葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）含量，計(jì)算總?cè)~綠素（Chl）及葉綠素a/b（Chla/b）。同時(shí)，樣品分為地上部（葉、莖和果）和地下部（根系）。105 ℃烘箱內(nèi)殺青30 min，再在75 ℃下烘干至恒重，計(jì)算單株生物量。

植物組織中Cd測(cè)定。稱(chēng)取0.1 g樣品在電爐上炭化，后在550 ℃馬福爐中干灰化6 h，5 mL 6 mol·L-1HCL溶解，過(guò)濾，0.1 mol·L-1HCL定容至50 mL，使用火焰原子吸收光譜儀（SHIMADZU AA-6300，Kyoto，Japan）測(cè)定Cd（李虹穎等，2016）。

取0.2 g新鮮葉片置于預(yù)冷研缽中，加入5 mL預(yù)冷50 mmol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.8）研磨，然后用磷酸緩沖液（PBS）定容至10 mL在4 ℃下離心15 min（10000×g），取上清液并測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）、過(guò)氧化氫（H2O2）含量。MDA含量測(cè)定采用Cakmak et al.（1992）方法測(cè)定；H2O2含量測(cè)定參照Patterson et al.（1984）方法。同時(shí)，參照李合生等（2000）方法采用紫外吸收法測(cè)定CAT活性，3 mL反應(yīng)體系中含有50 mmol·L-1PBS和10 μL 30% H2O2，加入0.1 mL酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)（不加H2O2為對(duì)照），反應(yīng)5 min后測(cè)?240降低速率，每分鐘?240降低0.01定義為1個(gè)酶活力單位［U/（g·min-1）］。同時(shí)，采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性（1），采用氮藍(lán)四唑光化還原法測(cè)定SOD活性（2），其計(jì)算公式分別為：

其中，?470為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光值變化；WF（g）為材料鮮重；T（min）為反應(yīng)時(shí)間；VT（mL）為提取酶總體積（mL）；VS（mL）為取用酶液體積。

其中，A1為照光對(duì)照管吸光度；A2為樣品管吸光度；V（mL）為樣品液總體積；Vt（mL）為測(cè)定樣品用量；W（g）為鮮重。

參照Nagalakshmi et al.（2001）方法，采用巰基試劑2-硝基苯甲酸（DTNB）測(cè)定還原型谷胱甘肽（GSH）含量。取1.0 g樣品，加入3 mL 3%的三氯乙酸（TCA）研磨勻漿離心（10000×g，20 min），取上清液1 mL于試管中，加入2 mL 150 mmol·L-1NaH2PO4溶液（pH 7.7），混合后加入DTNB試劑（39.6 mg DTNB溶解于10 mL 0.15 mol·L-1PBS，PBS溶液 pH=7.0），5 min后測(cè)定?412吸光度。

參照Wallace et al.（1965）的方法測(cè)定硝酸還原酶（NR）活性。取鮮樣0.5 g，向?qū)φ赵嚬苤屑尤?.0 mL 30% TCA溶液，再向各試管加入9.0 mL 0.1 mol·L-1KNO3溶液，抽氣1 h，25 ℃暗反應(yīng)30 min后加入1.0 mL 30% TCA、2.0 mL 1%磺胺溶液和2.0 mL 0.02%萘胺溶液顯色20 min，540 nm下比色。同時(shí)，稱(chēng)取0.5 g預(yù)冷鮮樣，加入4.0 mL 0.05 mol·L-1pH 7.4的磷酸緩沖液（含0.4 mol·L-1蔗糖、4 mmol·L-1L-半胱氨酸）于研缽，10000×g離心10 min，上清液用于酶活性測(cè)定。采用Kaiser et al.（1984）方法測(cè)定谷氨酰胺合成酶（GS）活性；谷氨酸脫氫酶（GDH）活性測(cè)定采用Singh et al.（1986）方法。

1.4數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，單因素方差檢驗(yàn)（One-way ANOVA）和最小顯著性差異法（LSD）檢驗(yàn)，Microsoft Excel 2013制表作圖。顯著性水平設(shè)定為α=0.05。數(shù)據(jù)表達(dá)方式為：平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。

