鐵寧　張桂芝（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古　呼和浩特010059）

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甲氨蝶呤與雷公藤多苷片聯(lián)用對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用

鐵寧張桂芝
（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010059）

【摘要】目的觀察甲氨蝶呤與雷公藤多苷片聯(lián)用對大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的治療作用。方法50只大鼠隨機選取10只為正常組，其余40只建立Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠模型，然后分為模型組、甲氨蝶呤組、雷公藤組和聯(lián)合治療組，每組10只。采用甲氨蝶呤與雷公藤多苷片進行治療，用藥后每隔3 d評估其關(guān)節(jié)炎指數(shù)和腫脹度，治療7周后，采用ELISA法檢測關(guān)節(jié)液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6 （IL-6）水平，并通過實時熒光定量PCR法檢測大鼠滑膜組織中血管內(nèi)皮因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）mRNA的表達。結(jié)果與模型組相比，在用藥第24日、36日和48日各治療組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分和腫脹度顯著降低（P＜0.05），并且聯(lián)合治療組大鼠在用藥第24日、36日和48日的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分和腫脹度顯著低于甲氨蝶呤組和雷公藤組（P＜0.05）；與正常組相比，所有造模組大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α和IL-6水平均顯著提高（P＜0.05）；與模型組相比，各治療組大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α和IL-6水平均顯著降低（P＜0.05），并且聯(lián)合治療組大鼠關(guān)節(jié)液中IL-6的水平降低程度顯著高于甲氨蝶呤組和雷公藤組（P＜0.05）；與正常組相比，所有造模組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF、TGF-β1 mRNA表達均顯著提高（P＜0.05）；與模型組相比，各治療組VEGF、TGF-β1 mRNA表達均顯著降低（P＜0.05），并且聯(lián)合治療組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF、TGF-β1 mRNA表達的降低程度顯著高于甲氨蝶呤組和雷公藤組（P＜0.05）。結(jié)論甲氨蝶呤聯(lián)合雷公藤多苷治療RA能最大限度地發(fā)揮藥物的協(xié)同作用，促進RA大鼠癥狀改善，其作用機制可能與降低關(guān)節(jié)液中TNF-α和IL-6水平和抑制關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF、TGF-β1 mRNA表達有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】甲氨蝶呤雷公藤多苷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎實時熒光定量PCR療效

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一類由于自身免疫系統(tǒng)疾病引起滑膜慢性炎癥，出現(xiàn)關(guān)節(jié)病變，若不及時有效治療，極易形成侵襲性血管翳，最終導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)功能喪失［1］。目前，甲氨喋呤為國內(nèi)外公認RA治療的首選和基礎(chǔ)藥物，但療程較長，不少患者難以耐受［2］。雷公藤多苷為我國傳統(tǒng)中草藥雷公藤的主要活性成分，研究顯示其具有良好的抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和改善微循環(huán)活性的作用，對自身免疫性疾病RA的治療具有良好的前景［3］?；诖?，筆者通過建立Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠模型，研究甲氨蝶呤聯(lián)合雷公藤治療對其關(guān)節(jié)液中炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）的濃度水平及對滑膜炎癥發(fā)展起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）mRNA和血管內(nèi)皮因子（VEGF）mRNA表達的影響，探討二者聯(lián)合對治療RA作用效果?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物Wistar大鼠50只，雌性，10～12周齡，體質(zhì)量（200±20）g。由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。動物許可證號：SCXK（蒙）2015-0001。大鼠籠中散養(yǎng)，正常光照，室溫（25±2）℃，正常食水飼養(yǎng)。

1.2試劑與儀器甲氨蝶呤片（通化茂祥制藥有限公司，國藥準字H22022674，規(guī)格為2.5 mg/片），雷公藤多苷片（浙江普洛康裕天然藥物有限公司，國藥準字Z33020778，規(guī)格為10 mg/片），RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒和Ultra SYBR Mixture購于北京全式金生物技術(shù)有限公司公司，牛Ⅱ型膠原（10 mg）和不完全弗氏佐劑（5 mL）均購于德國Sigma公司，大鼠IL-6和TNF-α ELISA試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司，Multiskan MK3酶標(biāo)儀購于美國Thermo Fisher Scientific公司，ABI 7900HT型熒光定量PCR儀購于美國Applied Biosystems公司，Z216MK微量高速冷凍型離心機購于德國Hermle公司。

