周立新，蘇繼欽，王茂林，嚴(yán)輝弟，林培藝

廈門市第二醫(yī)院肝膽外科，福建廈門361021

肝素結(jié)合表皮生長因子對肝移植模型大鼠肝臟炎癥因子及細(xì)胞再生的影響

周立新，蘇繼欽，王茂林，嚴(yán)輝弟，林培藝

廈門市第二醫(yī)院肝膽外科，福建廈門361021

目的 研究肝素結(jié)合表皮生長因子（heparin?binding epidermal growth factor?like growth factor，HB?EGF）對肝移植模型大鼠肝臟炎癥因子及細(xì)胞再生的影響。方法 選擇60只SD雄性大鼠并建立肝移植動(dòng)物模型，隨機(jī)分為A、B、C三組，B組皮下注入0.1 mg／kg肝細(xì)胞生長因子，C組皮下注射0.1 mg／kg HB?EGF，A組給予相等劑量生理鹽水進(jìn)行干預(yù)。干預(yù)后第1、3、5、7天時(shí)，比較三組肝臟濕重、肝功能、炎性因子含量。結(jié)果 干預(yù)后第1、3、5、7天時(shí)，B組、C組大鼠移植肝臟的濕重均明顯高于A組（P＜0.05），血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）含量均明顯低于A組（P＜0.05）；干預(yù)后第3、5、7天時(shí)，B組、C組血清白蛋白（ALB）含量明顯高于A組（P＜0.05）；干預(yù)后第1、3、5、7天時(shí)，B組、C組大鼠肝臟組織中腫瘤壞死因子?α（TNF?α）、白細(xì)胞介素?6（IL?6）含量均明顯低于A組（P＜0.05）；C組大鼠肝臟組織中TNF?α、IL?6含量明顯低于B組（P＜0.05）。結(jié)論 HB?EGF能促進(jìn)肝移植模型大鼠肝細(xì)胞再生，其作用機(jī)制可能與保護(hù)肝功能、減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。

肝移植；肝細(xì)胞生長因子；肝素結(jié)合表皮生長因子；細(xì)胞再生；炎癥因子

活體肝移植是目前臨床上治療終末期肝臟疾病的主要方式，但受到移植后免疫排異反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、缺血再灌注損傷等因素的影響，移植后肝臟的存活率并不理想，肝臟損傷的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也較高［1］。近年來關(guān)于肝移植的研究中，供體肝臟與受體間比例不匹配是造成肝移植術(shù)后肝功能損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，供體肝臟的體積越小、移植后的損傷程度越重［2］。因此，移植后早期需要促進(jìn)肝臟迅速再生以降低供體肝臟與受體間不匹配的程度［3］。肝素結(jié)合表皮生長因子（heparin binding epidermal growth factor?like growth factor，HB?EGF）是EGF家族的重要成員，對成熟肝細(xì)胞的分裂及增殖具有促進(jìn)作用。本研究中，我們分析了HB?

EGF對肝移植模型大鼠肝臟炎癥因子及細(xì)胞再生的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）：肝樂寧注射液，長春普華制藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20054108；規(guī)格2 ml。HB?EGF：美國Barnstead公司；全自動(dòng)生化分析儀：日本O?lympus Au型；多功能酶標(biāo)儀：美國Bio?rad公司El312e Microplate；低溫高速離心機(jī)：美國貝克曼庫爾特有限公司Allegra 64R型；及配套試劑購買于Roche公司，Ki?67、TNF?α、IL?6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購買于Ebio?science公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：供體動(dòng)物和受體動(dòng)物均為雄性清潔級SPF大鼠，體質(zhì)量200～250 g，共60只，隨機(jī)分為A組（生理鹽水組）、B組（HGF組）、C組（HB?EGF組）各20只。三組大鼠均建立肝移植動(dòng)物模型，B組給予0.1 mg／kg皮下注入肝細(xì)胞生長因子（1次／d），C組皮下注射0.1 mg／kg HB?EGF（1次／d），A組給予相等劑量生理鹽水進(jìn)行干預(yù)。

1.2.2 保留肝臟30%動(dòng)物模型建立：三組大鼠均按照改良的二袖套法建立原位部分肝移植模型，在供體大鼠上切取供體肝臟，切除肝左葉、右葉、兩片尾葉及肝中葉鐮狀韌帶左側(cè)的部分，保留肝臟占全肝重量的約30%；切除受體大鼠的肝臟，并將供體肝臟移植進(jìn)入受體大鼠體內(nèi)，縫合血管。

1.2.3 肝臟濕重：干預(yù)后第1、3、5、7天時(shí)，每組大鼠各取5只處死，稱重后用生理鹽水清洗肝臟，經(jīng)液氮冷凍后放置在－80℃冰箱保存。