2　結(jié)果與分析

2.1鎘對(duì)龍葵幼苗生長(zhǎng)及生物量的影響

株高和基徑粗是植物生長(zhǎng)的重要指標(biāo)。表1顯示，根長(zhǎng)與基徑均隨鎘脅迫濃度的增大而先升高后降低，在10、20或40 mg·kg-1鎘處理時(shí)達(dá)到最大；而株高則在20 mg·kg-1鎘處理時(shí)達(dá)最大值，160 mg·kg-1鎘處理時(shí)較對(duì)照（0 mg·kg-1鎘處理）差異不顯著（P＞0.05）。隨著鎘脅迫程度增強(qiáng)，龍葵幼苗單株和根系干重在0～40 mg·kg-1處理間差異不顯著，莖、葉和果實(shí)干重的變化趨勢(shì)不一。與對(duì)照相比，果實(shí)干重則在20和40 mg·kg-1鎘處理下無(wú)明顯變化，高濃度鎘（80和160 mg·kg-1）脅迫顯著降低其生物量。因此，本研究選擇4 0 mg·kg-1鎘濃度進(jìn)一步試驗(yàn)。

2.2不同形態(tài)氮對(duì)鎘脅迫下龍葵生物量的影響

40 mg·kg-1鎘處理下，施加硝態(tài)氮的龍葵地上部干重在200 mg·kg-1處理時(shí)顯著增加，施氮量為200和400 mg·kg-1時(shí)較對(duì)照（CK）處理提高60.81% 和61.15%；而地下部干重卻無(wú)明顯變化（P＞0.05）。相似地，龍葵地上部干重隨施銨態(tài)氮量增加逐漸增加，施加25和50 mg·kg-1時(shí)則與CK處理無(wú)顯著差異；而施加不同濃度銨態(tài)氮對(duì)地下部干重?zé)o顯著影響。同時(shí)，隨施加硝態(tài)-銨態(tài)氮量增加，地上部干重逐漸增加，而地下部干重在施氮量為50 mg·kg-1時(shí)發(fā)生轉(zhuǎn)折。當(dāng)施400 mg·kg-1銨態(tài)氮時(shí)，地上部干重較CK提高88.76%，增量顯著高于施用400 mg·kg-1硝態(tài)氮（61.15%）與硝態(tài)-銨態(tài)氮（76.75%）較CK處理的增量（表2）。

表1　鎘處理下龍葵幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)及器官干重的變化Table 1 Growth index and dry weight of different parts of S.nigrumplants under Cd treatments

表2　不同形態(tài)氮對(duì)鎘處理下龍葵幼苗干重的影響Table 2 Effect of different nitrogen forms on dry weight of S.nigrum plants under Cd treatments

2.3不同形態(tài)氮對(duì)鎘脅迫下龍葵Cd積累的影響

施加不同濃度硝態(tài)氮，龍葵地上部鎘累積量（μg·g-1）隨施加濃度升高而顯著增加，當(dāng)施加量為400 mg·kg-1時(shí)較CK處理提高23.15%；地下部鎘累積量在50和100 mg·kg-1施氮量時(shí)升高到最大，隨之逐漸降低。與之不同地，地下部鎘累積量在100 mg·kg-1施加硝態(tài)-銨態(tài)氮時(shí)達(dá)到最高，隨后與之持平。而施加銨態(tài)氮時(shí)，地上部和根系鎘累積量隨施加濃度升高而增大，400 mg·kg-1施氮量時(shí)鎘累積最高，且較CK處理分別提升56.48%和94.24%（表3）。同時(shí)，銨態(tài)氮對(duì)龍葵地上部和根系鎘的累積能力在施氮量為400 mg·kg-1時(shí)顯著高于銨態(tài)氮和硝態(tài)-銨態(tài)氮。另一方面，施加氮肥顯著影響龍葵單株對(duì)土壤鎘的累積（μg·plant-1）。隨著不同形態(tài)氮施加量增加，單株鎘累積量均表現(xiàn)為不同程度地增加。其中，施加200和400 mg·kg-1銨態(tài)氮時(shí)單株鎘累積量達(dá)最大，較CK處理提升149.84%和152.90%，且在此處理下單株累積量顯著高于硝態(tài)氮和硝態(tài)-銨態(tài)氮處理組（表4）。

