那學(xué)武　李　揚(yáng)　王振冉　聶容榮　李　鉑　胡志高　劉曉萌　唐　博

(錦州市中心醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，遼寧　錦州　121000)

1桂林醫(yī)學(xué)院

Embelin通過PI3K/Akt信號途徑抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖

那學(xué)武李揚(yáng)1王振冉1聶容榮1李鉑1胡志高1劉曉萌1唐博1

(錦州市中心醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，遼寧錦州121000)

〔摘要〕目的探討Embelin對甲狀腺癌細(xì)胞增殖的影響并探討相關(guān)機(jī)制。方法體外培養(yǎng)甲狀腺癌細(xì)胞，經(jīng)Embelin處理后，RT-PCR和Western印跡檢測XIAP mRNA和蛋白的表達(dá)水平；MTT法測定細(xì)胞生長抑制率；流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期；免疫印跡檢測PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平。結(jié)果Embelin處理甲狀腺癌細(xì)胞48 h后，XIAP mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低。在高劑量組中，MTT法檢測其細(xì)胞生長抑制率為42.78%±4.29%，明顯高于對照組(t=20.14，P<0.01)；流式細(xì)胞儀檢測高劑量組細(xì)胞凋亡率為37.94%±2.29%，明顯高于對照組(t=42.09，P<0.01)；流式細(xì)胞儀檢測高劑量組細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)其處于G1期細(xì)胞的百分比為68.23%±2.13%，明顯高于對照組(t高劑量組=5.70，P<0.01)；檢測PI3K、Akt蛋白在高劑量組中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)pAkt蛋白表達(dá)水平明顯低于對照組(t高劑量組=6.47，P<0.05)。結(jié)論Embelin下調(diào)XIAP表達(dá)可抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與PI3K/Akt信號途徑相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕甲狀腺癌；Embelin；XIAP；PI3K/Akt途徑；增殖

恩貝素(Embelin)是X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)小分子抑制劑〔1〕，可以抑制多種腫瘤細(xì)胞生長〔2～4〕。本文探討Embelin對甲狀腺癌細(xì)胞增殖的影響及相關(guān)分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要材料、細(xì)胞和分組Embelin購自Sigma公司；L-15培養(yǎng)基，胎牛血清購自Gibco公司；AnnexinV-FITC試劑盒購自BD公司；Caspase-3、8、9，PI3K，Akt，pAkt及XIAP抗體均購自Cell Signaling公司。人甲狀腺癌SW579細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。實(shí)驗(yàn)分為4組：對照組，未加入Embelin的SW579細(xì)胞；Embelin低劑量組，加入Embelin 50 μg/ml的SW579細(xì)胞；Embelin中劑量組，加入Embelin 100 μg/ml的SW579細(xì)胞；Embelin高劑量組，加入Embelin 200 μg/ml的SW579細(xì)胞。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)使用加入15% FBS的L-15培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞生長抑制率檢測離心收集細(xì)胞并調(diào)整密度為1×105/ml。接種于96孔培養(yǎng)板中。待生長至對數(shù)期加入不同濃度的Embelin進(jìn)行處理。各孔加入20 μl MTT溶液(0.5 mg/ml)37℃溫育4 h，然后加入150 μl DMSO，使結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞在490 nm處的吸光度A值。生長抑制率=(對照組A平均值-實(shí)驗(yàn)組A平均值)/對照組A平均值×100%。

1.4細(xì)胞凋亡檢測胰蛋白酶消化并收集實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞，按照試劑盒(Annexin V-FITC Kit,BD公司，美國)說明分別加入5 μl的Annexin V-FITC和5 ml的PI，4℃避光染色15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.5細(xì)胞周期檢測胰蛋白酶消化并收集實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞，70%冷乙醇固定過夜。棄去乙醇，加入DNAStain綜合染液(RNase終濃度50 mg/L，PI終濃度100 mg/L，TritonX-100終濃度1 ml/L)1 ml，室溫避光15 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.6RNA提取和RT-PCR分析提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的總RNA，定量后用RT-PCR試劑盒(Takara，寶生物，大連)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。具體方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。XIAP上游引物：5′-CCCTCCCAAGAGTTCTCAGTGTC-3′，下游引物：5′-CCAAATGTAGCAGGAAAGGCAAT-3′。β-actin上游引物：5′-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3′，下游引物：5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′。所得PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.7免疫印跡分析常規(guī)收集并裂解各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞。測定蛋白濃度，電泳，轉(zhuǎn)膜，加入一抗，二抗，化學(xué)發(fā)光試劑，進(jìn)行灰度分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1Embelin對XIAP表達(dá)水平的影響不同劑量的Embelin處理甲狀腺癌細(xì)胞48 h，RT-PCR和免疫印跡分析XIAP mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，經(jīng)不同劑量的Embelin處理48 h后，XIAP mRNA和蛋白的表達(dá)水平均下調(diào)，特別是在200 μg/ml最為明顯(t高劑量組=6.32，P<0.01)(圖1)。說明Embelin可有效下調(diào)XIAP基因和蛋白的表達(dá)水平。