1.2.4 肝功能：干預(yù)后第1、3、5、7天時(shí)，每組大鼠各取5只處死，自肝下腔靜脈取血5 ml，3 000 r／min離心10 min（離心半徑r＝3 cm），采用全自動(dòng)生化分析儀測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、白蛋白（albumin，ALB）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）含量。

1.2.5 炎性因子：干預(yù)后第1、3、5、7天時(shí)，每組大鼠各取5只處死，取出肝臟組織，稱量適量組織并加入PBS研磨，將研磨液放置在4℃離心機(jī)中離心，棄去殘?jiān)?、保留上清并采用酶?lián)免疫吸附試劑盒測定腫瘤壞死因子?α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）、白細(xì)胞介素?6（interleukin?6，IL?6）的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用x ±s表示，不同時(shí)間、多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用配對t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝臟濕重 干預(yù)后第1、3、5、7天時(shí)，B組、C組大鼠移植肝臟的濕重均顯著高于A組（P＜0.05），B、C兩組間移植肝臟的濕重比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表1）。

表1 三組大鼠移植肝臟濕重的比較（x ±s，g）Tab 1 Comparison of wet weight of liver transplantation in rats among three groups（x ±s，g）

2.2 肝功能 干預(yù)后第1、3、5、7天時(shí)，B組與C組大鼠的血清ALT、TBIL含量均明顯低于A組（P＜0.05），移植后3 d、5 d、7 d時(shí)，B組、C組血清ALB含量明顯高于A組（P＜0.05）；B、C兩組不同時(shí)點(diǎn)ALT、ALB、TBIL含量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表2）。

表2 三組大鼠不同時(shí)點(diǎn)ALT、ALB、TBIL含量比較（x±s）Tab 2 Comparison of ALT，ALB and TBIL in rats among three groups in different time（x±s）

2.3 肝臟組織中炎癥因子含量 干預(yù)后第1、3、5、7天時(shí)，B組、C組大鼠肝臟組織中TNF?α、IL?6含量均明顯低于A組（P＜0.05），C組大鼠肝臟組織中TNF?α、IL?6含量明顯低于B組（P＜0.05，見表3）。

表3 三組大鼠不同時(shí)點(diǎn)肝臟組織中TNF?α、IL?6含量比較（x ±s，ng／ml）Tab 3 Comparison of TNF?α and IL?6 in rats among three groups in different time（x ±s，ng／ml）

3 討論

供體肝臟與受體比例不匹配是造成肝移植后肝功能損傷、移植物不存活的重要原因。有研究［4］證實(shí)，肝移植物損傷的程度與自身體積及重量具有負(fù)相關(guān)關(guān)系，即移植肝臟的重量越大、移植后損傷程度越輕。此外，肝臟移植后受到免疫排異反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、缺血再灌注損傷等因素的影響會(huì)出現(xiàn)再生能力受損，細(xì)胞再生不足也會(huì)造成移植物功能損傷。因此，促進(jìn)肝移植后肝臟的快速再生能夠減輕肝功能損傷［5］。肝細(xì)胞生長因子HGF在肝再生過程中發(fā)揮著重要的作用，肝切除后輸入外源性HGF，可加速肝修復(fù)［6］。HB?EGF是EGF家族中的新成員，對成熟肝細(xì)胞的分裂過程具有促進(jìn)作用，在肝細(xì)胞的再生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［7］。本研究中，干預(yù)后第1、3、5、7天時(shí)，B、C兩組大鼠移植肝臟的濕重顯著高于A組，說明HGF、HB?EGF能夠促進(jìn)移植肝臟組織的生長、增加移植肝臟組織的重量。

肝臟移植后，肝細(xì)胞的再生能夠保護(hù)移植物、減輕組織損傷［8］。ALT是位于肝細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶，肝細(xì)胞的損傷和破裂會(huì)造成ALT大量釋放進(jìn)入血液循環(huán)；ALB水平反映肝臟合成功能，當(dāng)肝臟病變達(dá)到一定程度時(shí)，ALB會(huì)呈一定程度的下降；TBIL大部分來自衰老紅細(xì)胞裂解釋放的血紅蛋白，其水平異常升高多提示肝功能受損［9?10］。本研究中，B、C兩組血清ALT、TBIL含量均明顯低于A組，ALB含量明顯高于A組，國內(nèi)學(xué)者高銀杰等［11］也有類似的文獻(xiàn)報(bào)道，提示外源性細(xì)胞生長因子、HB?EGF均能減輕移植組織肝細(xì)胞的損傷。