2.4不同形態(tài)氮對(duì)鎘脅迫下龍葵葉綠素的影響

施3種形態(tài)氮肥時(shí)，Chla、Chlb、Chl含量均隨施加濃度增加而呈不同程度增加，在濃度為400 mg·kg-1時(shí)達(dá)到最大值（表5）。施加400 mg·kg-1銨態(tài)氮時(shí)，Chl含量較CK顯著提升86.97%，顯著高于施加銨態(tài)氮（75.91%）和硝態(tài)-銨態(tài)氮（59.41%）引起的增加量；且在400 mg·kg-1施氮量時(shí)，Chla、Chlb、Chl含量在施加銨態(tài)氮時(shí)顯著高于銨態(tài)氮和銨態(tài)-硝態(tài)氮處理。同時(shí)，施加硝態(tài)-銨態(tài)氮下的Chla/b隨施加濃度增加逐漸降低，而施加其他兩種形態(tài)氮肥時(shí)無(wú)明顯變化（P＞0.05）。

2.5不同形態(tài)氮對(duì)鎘脅迫下抗氧化系統(tǒng)的影響

表3　不同形態(tài)氮對(duì)鎘處理下龍葵植株組織鎘累積的影響Table 3 Effect of different nitrogen forms on Cd accumulation in shoot and root of S.nigrum plants under Cd treatments

表4　不同形態(tài)氮對(duì)鎘處理下龍葵單株鎘累積的影響Table 4 Effect of different nitrogen forms on Cd accumulation in the whole plants under Cd treatments

龍葵葉片活性氧（H2O2）水平隨施銨態(tài)氮和銨態(tài)-硝態(tài)氮量的增加而降低，隨施硝態(tài)氮量增加而先降（100和200 mg·kg-1）后升（圖1A）。相似地，MDA含量在施硝態(tài)-銨態(tài)氮量為50 mg·kg-1時(shí)最低，后升高到穩(wěn)定值（100～400 mg·kg-1）；MDA含量隨其他兩種形態(tài)氮施加量增加而逐漸降低（圖1B）。

表5　不同形態(tài)氮對(duì)鎘脅迫下龍葵葉綠素含量的影響Table 5 Effect of different nitrogen forms on chlorophyll content of S.nigrum under Cd treatments

圖1　不同形態(tài)氮對(duì)鎘脅迫下龍葵葉片抗氧化系統(tǒng)的影響Fig.1 Effect of different nitrogen forms on antioxidative system of S.nigrum under different Cd treatments

施加硝態(tài)氮時(shí)，CAT和POD隨著施加濃度增加而減低，SOD活性則先升后降，施加量為25或50 mg·kg-1時(shí)達(dá)到最高值，200和400 mg·kg-1時(shí)無(wú)顯著差異（圖1C～E）。隨施加銨態(tài)氮濃度增加，SOD活性逐漸降低，POD則逐漸升高；CAT則在施加量為25和50 mg·kg-1時(shí)升高后逐漸降低。同時(shí)，SOD和CAT隨施加硝態(tài)-銨態(tài)氮量增加而減低，POD活性則先升高后降低。特別地，施加不同濃度的硝態(tài)-銨態(tài)氮并沒(méi)有改變GSH含量（P＞0.05；圖1F）。

2.6不同形態(tài)氮對(duì)鎘脅迫下龍葵氮同化的影響

與CK相比，NR和GS活性均隨硝態(tài)氮施加量的增加先升后降，在施加量為25～100 mg·kg-1時(shí)無(wú)顯著差異（P＞0.05）；施加不同濃度銨態(tài)氮和硝態(tài)-銨態(tài)氮時(shí)的NR，以及施加硝態(tài)-銨態(tài)氮時(shí)的GS活性隨施加濃度的升高而升高，在100～400 mg·kg-1時(shí)無(wú)明顯變化；而GS活性在銨態(tài)氮施加量為100 mg·kg-1時(shí)達(dá)到最大，隨后逐漸降低（圖2A～B）。由圖2C可知，GDH活性隨著3種不同形態(tài)氮施加量的增加逐漸降低。其中，GDH活性在施加不同濃度硝態(tài)-銨態(tài)氮肥時(shí)顯著低于對(duì)照處理，且不同濃度氮處理間無(wú)顯著性差異。

