劉濱++劉新富++曾霖++孟振++劉江春

摘 要：報道了一種可以快速、靈敏地檢測七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒（NNV）的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法（RT-LAMP）。該方法參考赤點石斑魚NNV病毒的主衣殼蛋白（MCP）基因的保守序列，設(shè)計1對引物克隆出七帶石斑魚NNV的基因序列，利用Primer Explorer V4 軟件設(shè)計了3對針對所克隆NNV基因序列的特異性引物，建立了RT-LAMP的反應(yīng)體系，并分別對反應(yīng)系統(tǒng)的引物濃度、反應(yīng)溫度和時間進行了優(yōu)化，形成了七帶石斑魚NNV病毒RT-LAMP檢測技術(shù)。實踐應(yīng)用結(jié)果表明，在63 ℃的最佳反應(yīng)溫度下，采用RT-LAMP檢測技術(shù)經(jīng)過45 min就能完成一次檢測，準確率達到100 %。本研究建立的RT-LAMP檢測NNV技術(shù)設(shè)備要求簡單，為七帶石斑魚等石斑魚無NNV受精卵和仔稚魚的生產(chǎn)現(xiàn)場檢測和篩選提供了一種方便、靈敏的檢測方法。

關(guān)鍵詞：七帶石斑魚；神經(jīng)壞死病毒；檢測；RT-LAMP

中圖分類號：S941 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.07.006

Abstract：A rapid and sensitive technique for detecting of Nervous Necrosis Virus in seven-band grouper was developedthrough reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification（RT-LAMP） method. A set of six specific primers were designed based on MCP gene of Red-spotted Grouper Nervous Necrosis Virus （ RGNNV） using Primer Explorer V3 software. The parameters of primer concentration， reaction time and temperature were optimized.The RT-LAMP method established in this article was applied to detect nervous necrosis virus of seven-band grouper larvae in the fish farming field， the results showed that the sensitivity of RT-LAMP method was consistent with the nested RT-PCR method， as well as the detection result of RT-LAMP method could be easily determinate，andthe detection time was short， which can be completed within 2 hours. The RT-LAMP assay developed in this article wasvery suitable for rapid diagnosis of early NNV infection of seven-band grouper larvae in fish farming field.

Key words： seven-band grouper （Epinephelus septemfasciatus）； nervous necrosis virus （ NNV）； detection； reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification （RT-LAMP）

七帶石斑魚（Epinephelus septemfasciatus Thunberg，1793）是我國沿海分布緯度最高的石斑魚種類，除了具有個體大、生長速度快和經(jīng)濟價值高等特點外，對低溫的耐受能力較強，生存水溫9～34 ℃，攝食水溫12～32 ℃，有“冷水石斑”之稱，被認為是東北亞溫帶海域網(wǎng)箱養(yǎng)殖理想海水魚類品種之一[1]，其苗種繁育技術(shù)的突破，可以緩解我國東海北部和黃渤海沿岸網(wǎng)箱適養(yǎng)魚類品種缺乏的問題，因此備受業(yè)界重視。但是盡管國內(nèi)外研究多年，七帶石斑魚的苗種繁育技術(shù)始終不能穩(wěn)定，在所面臨的技術(shù)瓶頸中，神經(jīng)壞死病毒（nervous necrosis virus，NNV）造成的早期苗種死亡率居高不下是目前最亟待解決的關(guān)鍵問題。