肝移植后造成供體肝臟損傷、影響細(xì)胞再生的主要途徑包括缺血再灌注損傷、免疫排斥反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等［12］，而局部組織中炎癥因子的大量合成和釋放是多種途徑的共同作用方式，TNF?α、IL?6是兩類重要的炎癥因子［13］。TNF?α來自激活的單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，通過與靶細(xì)胞表面的受體結(jié)合來促進(jìn)炎癥反應(yīng)的級聯(lián)放大［14］；IL?6由單核巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞分泌，具有多種生物學(xué)功能，是急性反應(yīng)過程中最敏感的介質(zhì)。本研究中，C組大鼠肝臟組織中TNF?α、IL?6含量均明顯高于A組、B組，說明HB?EGF能夠抑制移植肝臟中炎癥因子的生成，有助于減輕局部組織中的炎癥反應(yīng)。

本研究結(jié)果表明，HB?EGF能夠促進(jìn)肝移植模型大鼠肝臟組織再生，其作用機(jī)制可能與保護(hù)肝功能、減輕炎癥反應(yīng)等有關(guān)。需要指出的是，本文觀察指標(biāo)相對較少，未對肝再生率進(jìn)行比較研究，且缺乏對可能作用機(jī)制的深入分析，有待于今后展開更多的基礎(chǔ)研究與臨床研究去證實(shí)。

［1］Tanaka S，Iimuro Y，Hirano T，et al.Prediction of postoperative he?patic failure after liver resection for hepatocellular carcinoma：signifi?cance of the aspartate aminotransferase?to?platelet ratio index［J］.Hepatogastroenterology，2014，61（131）：755?761.

［2］Kobayashi K，Hattori N，Manabe O，et al.Postoperative assessment of hepatic asialoglycoprotein receptor function with Tc?99m GSA：the safety margin of resection size in living donor liver transplantation［J］.Ann Transplant，2015，20：51?58.

［3］劉劍絨，楊揚(yáng)，張英才，等.HGF與CTLA?4Ig雙基因修飾增強(qiáng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制和促增殖作用［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2012，33（6）：709?715，722.Liu JR，Yang Y，Zhang YC，et al.Enhanced immunomodulatory and pro?proliferation properties of human umbilical cord mesenchymal stem cells modified by HGF?gene and CTLA?4Ig?gene［J］.Journal of Sun Yat?sen University（Medical Sciences），2012，33（6）：709?715，722.［4］Fang H，Liu A，Dirsch O，et al.Liver transplantation and inflamma?tion：is lipopolysaccharide binding protein the link？［J］.Cytokine，2013，64（1）：71?78.

［5］Hernandez?Alejandro R，Zhang X，Croome KP，et al.Reduction of liver ischemia reperfusion injury by silencing of TNF?α gene with shRNA［J］.J Surg Res，2012，176（2）：614?620.

［6］應(yīng)佳麗，王雪玲，范麗嬌，等.aFGF、HGF體外誘導(dǎo)小鼠ESC向肝細(xì)胞定向分化及標(biāo)志物研究［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2014，23（11）：1305?130.Ying JL，Wang XL，F(xiàn)an LJ，et al.Study of hepatic differentiation in vitro from mouse ESC induced with aFGF and HGF and the expression of hepatic biomakers［J］.Chin J Gastroenterol Hepatol，2014，23（11）：1305?130.

［7］楊焱，李相成，王學(xué)浩.肝素結(jié)合的類表皮生長因子促進(jìn)大鼠減體積肝移植術(shù)后移植肝細(xì)胞的再生［J］.中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2008，15（3）：155?158.Yang Y，Li XC，Wang XH.Promoting Regeneration effect of heparin binding epidermal growth factor?like growth factor on rat hepatocytes af?ter partial orthotopic liver transplantation［J］.Chin J Bases Clin General Surg，2008，15（3）：155?158.

［8］史艷敏，曲紅巖，魏潔.腸內(nèi)外營養(yǎng)支持對肝衰竭病人肝移植術(shù)后營養(yǎng)狀況、肝功能及炎性反應(yīng)的影響［J］.中國老年學(xué)雜志，2016，36（2）：375?377.Shi YM，Qu HY，Wei J.Effect of enteral and parenteral nutrition sup?port on nutritional status，liver function and inflammatory response after liver transplantation in patients with liver failure［J］.Chinese Journal of Gerontology，2016，36（2）：375?377.

［8］羅桂金，雷平光.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞輔助治療對乙肝肝硬化患者肝功能、纖維化指標(biāo)及炎癥程度的影響［J］.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，22（11）：1069?1072.Luo GJ，Lei PG.Effect of human umbilical cord mesenchymal stem cell adjuvant therapy on liver function and fibrosis indicators as well as the degree of inflammation in patients with hepatitis B cirrhosis［J］.Journal of Hainan Medical University，2016，22（11）：1069?1072.