圖2　不同形態(tài)氮對(duì)鎘脅迫下龍葵葉片氮同化酶活性的影響Fig.2 Effect of different nitrogen forms on nitrogen assimilation enzymes of S.nigrum under Cd treatments

3　討論

3.1銨態(tài)氮較硝態(tài)氮可顯著提高龍葵的抗鎘性

目前，關(guān)于Cd毒與氮交互報(bào)道多集中于Cd脅迫干擾、破壞正常氮代謝以及抑制植物生長(zhǎng)等方面。一般認(rèn)為，Cd脅迫使硝酸還原酶（NR）活性受抑制，從而干擾植物正常氮素代謝。研究表明，Cd抑制NR主要通過(guò)兩條途徑：Cd2+與NR疏基結(jié)合；Cd2+誘導(dǎo)ROS生成從而抑制NR（Hemalatha et al.，1997）。施加100～400 mg·kg-1銨態(tài)氮顯著提升龍葵葉片NR活性，且維持在相對(duì)穩(wěn)定水平；而施加200 mg·kg-1硝態(tài)氮時(shí)顯著低于施加25～100 mg·kg-1處理（圖2A），表明施加不同形態(tài)氮對(duì)Cd毒具不同程度緩解作用，而高濃度（100～400 mg·kg-1）銨態(tài)氮作用效果顯著高于硝態(tài)氮和銨態(tài)-硝態(tài)氮。研究顯示，3種形態(tài)氮對(duì)植株地上和地下部Cd積累量均有提高，而銨態(tài)氮的效果優(yōu)于硝態(tài)氮或硝態(tài)-銨態(tài)氮，特別在施加濃度為400 mg·kg-1時(shí)最為顯著。Willaert et al.（1992）研究發(fā)現(xiàn)，銨態(tài)氮能顯著促進(jìn)菠菜（Spinacia oleracea）對(duì)Cd2+吸收，同時(shí)水培下的萵苣（Lactuca sativa）在銨態(tài)氮處理下比在硝態(tài)氮處理下對(duì)Cd的累積能力更強(qiáng)。楊錨等（2006）認(rèn)為，銨態(tài)氮增加Cd的有效性從而增加對(duì)Cd的累積，可能是由于土壤中水溶性Cd含量較高。然而，水溶性Cd含量在土壤中的有效態(tài)Cd中占有的比例卻很低，植物對(duì)Cd的吸收和累積能力有限（Wang et al.，2008）。而地上部作為龍葵累積Cd的主要部位（表3～4），其積累量是衡量龍葵修復(fù)效率的關(guān)鍵指標(biāo)。綜上所述，銨態(tài)氮對(duì)龍葵的強(qiáng)化修復(fù)效果優(yōu)于硝態(tài)氮與硝態(tài)-銨態(tài)氮，尤其是400 mg·kg-1的NH4+為龍葵鎘修復(fù)的最佳濃度。

3.2氮素形態(tài)影響龍葵抗鎘性可能機(jī)理

3.2.1氮素形態(tài)影響植物生長(zhǎng)和胞外PH值

研究顯示，龍葵地上部干重隨施加硝態(tài)氮與銨態(tài)氮量增大而增加，地下部干重卻無(wú)明顯變化。而施加硝態(tài)-銨態(tài)氮?jiǎng)t顯著提高幼苗地上部和地下部干重（表2）。這些結(jié)果表明，3種不同形態(tài)的氮肥可能均是以提高植株生物量的策略以適應(yīng)（鎘）脅迫環(huán)境（樓玉蘭等，2005；陳久耿等，2014），而400 mg·kg-1銨態(tài)氮處理對(duì)生物量的增產(chǎn)效果明顯好于硝態(tài)氮或硝態(tài)-銨態(tài)氮。同時(shí)，Chla、Chlb 和Chl含量均隨3種形態(tài)氮施量增加而增加（表5）。表明不同形態(tài)氮肥能保護(hù)葉綠體結(jié)構(gòu)的完整性以及葉綠素合成過(guò)程的酶活性（Vitousek et al.，2010），降低葉綠體受到的毒害作用。究其原因，可能是由于氮有助于葉綠素含量的平衡，促進(jìn)Cd脅迫下類(lèi)囊體膜蛋白復(fù)合體的組裝和穩(wěn)定，增強(qiáng)水的光解和電子傳遞的速率（張永平等，2014；Liu et al.，2016）。而本研究中Chla/b在施加硝態(tài)-銨態(tài)氮時(shí)差異顯著，施加銨態(tài)氮和硝態(tài)氮卻無(wú)明顯變化，其原因有待進(jìn)一步研究。