圖1　Embelin處理后XIAP mRNA和蛋白的表達(dá)水平

2.2MTT法檢測細(xì)胞生長抑制率Embelin低劑量，中劑量和高劑量組的細(xì)胞生長抑制率分別為8.78%±1.38%，23.84%±2.22%，42.78%±4.29%。其中以Embelin高劑量組最為明顯(t高劑量組=20.14，P<0.01)，說明Embelin對甲狀腺癌細(xì)胞的生長具有抑制作用，并且具有劑量依賴性。

2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡Embelin高劑量組的細(xì)胞凋亡率均明顯高于對照組(t高劑量組=42.09，P<0.01)。說明Embelin可誘導(dǎo)人甲狀腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡(表1)。

表1　各組細(xì)胞凋亡率和周期的比值±s,%,n=5)

與對照組比較：1)P<0.01

2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期在對照組，Embelin低劑量組，中劑量組和高劑量組中G1期的比例逐漸增高，相反，S+G2+M期比例逐漸降低。Embelin高劑量組的G1期百分比明顯高于對照組(t高劑量組=5.70，P<0.01)。說明Embelin可使人甲狀腺癌細(xì)胞周期阻滯于G1期(表1)。

2.5Caspase-3、8和9蛋白表達(dá)水平檢測與對照組比較，Embelin高劑量組Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)水平明顯升高(Caspase-3：t高劑量組=5.63，P<0.01；Caspase-9：t高劑量組=0.99，P<0.01)，而Caspase-8蛋白表達(dá)水平未見明顯變化(t高劑量組=0.54，P>0.05)(圖2)。說明Embelin誘導(dǎo)人甲狀腺癌細(xì)胞凋亡可能與線粒體途徑相關(guān)。

圖2　免疫印跡檢測Caspase-3、8和9蛋白表達(dá)水平

2.6PI3K和Akt蛋白表達(dá)水平檢測采用高劑量Embelin和PI3K抑制劑LY294002治療后，免疫印跡分析PI3K、Akt及pAkt蛋白表達(dá)水平變化。與對照組比較，Embelin高劑量組pAkt蛋白表達(dá)水平明顯降低(t高劑量組=6.47，P<0.05)，而PI3K及Akt蛋白的表達(dá)水平未見明顯變化(PI3K：t高劑量組=0.58，P>0.05；Akt：t高劑量組=0.62，P>0.05)；同時(shí)，與對照組比較，LY294002組PI3K、Akt及pAkt蛋白表達(dá)水平均明顯降低(PI3K：tLY294002組=23.48，P<0.01；Akt：tLY294002組=4.69，P<0.05；pAkt：tLY294002組=0.98，P<0.05)(圖3)。說明Embelin抑制人甲狀腺癌細(xì)胞增殖可能與PI3K/Akt信號途徑有關(guān)。

圖3　免疫印跡檢測PI3K、Akt及pAkt蛋白表達(dá)水平

3討論

抗腫瘤藥物一般都是通過誘導(dǎo)敏感腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡或是阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程而實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤作用的。Embelin是XIAP的小分子抑制劑，可特異性抑制XIAP，從而影響多種腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡，特別是對胰腺癌、肝癌及乳腺癌等實(shí)體腫瘤細(xì)胞作用更為顯著〔4～6〕。本研究結(jié)果與上述結(jié)論相吻合，發(fā)現(xiàn)Embelin能誘導(dǎo)人甲狀腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡并且具有劑量依賴性，說明Embelin可通過誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡而抑制其增殖。觸發(fā)細(xì)胞凋亡主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括內(nèi)源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑〔7〕。眾所周知，Caspase家族在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)能夠激活凋亡相關(guān)蛋白酶，因此，Caspase家族的活化是細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要先決條件〔8〕。本實(shí)驗(yàn)中，給予Embelin處理后發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌細(xì)胞Caspase-3、9蛋白表達(dá)水平明顯升高；然而，Caspase-8蛋白表達(dá)水平無明顯變化。細(xì)胞色素C從線粒體釋放可激活Caspase-9、3的效應(yīng)，這是一個(gè)凋亡通路中的重要一步〔9〕。這些結(jié)果說明，Embelin誘導(dǎo)人甲狀腺癌細(xì)胞凋亡可能是通過內(nèi)源性線粒體途徑實(shí)現(xiàn)的。