1.3造模與分組1）CIA大鼠模型建立［4］。在無菌條件下，利用均質(zhì)儀將牛Ⅱ型膠原和弗氏不完全佐劑按1∶1比例充分乳化，牛Ⅱ型膠原的終濃度為1 mg/mL。初次免疫位于尾根部左側(cè)皮內(nèi)，注射劑量為0.2 mL膠原乳劑。加強免疫在初次免疫1周后于尾根部右側(cè)皮內(nèi)及左腳趾處，注射劑量為0.2 mL膠原乳劑。2）動物分組及給藥方式。50只大鼠中隨機選取10只作為正常組，其余大鼠建立CIA模型。造模成功后，大鼠隨機分為模型組、甲氨蝶呤組、雷公藤組和聯(lián)合治療組，每組10只。

1.4給藥方法自造模2周后，治療組開始灌胃給藥，每日1次，連續(xù)灌胃7周。其中，甲氨蝶呤組給藥劑量為1 mg/kg，雷公藤組的給藥劑量為3 mg/kg。模型組和正常組灌服等體積的0.9%氯化鈉注射液。

1.5檢測方法1）關(guān)節(jié)炎指數(shù)和腫脹度測定。給藥后，每隔3 d對每個大鼠進行關(guān)節(jié)炎評分，并計算關(guān)節(jié)腫脹度。其中，關(guān)節(jié)炎評分標(biāo)準參照0～4級關(guān)節(jié)評分法［5］，即0分為腳爪正常，無紅腫癥狀；1分為趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)輕度紅腫；2分為趾關(guān)節(jié)和足趾出現(xiàn)紅腫；3分為整個腳爪出現(xiàn)紅腫；4分為踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫，并發(fā)生嚴重變形。關(guān)節(jié)腫脹體積采用趾體積測量儀進行測定，腫脹度（%）=（Vt-V0）/V0×100%，其中V0為造模前的容積，Vt為造模后的容積。2）關(guān)節(jié)液中TNF-α和IL-6測定。治療7周后，大鼠仰位固定，打開膝關(guān)節(jié)腔，用注射器取1 mL氯化鈉注射液注入關(guān)節(jié)腔中，然后收集關(guān)節(jié)腔液，并于4℃2000 rpm離心15 min，取上清液置于-80℃冰箱保存待測。參照大鼠ELISA試劑盒說明書測定TNF-α和IL-6含量。3）大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織TGF-β1 mRNA和VEGF mRNA表達的檢測。打開膝關(guān)節(jié)腔后，用眼科直鑷鈍性分離關(guān)節(jié)囊的滑膜層和纖維層，完整剝離滑膜組織，于-80℃冰箱保存待測。參照試劑盒說明書分別提取大鼠滑膜組織的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin為內(nèi)對照進行實時熒光定量，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火10 min，40個循環(huán)。根據(jù)Gene Bank提供Wistar大鼠TGF-β1、VEGF的mRNA序列設(shè)計目的基因的引物序列，見表1所示。根據(jù)各組的平均CT值，計算出每個目的基因相對表達量。

表1　目的基因的引物設(shè)計

1.6統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析。計量數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠不同時間點關(guān)節(jié)炎指數(shù)、腫脹度評分見表2，表3。大鼠建立CIA模型后，出現(xiàn)足趾關(guān)節(jié)紅腫，局部伴潰瘍，并且精神倦怠甚至萎靡，運動遲緩。正常組大鼠無上述現(xiàn)象。與模型組相比，在用藥第24日、36日和48日各治療組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分和腫脹度顯著降低（P＜0.05），并且聯(lián)合治療組大鼠在用藥第24日、36日和48日的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分和腫脹度顯著低于甲氨蝶呤組和雷公藤組（P＜0.05）。