對(duì)植物施加單一形態(tài)氮素，或由于植物偏好吸收某一形態(tài)氮素，由于離子吸收不平衡，會(huì)造成生長(zhǎng)介質(zhì)pH值變化。通常情況下，偏好吸收NH4+-N會(huì)使介質(zhì)pH下降，偏好NO3-N會(huì)使介質(zhì)pH上升；且各種金屬離子在酸性條件下生物有效性高，pH值上升則有效性降低（Stratton et al.，2001）。同時(shí)，Eriksson（1990）研究表明，銨態(tài)氮產(chǎn)生NH4+被施入土壤后，通過(guò)硝化作用能在較短時(shí)間內(nèi)使土壤pH值降低。本研究中，施加不同濃度銨態(tài)氮會(huì)降低胞外pH，提高Cd2+生物有效性，促進(jìn)超累積植物龍葵對(duì)Cd離子的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，這也與施銨態(tài)氮時(shí)其地上部Cd2+累積量顯著高于硝態(tài)氮具有一致性（表4）。同時(shí)，在強(qiáng)酸性環(huán)境下，龍葵可能強(qiáng)化了質(zhì)膜H+-ATPase活性，把胞質(zhì)內(nèi)多余H+泵出胞外，在細(xì)胞膜微小區(qū)域內(nèi)形成更高電勢(shì)區(qū)，從而減少金屬陽(yáng)離子進(jìn)入細(xì)胞（Takei et al.，2002）。同時(shí)，鎘離子進(jìn)入植株細(xì)胞會(huì)抑制NR活性（數(shù)據(jù)未顯示），NH4+在體內(nèi)還原利用會(huì)產(chǎn)生大量H+，降低胞質(zhì)pH，在一定程度上提升Cd有效性，這可能與酸性條件會(huì)激發(fā)電負(fù)性基團(tuán)富集，加強(qiáng)與Cd2+結(jié)合使其沉淀在胞外而解除Cd毒害（Li et al.，2014）。

3.2.2氮素形態(tài)影響抗氧化系統(tǒng)

保護(hù)酶系統(tǒng)在活性氧清除、抑制膜脂過(guò)氧化等植物抗逆生理方面發(fā)揮作用。本研究中，施加不同形態(tài)氮肥較對(duì)照（CK）顯著降低龍葵葉片活性氧（H2O2與MDA，圖1），表明3種形態(tài)氮顯著緩解Cd毒害。同時(shí)，施加不同濃度硝態(tài)氮降低葉片CAT 和POD活性，而SOD活性在施氮量50～100 mg·kg-1時(shí)上升，隨后逐漸降低。施加較低濃度硝態(tài)氮作用下，SOD在催化活性氧過(guò)程中起主導(dǎo)作用（Liu et al.，2015），這可能是因?yàn)榈∟O3-）作為抗性基因的信號(hào)分子，增強(qiáng)SOD編碼基因mRNA表達(dá)量（Pankovic et al.，2000），誘導(dǎo)同工酶Zn-SOD表達(dá)的結(jié)果。當(dāng)植物根系受外界硝態(tài)氮誘導(dǎo)時(shí)，根系對(duì)NO3-的吸收能力迅速增加，NO3-可明顯誘導(dǎo)TaNRT 2.1和TaNRT 2.3表達(dá)（Vidmar et al.，2000），增加氮吸收與其ROS代謝具有相關(guān)性。隨施加銨態(tài)氮濃度的增加，CAT活性先升后降，POD活性逐漸增強(qiáng)，而SOD活性則逐漸降低。表明施加較低濃度銨態(tài)氮時(shí)，POD與CAT在催化活性氧的過(guò)程中起著主導(dǎo)作用；而在較高濃度下則由POD單獨(dú)作用ROS清除。相似地，POD在較低濃度硝態(tài)-銨態(tài)氮施加時(shí)起主導(dǎo)作用。這可能是由于氮對(duì)含鐵酶類(lèi)（CAT、APX等）有很高的親和性，能誘導(dǎo)同工酶CAT1和CAT2的表達(dá)或調(diào)節(jié)CAT與細(xì)胞色素C氧化酶（COX）等含血紅素鐵酶類(lèi)活性（張永平等，2014）。同時(shí)，通過(guò)GSH含量的升高激活抗壞血酸-谷胱甘肽（AA-GSH）循環(huán)有效運(yùn)轉(zhuǎn)，然后通過(guò)鳥(niǎo)甘酸環(huán)化酶（GC）介導(dǎo)催化三磷酸鳥(niǎo)苷（GTP）轉(zhuǎn)化為鳥(niǎo)嘌呤核糖苷-3'（cGMP）實(shí)現(xiàn)（Xu et al.，2010）。因此，施加較低或較高濃度銨態(tài)氮較硝態(tài)氮和硝態(tài)-銨態(tài)氮，顯示出較高效率提升抗氧化酶（POD）活性從而緩解Cd毒害效應(yīng)。