病毒性神經(jīng)壞死?。╲iral nervousnecrosis，VNN）是造成多種海水魚類早期發(fā)育階段大量死亡的諾達病毒科（Nodaviridae）的一種小RNA病毒[2]，對石斑魚的危害尤為嚴重，常常造成90%以上的仔稚魚死亡。為了明析NNV的傳播途徑和研發(fā)出相應(yīng)的預(yù)防技術(shù)，目前國內(nèi)外研究學(xué)者已經(jīng)開發(fā)出了多種NNV檢測技術(shù)，如原位雜交、免疫組織化學(xué)方法、熒光抗體技術(shù)、細胞培養(yǎng)、ELISA、逆轉(zhuǎn)錄酶鏈式聚合反應(yīng)（RT-PCR）和實時定量PCR等方法[3-7]。目前在生產(chǎn)實際中較為有效的檢測手段均建立在神經(jīng)壞死病毒外殼蛋白基因核苷酸序列的PCR擴增基礎(chǔ)之上，但仍然存在操作繁瑣、周期長、需要專用儀器設(shè)備等缺點，無法滿足實際生產(chǎn)中快速、敏感、準確的檢測需求。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型核酸片段擴增技術(shù)，該技術(shù)由日本學(xué)者Notomi等于2000 年首先開發(fā)，其核心由4條引物（2條外引物和2條內(nèi)引物）和一種鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）組成，原理是通過使鏈置換DNA的合成不停地自我循環(huán)以到達快速高效擴增的目的[8]。LAMP技術(shù)在恒溫（60～65 ℃）條件下進行核酸擴增，可以通過肉眼可見的白色焦磷酸鎂沉淀或加入染料觀察顏色變化[9]判定結(jié)果。Nagamine K等[10]于2002年通過在4條引物的基礎(chǔ)上添加了2條環(huán)引物L(fēng)F/LB，能夠明顯加快反應(yīng)速度，提高擴增效率。由于LAMP技術(shù)具有反應(yīng)快速、操作簡便、成本低、結(jié)果易判定等優(yōu)點，目前已經(jīng)被成功用于檢測魚類的諸多致病病毒，如彈狀病毒、虹彩病毒、病毒性出血敗血癥病毒和呼腸孤病毒等[11-15]。

本研究在克隆出七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒（SGNNV）核酸序列的基礎(chǔ)上，建立了基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)的七帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒LAMP檢測方法，以期為今后在七帶石斑魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中進行現(xiàn)場、即時的高效病毒檢測提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 生物材料 2012年于萊州明波水產(chǎn)有限公司采集的8份表現(xiàn)病毒性神經(jīng)壞死癥狀的七帶石斑魚苗種和2份健康苗種；所有發(fā)病苗種均通過陳信忠等發(fā)表的RT-PCR方法檢測確定后于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 病毒RNA 取發(fā)病七帶石斑魚的腎、脾、腦等組織混合勻漿，提取病毒RNA參照TRIzol Reagent（Invitrogen）使用方法，從100 mg組織中提取總RNA，-70 ℃保存?zhèn)溆茫皇唪~虹彩病毒（SIGV）序列為筆者根據(jù)Genbank中收錄的石斑魚虹彩病毒（ID：AY621625）進行體外合成后于本實驗室保存。

1.1.3 試劑與儀器 Bst DNA Polymerase和10×Thermo Pol buffer 購自紐英倫生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司；Premix Taq、DL2000 DNA marker、dNTPs（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自臺灣生工；SYBR Green Ⅰ購自廈門百維信公司；甜菜堿（分析純）購自美國Sigma公司；瓊脂糖購自臺灣生工；BIO-RAD MyCycler梯度PCR儀，恒溫金屬浴及冷凍離心機等儀器均為國產(chǎn)。

1.2 方 法

1.2. 七帶石斑魚NNV病毒序列鑒定 根據(jù)Genbank已報道的赤點石斑魚神經(jīng)性壞死病毒MCP基因序列，進行序列比對后選取最為保守的中間部分設(shè)計引物NNV-F和NNV-R，引物序列見表1。以提取的2 μL總RNA為模板、NNV-R為引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以2 μLcDNA為模板、NNV-F和NNV-R為引物，使用Premix Taq進行常規(guī)PCR擴增，反應(yīng)體系終體系25 μL。PCR程序為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，46 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束后對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測。其余PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒回收后送博尚生物技術(shù)有限公司進行直接測序，測序結(jié)果經(jīng)Blast程序與Genbank中收錄的石斑魚神經(jīng)壞死病毒MCP基因序列進行比對確認。