表2　各組大鼠不同時間點關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分比較（分，±s）

表2　各組大鼠不同時間點關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分比較（分，±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與聯(lián)合治療組比較，△P＜0.05。下同。

組別　n正常組　10模型組　10甲氨蝶呤組　10 12 d　24 d　36 d　48 d 0000 4.76±1.37 8.06±2.93　7.82±3.05　7.74±2.91 4.52±1.08 6.63±1.76*△6.14±2.17*△5.78±1.52*△雷公藤組　10　4.59±0.95 6.84±1.31*△6.26±1.38*△5.73±1.04*△聯(lián)合治療組　10　4.43±0.81 5.97±1.24*5.40±0.95*　4.85±0.87*

表3　各組大鼠不同時間點腫脹度比較（%，±s）

表3　各組大鼠不同時間點腫脹度比較（%，±s）

組別　n正常組　10模型組　10甲氨蝶呤組　10 12 d　24 d　36 d　48 d 0 0 0 0 83.51±0.33 93.24±0.36　92.78±0.31　83.51±0.33 82.37±0.23 88.16±0.25*△85.24±0.23*△79.26±0.19*△雷公藤組　10 82.42±0.18 89.58±0.23*△86.59±0.26*△80.42±0.18*△聯(lián)合治療組　10 82.15±0.13 85.69±0.18*79.20±0.11*74.51±0.12*

2.2各組大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α和IL-6水平比較

見表4。結(jié)果顯示，與正常組相比，所有造模組大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α和IL-6水平均顯著提高（P＜0.05）；與模型組相比，各治療組大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α和IL-6水平均顯著降低（P＜0.05），并且聯(lián)合治療組大鼠關(guān)節(jié)液中IL-6的水平降低程度顯著高于甲氨蝶呤組和雷公藤組（P＜0.05）。

表4　各組大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α和IL-6水平比較（pg/mL，±s）

表4　各組大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α和IL-6水平比較（pg/mL，±s）

與正常組比較，*P＜0.05；與聯(lián)合治療組比較，△P＜0.05。下同。

組別　n　TNF-α　IL-6正常組　10　19.27±1.94　20.98±2.11模型組　10　46.25±8.53*　67.39±12.79*甲氨蝶呤組　10　25.51±3.31*　32.46±5.65**△雷公藤組　10　24.38±2.95*　28.71±3.70**△聯(lián)合治療組　10　23.73±2.49*　24.81±2.83**△

2.3各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織VEGF和TGF-β1表達的情況比較見表5。通過熒光定量PCR對凋亡基因VEGF、TGF-β1 mRNA表達進行定量分析。結(jié)果顯示，與正常組相比，所有造模組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF、TGF-β1 mRNA表達均顯著提高（P＜0.05）；與模型組相比，各治療組VEGF、TGF-β1 mRNA表達均顯著降低（P＜0.05），并且聯(lián)合治療組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF、TGF-β1 mRNA表達的降低程度顯著高于甲氨蝶呤組和雷公藤組（P＜0.05）。

表5　各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織VEGF和TGF-β1表達情況比較（μmol/mL，±s）

表5　各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織VEGF和TGF-β1表達情況比較（μmol/mL，±s）

組別　n　VEGF　TGF-β1正常組　10　0.288±0.079　0.257±0.054模型組　10　0.872±0.152*　0.752±0.177*甲氨蝶呤組　10　0.468±0.072**△　0.462±0.088**△雷公藤組　10　0.427±0.084**△　0.445±0.107**△聯(lián)合治療組　10　0.384±0.057**　0.402±0.065**