3.3.3氮素形態(tài)影響葉片氮同化

研究表明，植物吸收硝態(tài)氮是通過(guò)根細(xì)胞的質(zhì)膜載體，即高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（HATS-PTR）和低親和力轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（LATS-NNP），以相偶聯(lián)的跨膜質(zhì)子梯度能量驅(qū)動(dòng)，Cd脅迫顯著地降低質(zhì)膜P型ATPase活性。植物對(duì)氮素的吸收主要是以NO3--N的形式進(jìn)入植物體內(nèi)，即使用銨態(tài)氮或硝態(tài)-銨態(tài)氮都需要在土壤中經(jīng)硝化作用轉(zhuǎn)變?yōu)镹O3--N后被植物吸收利用（Carolina et al.，2010）。NR是植物同化硝態(tài)氮過(guò)程中的關(guān)鍵酶和限速酶。Hernandez et al.（1996）研究表明，一定濃度的Cd能夠抑制葉片的NR活性，降低根系對(duì)N的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究表明，40 mg·kg-1Cd脅迫顯著降低植株NR（圖2），NR活性的降低可能與植物中硝酸鹽含量減少相關(guān)。另一方面，植物根系吸收的NO3--N必須在NR作用還原成NH4+-N（Gibson，2005），經(jīng)過(guò)GS-GOGTA循環(huán)在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成氨基酸，才能完成氨初級(jí)同化。而GS作為氮代謝中心的多功能酶，活性提高對(duì)其代謝效率起著關(guān)鍵性作用。Chien et al.（2000）對(duì)水稻（Oryza glaberrima）的研究表明，Cd脅迫顯著降低GS活性，從而降低水稻葉片和根系對(duì)NH4+-N的累積，本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了該觀點(diǎn)。GDH廣泛存在于植物組織中，Cd脅迫下可補(bǔ)充谷氨酸庫(kù)，為Cd-PCs合成提供原料。同時(shí)，GDH可實(shí)現(xiàn)對(duì)高濃度NH3循環(huán)解毒（NH3來(lái)自于GS活性降低及有機(jī)N降解）（Gouia et al.，2000）。本試驗(yàn)中，植株GDH活性在鎘脅迫下顯著升高，表明在Cd脅迫下植物NH3同化過(guò)程可能起著重要作用（Chugh et al.，1992）。而施加不同形態(tài)氮肥則在不同程度上緩解了Cd對(duì)植物的脅迫作用，可能由于其能夠顯著提高還原動(dòng)力泵硝酸還原酶的活性，減少了硝酸鹽的累積（陳久耿等，2014）。研究發(fā)現(xiàn)，隨硝態(tài)氮施加濃度增大，NR與GS活性呈先升后降趨勢(shì)。隨施加銨態(tài)氮濃度增大，NR活性逐漸升高至穩(wěn)定，GS活性先升后降，GDH活性則逐漸降低至穩(wěn)定。而隨著添加硝態(tài)-銨態(tài)氮濃度增大，NR和GS活性逐漸升高至穩(wěn)定，緩解因Cd脅迫引起GOGAT活性所受到的抑制作用（趙新月等，2013）；而GDH在25～400 mg·kg-1處理間差異不顯著（圖2C）。Cd和不同形態(tài)氮引起的氮代謝變化非常復(fù)雜，可能由于水分匱乏或可利用氮和碳的改變，也可能是由于關(guān)鍵酶活性變化，具體原因還有待進(jìn)一步研究。