PI3K/Akt是經(jīng)典的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑。研究證實(shí)Akt途徑是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要啟動(dòng)因子之一〔10〕。Fang等〔11〕研究表明，人工合成抗腫瘤藥mz3(考布他丁)可通過下調(diào)Akt的表達(dá)，從而進(jìn)一步下調(diào)Cdc2、Cdc25及CyclinB1蛋白表達(dá)水平，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞阻滯于G2/M期。Asselin等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，通過下調(diào)大鼠粒層棘細(xì)胞XIAP蛋白表達(dá)可下調(diào)磷酸化Akt表達(dá)，但Akt蛋白表達(dá)不受影響。Hussain等〔13〕研究表明，使用Embelin可以同時(shí)下調(diào)大B淋巴細(xì)胞XIAP及Akt蛋白的表達(dá)水平。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Embelin能明顯抑制甲狀腺癌細(xì)胞周期進(jìn)程，將細(xì)胞周期阻滯于G1期以內(nèi)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，治療劑量的Embelin能增加Akt蛋白的磷酸化水平，但Akt總蛋白表達(dá)并未發(fā)生明顯變化。這與上述研究結(jié)果有相似之處，說明Embelin抑制人甲狀腺癌細(xì)胞增殖與Akt蛋白磷酸化密切相關(guān)。

總之，本研究證明，Embelin通過調(diào)節(jié)XIAP作用于PI3K/Akt信號途徑從而抑制人甲狀腺癌細(xì)胞增殖，這將為臨床上甲狀腺癌的治療提供新的藥物靶點(diǎn)。

4參考文獻(xiàn)

1Siegel C,Li J,Liu F,etal.miR-23a regulation of X-linked inhibitor of apoptosis(XIAP)contributes to sex differences in the response to cerebral ischemia〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2011;108(28):11662-7.

2Wang A,Zhang B,Zhang J,etal.Embelin-induced brain glioma cell apoptosis and cell cycle arrest via the mitochondrial pathway〔J〕.Oncol Rep,2013;29(6):2473-8.

3Heo JY,Kim HJ,Kim SM,etal.Embelin suppresses STAT3 signaling,proliferation,and survival of multiple myeloma via the protein tyrosine phosphatase PTEN〔J〕.Cancer Lett,2011;308(1):71-80.

4Huang M,Tang SN,Upadhyay G,etal.Embelin suppresses growth of human pancreatic cancer xenografts,and pancreatic cancer cells isolated from krasG12D mice by inhibiting Akt and sonic hedgehog pathways〔J〕.PLoS One,2014;9(4):e92161.

5Taghiyev A,Sun D,Gao ZM,etal.Embelin-induced apoptosis of HepG2 human hepatocellular carcinoma cells and blockade of HepG2 cells in the G2/M phase via the mitochondrial pathway〔J〕.Exp Ther Med,2012;4(4):649-54.

6Allensworth JL,Aird KM,Aldrich AJ,etal.XIAP inhibition and generation of reactive oxygen species enhances TRAIL sensitivity in inflammatory breast cancer cells〔J〕.Mol Cancer Ther,2012;11(7):1518-27.

7Yang CL,Ma YG,Xue YX,etal.Curcumin induces small cell lung cancer NCI-H446 cell apoptosis via the reactive oxygen species-mediated mitochondrial pathway and not the cell death receptor pathway〔J〕.DNA Cell Biol,2012;31(2):139-50.

8Nicholson DW,Ali A,Thornberry NA,etal.Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis〔J〕.Nature,1995;376(6535):37-43.

9Riedl SJ,Shi Y.Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol,2004;5(11):897-907.

10Ching CB,Hansel DE.Expanding therapeutic targets in bladder cancer:the PI3K/Akt/mTOR pathway〔J〕.Lab Invest,2010;90(10):1406-14.

11Fang L,Shen L,Fang Y,etal.MZ3 can induce G2/M-phase arrest and apoptosis in human leukemia cells〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol,2008;134(12):1337-45.

12Asselin E,Wang Y,Tsang BK.X-linked inhibitor of apoptosis protein activates the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in rat granulosa cells during follicular development〔J〕.Endocrinology,2001;142(6):2451-7.

13Hussain AR,Uddin S,Ahmed M,etal.Prognostic significance of XIAP expression in DLBCL and effect of its inhibition on AKT signalling〔J〕.J Pathol,2010;222(2):180-90.

〔2014-10-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

基金項(xiàng)目：廣西衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(GZPT13-45)

通訊作者：唐博(1979-)，男，副主任醫(yī)師，副教授，博士，主要從事普外科惡性腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。

〔中圖分類號〕R73

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2340-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.012

第一作者：那學(xué)武(1966-)，男，主任醫(yī)師，主要從事頭頸外科惡性腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究。