1.2.2 LAMP引物設(shè)計 采用Primer Explorer V4軟件（http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）針對七帶石斑魚神經(jīng)性壞死病毒MCP基因序列設(shè)計6條引物，依次為正向內(nèi)引物（FIP）、反向內(nèi)引物（BIP）、正向外引物（F3）、反向外引物（B3）、正向環(huán)引物（LF）及反向環(huán)引物（LB），由博尚生物技術(shù)有限公司合成引物，引物序列見表1。

1.2.3 反應(yīng)體系建立及優(yōu)化 建立的RT-LAMP反應(yīng)體系由2.5 μL10×ThermoPol buffer，1.6 μmol·L-1 FIP、BIP，0.2 μmol·L-1 F3、B3，0.8 μmol·L-1 L F、LB，2 mol·L-1 Betaine、4 μL10 mmol·L-1 dNTP，6 mmol·L-1 MgSO4，0.5 μL 200 U Reverse Transcriptase MMLV（TaKaRa），1 μL 8U Bst DNA聚合酶（New England Biolabs），0.5 μL 40 U Ribonuclease inhibitor（TaKaRa）和2 μL模板組成。為優(yōu)化反應(yīng)溫度，將經(jīng)過簡短離心混勻后的反應(yīng)混合物分別在59，60，61，62，63，64，65，66 ℃反應(yīng)1 h后，再經(jīng)過82 ℃10 min終止反應(yīng)。為測定環(huán)引物對反應(yīng)時間的影響，分別采用4條引物（FIP，BIP，F(xiàn)3，B3）和6條引物（FIP，BIP，F(xiàn)3，B3，LF 和LB）的反應(yīng)體系，選擇63 ℃的反應(yīng)溫度，分別反應(yīng)25，35，45，55，60，65，75，85，95 min，再經(jīng)過82 ℃10 min終止反應(yīng)。隨后對不同反應(yīng)溫度和不同反應(yīng)時間下的擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳法及熒光染料法檢測。在凝膠電泳檢測中，如果出現(xiàn)典型的梯形條帶即表明發(fā)生了擴增反應(yīng)；在SYBR GREENⅠ熒光染料法檢測中如果反應(yīng)體系顏色變綠，則說明發(fā)生擴增反應(yīng)；如果反應(yīng)體系顏色依舊為橙色，則說明未發(fā)生擴增反應(yīng)。

1.2.4 特異性分析 分別取神經(jīng)壞死病毒和虹彩病毒的核酸樣本為模板進行LAMP方法檢測，并以水作為模板設(shè)置空白對照。分別采用瓊脂糖凝膠電泳法及SYBR GreenⅠ法熒光染料法檢測反應(yīng)結(jié)果，分析方法的特異性。

1.2.5 現(xiàn)場檢測結(jié)果 在養(yǎng)殖現(xiàn)場對10尾待檢的石斑魚，開展了NNV病毒的LAMP方法檢測，在檢測過程中，分別以NNV RNA和水為模板作為陽性對照和空白對照。同時采用PCR方法與LAMP的檢測結(jié)果進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP反應(yīng)體系的建立

2.1.1 反應(yīng)溫度的優(yōu)化LAMP 反應(yīng)在59，60，61，62，63，64，65，66 ℃均有擴增，并且擴增產(chǎn)物亮度比較接近，說明該反應(yīng)體系中的引物設(shè)計比較理想，反應(yīng)條件具有比較好的寬容性，能夠保證反應(yīng)體系充分有效擴增。在所有的溫度梯度中63 ℃下的產(chǎn)量相對更高，因此，可確定最優(yōu)的LAMP反應(yīng)溫度為63 ℃，電泳結(jié)果及SYBR GreenⅠ檢測結(jié)果見圖1。

2.1.2 反應(yīng)時間的優(yōu)化 當反應(yīng)體系中加入環(huán)引物時，LAMP反應(yīng)45 min就可觀察到明顯的擴增，而在無環(huán)引物時，在反應(yīng)時間到95 min時仍無明顯的擴增產(chǎn)物出現(xiàn)（圖2）。表明在反應(yīng)體系中加入環(huán)引物能夠顯著地縮短反應(yīng)時間。為了保證低濃度的樣本能夠充分反應(yīng)并得到準確地檢測，采用了60 min作為本LAMP方法的反應(yīng)時間。