4　結(jié)論

綜上所述，3種形態(tài)氮素在一定程度上均能緩解Cd脅迫對(duì)龍葵幼苗的毒害效應(yīng)。然而，相對(duì)于施加硝態(tài)氮和硝態(tài)-銨態(tài)氮，銨態(tài)氮可顯著提高龍葵幼苗的抗鎘性，且在400 mg·kg-1的NH4+時(shí)效果最佳。同時(shí)，NH4+-N提高抗鎘性可能與植物葉綠素、胞外PH值、抗氧化系統(tǒng)及氮同化相關(guān)。因此，施加適宜濃度銨態(tài)氮能提升龍葵中的鎘含量和積累量，是修復(fù)鎘污染土壤的一項(xiàng)簡(jiǎn)單易行的農(nóng)藝措施。

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Impacts of Different Nitrogen Forms on Cadmium Accumulation，Antioxidant System and Nitrogen Assimilation in Hyperaccumulator Solanum Nigrum L.

YANG Rongjie，LIU Shiliang，SONG Huixing，YANG Yanan，PAN Yuanzhi*
College of Landscape Architecture，Sichuan AgriculturalUniversity，Chengdu 611130，China

Abstract：Solanum nigrum L.has been discovered to be a Cd hyperaccumulating species，and is therefore used for phytomining and phytoextracting Cd from contaminated soils.The effects of different nitrogen forms ［（NH4）2SO4，NaNO3，NH4NO3］ on plant growth，Cd accumulation，antioxidant system and nitrogen assimilation were investigated in the hyperaccumulator plant Solanum Nigrum L.The results showed that:（1） Cd treatments （10～160 mg·kg-1） significantly impacted biomass and diameter of root and shoot，and decreased the accumulation.However，the addition of three doses of nitrogen forms significantly alleviate the toxic effects of 40 mg·kg-1cadmium，which mainly due to the promotion of shoot biomass，Cd accumulation and chlorophyll contents.Moreover，（NH4）2SO4（400 mg·kg-1） is more effective in the accumulation of biomass than others.（2） The content of leaf hydrogen peroxide （H2O2） was decreased with increasing （NH4）2SO4and NH4NO3doses，while its level was declined first and then ascended with increasing NaNO3doses.（3） Similarly，activities of catalase （CAT） and peroxidase （POD） were decreased with increasing NaNO3and NH4NO3doses，while activity of superoxide dismutase （SOD） was declined first and then ascended with increasing NaNO3doses.Interestingly，with increasing （NH4）2SO4doses，POD activity was increased significantly，suggesting that （NH4）2SO4can markedly improve its antioxidant capacity.（4） The activities of nitrate reductase （NR） and glutamine synthetase （GS） were ascended first and then declined with increasing NaNO3doses，while the GS activity was the maximum value at concentration of 100 mg·kg-1（NH4）2SO4，and then gradually decreased.In addition，activity of glutamate dehydrogenase （GDH） was decreased with the increasing of nitrogen doses of three forms.Besides，the content of GSH did not showed significant differences among different NH4NO3doses.These indicate that the enhancing effect of （NH4）2SO4on Cd extraction is more obvious than that of NaNO3and NH4NO3.That is to say，（NH4）2SO4should be the better choice on the soil Cd phytoremediation of S.nigrum，thus it could be applied to strengthen S.nigrum L.phytoremediation of Cd-contaminated soils.

Key words：Solanum nigrum L.； nitrogen forms； cadmium stress； nitrogen assimilation； antioxidant system

DOI：10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.04.024

中圖分類(lèi)號(hào)：X171.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-5906（2016）04-0715-09

基金項(xiàng)目：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)科建設(shè)雙支計(jì)劃項(xiàng)目（03571458）

作者簡(jiǎn)介：楊容孑（1989年生），女，博士研究生，主要從事生態(tài)恢復(fù)與生態(tài)穩(wěn)定性研究。E-mail:arong.jie@163.com楊容孑與劉柿良為共同第一作者

*通信作者。E-mail:scpyzls@163.com

收稿日期：2016-01-20