3　討論

雷公藤多苷作為雷公藤的主要活性成分，由于具有較強的祛風(fēng)除濕、通絡(luò)解毒、免疫調(diào)節(jié)活性而倍受關(guān)注。如何偉珍等［6］觀察雷公藤多苷治療老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能迅速改善與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的各項癥狀、體征和患者的生活質(zhì)量，并有良好的安全性。又如宋明愛等［7］研究發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷能抑制慢性腎小球腎炎患者血清中炎癥因子IL-6和TNF-α含量，促進患者康復(fù)。近年來，RA在我國的發(fā)病率逐年提高，并且治療后反復(fù)發(fā)作，致殘率較高，給患者身體健康和生活質(zhì)量帶來了嚴重威脅。目前全世界對RA的治療尚無較好的根治方法。我國多數(shù)醫(yī)家認為采用中西醫(yī)結(jié)合治療能最大限度地發(fā)揮藥物的協(xié)同作用，提高療效，降低毒副作用［8-9］。本研究中，筆者在用藥第24日、36日和48日各治療組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分和腫脹度均顯著低于模型組，并且聯(lián)合治療組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分和腫脹度降低程度顯著高于甲氨蝶呤組和雷公藤組，提示甲氨蝶呤和雷公藤多苷均能有效緩解RA癥狀，當(dāng)兩藥聯(lián)合作用有助于促進RA癥狀緩解。

既往研究表明，RA關(guān)節(jié)滑膜組織內(nèi)聚集大量免疫細胞，并分泌一系列炎癥因子，其中TNF-α和IL-6能夠激活淋巴T細胞表面CD40受體與滑膜細胞結(jié)合，啟動胞內(nèi)NK-κB核轉(zhuǎn)錄因子，進而促進細胞增殖和基質(zhì)金屬蛋白酶分泌，加速關(guān)節(jié)軟骨的破壞。因此，TNF-α和IL-6在RA的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［10-11］。本研究結(jié)果顯示與正常組相比，各治療組大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α和IL-6水平均顯著低于模型組，并且聯(lián)合治療組大鼠關(guān)節(jié)液中IL-6的水平降低程度顯著高于甲氨蝶呤組和雷公藤組，提示甲氨蝶呤和雷公藤多苷均能有效降低RA大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α和IL-6的水平，減輕細胞因子對滑膜細胞的刺激，緩解疾病的進一步惡化，并且當(dāng)兩藥聯(lián)合作用時，IL-6水平降低程度更高，對于破壞炎癥因子聚集構(gòu)成的惡性循環(huán)具有實際意義。

RA的發(fā)病過程涉及諸多基因的調(diào)控，比如VEGF、TGF-β1等，二者均是參與血管形成的重要因子。其中，VEGF不僅具有有絲分裂活性，通過高效地刺激血管內(nèi)皮細胞增生、移動并改變其基因表達，促使血管形成，同時還能增大血管內(nèi)皮細胞通透性，導(dǎo)致纖維蛋白滲出并凝結(jié)于血管外，構(gòu)成血管形成的臨時基質(zhì)［12］。因此，VEGF的高表達與RA滑膜血管翳的形成具有密切關(guān)系。TGF-β1是TGF-β家族的成員，研究發(fā)現(xiàn)其具有調(diào)節(jié)細胞生長和分化功能，其過度表達與滑膜細胞增生有密切關(guān)系。本研究中，筆者借助熒光定量PCR對VEGF、TGF-β1 mRNA表達進行定量分析，結(jié)果顯示，與模型組相比，各治療組VEGF、TGF-β1 mRNA表達均顯著低于模型組，并且聯(lián)合治療組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中VEGF、TGF-β1 mRNA表達的降低程度顯著高于甲氨蝶呤組和雷公藤組，提示甲氨蝶呤和雷公藤多苷可能通過抑制滑膜細胞的過度增生，抑制血管翳的形成，減輕軟骨與骨的破壞，起到阻止關(guān)節(jié)炎病程進展的作用，而且當(dāng)二者聯(lián)合作用時抑制效果更佳。

綜上所述，甲氨蝶呤聯(lián)合雷公藤多苷治療RA能最大限度地發(fā)揮藥物的協(xié)同作用，提高療效，進而緩解和阻止RA的進展作用，其作用機制可能是通過減輕細胞因子對滑膜細胞的刺激和抑制關(guān)節(jié)滑膜組織內(nèi)VEGF、TGF-β1的基因表達來實現(xiàn)的。

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·綜述·

·文獻分析·

中圖分類號：R285.5

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1004-745X（2016）04-0655-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.04.029

收稿日期（2015-10-29）