［9］Vondran FW，Schumacher C，Johanning K，et al.Application of the liver maximum function capacity test in acute liver failure：a helpful tool for decision?making in liver transplantation？［J］.Case Rep Trans?plant，2016，2016：7074636.

［10］Zhou B，F(xiàn)an Y，Rao J，et al.Matrix metalloproteinases?9 deficiency impairs liver regeneration through epidermal growth factor receptor sig?naling in partial hepatectomy mice［J］.J Surg Res，2015，197（1）：201?209.

［11］高銀杰，張敏，蘇海濱，等.肝移植后乙肝復(fù)發(fā)患者肝內(nèi)CD3＋、CD4＋、CD8＋、CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的表達(dá)和研究［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2012，21（10）：923?926.Gao YJ，Zhang M，Su HB，et al.Expression and research of intrahe?patic CD3＋，CD4＋，CD8＋，CD4＋CD25＋regulatory T cell（Treg）in patients with HBV recurrence after liver transplantation［J］.Chin J Gastroenterol Hepatol，2012，21（10）：923?926.

［12］賈莉莉，喻文立，翁亦齊，等.肝移植患者新肝期血清炎癥因子的變化及其對心肌損傷的機(jī)制研究［J］.實(shí)用器官移植電子雜志，2015，3（6）：354?356.Jia LL，Yu WL，Weng YQ，et al.The study of the changes of the in?flammatory mediators and myocardial injury during the neohepatic stage in patients undergoing liver transplantation［J］.Pract J Organ Transplant（Electronic Version），2015，3（6）：354?356.

［13］趙德芳，陳立坤.單純冷藏與低溫機(jī)械灌注保存肝移植前后炎癥因子和凋亡因子的變化［J］.中國組織工程研究，2015，19（33）：5322?5326.Zhao DF，Chen LK.Static cold storage versus hypothermic machine perfusion：changes in inflammatory cytokines and apoptotic factors in isolated liver before and after liver transplantation［J］.Chinese Journal of Tissue Engineering Research，2015，19（33）：5322?5326.

［14］羅剛健，池信錦，張璦蘭，等.大鼠自體原位肝移植肺組織TNF?α、IL?1β和IL?6的表達(dá)［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2012，33（4）：444?448.Luo GJ，Chi XJ，Zhang AL，et al.TNF?α，IL?1β and IL?6 genes transplantation and expression level of lung tissue in rats experienced orthotopic autologus liver transplantation［J］.Journal of Sun Yat?sen University（Medical Sciences），2012，33（7）：444?448.

（責(zé)任編輯：王全楚）

Effect of heparin binding epidermal growth factor?like growth factor on hepatic in?flammatory cytokines and cell regeneration in rat liver transplantation model

ZHOU Lixin，SU Jiqin，WANG Maolin，YAN Huidi，LIN Peiyi
Department of Hepatobiliary Surgery，the Second Hospital of Xiamen，Xiamen 361021，China

Objective To study the effect of heparin binding epidermal growth factor?like growth factor（HB?EGF）on hepatic inflammatory cytokines and cell regeneration in rat liver transplantation model.Methods Sixty male SD rats were established animal model of liver transplantation，and randomly divided into group A，group B，group C.Group B subcutaneous injection 0.1 mg／kg hepatocyte growth factor，group C subcutaneous injection 0.1 mg／kg HB?EGF，group A was given equal dose of normal saline to intervene.On the 1st，3rd，5th，7th day after intervention，liver wet weight，liver function，liver inflammatory cytokines levels were compared among three groups.Results On the 1st，3rd，5th，7th day after intervention，rats liver wet weight in group B，group C were significantly higher than those in group A（P＜0.05）.Serum ALT，TBIL were significantly lower than those in group A（P＜0.05）；on the 3rd，5th，7th day after inter?vention，serum ALB in group B，group C was significantly higher than that in group A（P＜0.05）；on the 1st，3rd，5th，7th day after intervention，liver tissue TNF?α，IL?6 in group B，group C were signficantly lower than those in group A（P＜0.05）；liver tissue TNF?α，IL?6 in group C were signficantly lower than those in group B（P＜0.05）.Conclusion HB?EGF can promote liver transplantation model of rat liver cell regeneration，the mechanism may be related to the pro?tection of liver function，and the reduction inflammation reactions.

Liver transplantation；Hepatocyte growth factor；Heparin binding epidermal growth factor?like growth factor；Cell regeneration；Inflammatory factors

R575

A

1006－5709（2016）12－1463－04

2016?02?21

10.3969／j.issn.1006?5709.2016.12.047

廈門市科技計(jì)劃指導(dǎo)性項(xiàng)目（3502Z20139012）

周立新，博士，主任醫(yī)師，碩士導(dǎo)師，研究方向：肝膽外科臨床及基礎(chǔ)研究。E?mail：zhoulix318＠163.com