陳鴻恩，梁海琦，肖士賓，李富勇

(1.江西省贛州市立醫(yī)院　341000；2.寧波美康生物科技股份有限公司,浙江寧波 315104)

·臨床研究·

鏈球菌溶血素O的表達(dá)、純化及生物活性鑒定

陳鴻恩1，梁海琦1，肖士賓1，李富勇2

(1.江西省贛州市立醫(yī)院341000；2.寧波美康生物科技股份有限公司,浙江寧波 315104)

摘要:目的重組表達(dá)鏈球菌溶血素O(SLO)，純化后驗(yàn)證其生物學(xué)活性。方法合成目的基因，采用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增、酶切連接的方式構(gòu)建SLO-pET28a載體，經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化，采用鎳親和柱和分子篩純化SLO。分別檢測(cè)重組SLO和天然SLO對(duì)試劑盒校準(zhǔn)品的響應(yīng)情況和與臨床樣本匹配程度。結(jié)果成功構(gòu)建了SLO-pET28a-BL21(DE3)菌株，在OD600=0.8時(shí)，25 ℃，0.4 mmol IPTG誘導(dǎo)，大于90%目的蛋白會(huì)可溶性表達(dá)。純化后SLO純度大于95%。重組的SLO與提取的SLO對(duì)試劑盒校準(zhǔn)品的響應(yīng)相當(dāng)，與臨床樣本的匹配程度一致。結(jié)論重組SLO的生物學(xué)活性與提取相當(dāng)，為檢測(cè)血清中的抗鏈球菌溶血素O奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:重組鏈球菌溶血素O抗原性;溶血活性;表達(dá);純化;生物活性

大部分鏈球菌溶血素O(SLO)是由β-溶血型中的a 組鏈球菌(GAS)分泌的，是具有溶血活性的蛋白分子，相對(duì)分子質(zhì)量約為68×103，其溶血活性和抗原性對(duì)氧敏感[1]?？规溓蚓苎豋(ASO)是常用的診斷感染的標(biāo)志，測(cè)定的機(jī)制是SLO和ASO的抗原抗體反應(yīng)，可以采用ELISA或者膠乳比濁等技術(shù)手段放大反應(yīng)的信號(hào)，配以標(biāo)準(zhǔn)品可以定量檢測(cè)血清中的ASO[2-3]。SLO屬于細(xì)菌膜穿孔蛋白家族，由于這個(gè)家族絕大多數(shù)成員的膜受體都是膽固醇，所以命名為膽固醇依賴溶細(xì)胞毒素家族(CDCs)。CDCs中多數(shù)蛋白對(duì)氧非常敏感，其功能活性是依靠還原劑而存在。國內(nèi)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)教材解釋SLO對(duì)分子氧敏感，是因?yàn)樵谘趸瘯r(shí)SLO可形成鏈內(nèi)二硫鍵。但SLO肽鏈內(nèi)只有1個(gè)半胱氨酸殘基(Cys,C)，有的CDC甚至1個(gè)Cys也沒有，根本不可能形成鏈內(nèi)二硫鍵。同時(shí)說明SLO對(duì)氧敏感與二硫鍵無關(guān)。SLO的獲得一般有兩種途徑：(1)用含有1%葡萄糖的Todd-Howit肉湯培養(yǎng)GAS[4]。該方法培養(yǎng)提取的SLO雖然活性及抗原性好，但是產(chǎn)量低，提純方法較復(fù)雜，且有鏈球菌感染的風(fēng)險(xiǎn)，現(xiàn)較少使用。(2)通過重組表達(dá)。該蛋白為原核蛋白，故可以采用大腸桿菌表達(dá)，該技術(shù)成熟簡(jiǎn)便、產(chǎn)量高、加入標(biāo)簽后易純化[5]。本研究即利用pET系統(tǒng)表達(dá)重組SLO，通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，減少原核表達(dá)包涵體蛋白比例。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒與細(xì)胞TOP10、BL21(DE3)感受態(tài)和pET28a質(zhì)粒由寧波美康生物科技股份有限公司實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑抗SLO檢測(cè)試劑盒及其校準(zhǔn)品購于寧波美康生物技術(shù)股份有限公司；天然的SLO購于武漢華美生物有限公司；限制性內(nèi)切核酸酶NcoⅠ和XhoⅠ、T4 DNA連接酶、ExTaq DNA聚合酶購自大連寶生物工程有限公司；SLO基因及PCR引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒等購自上海拜力生物科技有限公司；Ni-Hp親和填料和Sephadex G-50凝膠購自GE公司；羊抗人IgG-HRP購于博奧森生物有限公司；其他試劑和藥品為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)SLO基因序列轉(zhuǎn)譯成大腸桿菌偏好的密碼序列，并對(duì)優(yōu)化后的基因序列設(shè)計(jì)引物。在引物上、下游分別引入Nco I、Xho I酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。引物序列(斜體序列為酶切位點(diǎn))：上游引物 5′-CAT GCC ATG GGC CTT GCT CCC AAA GAA ATG CC-3′；下游引物 5′-CGC CT CGA GCT TAT AAG TAA TCG-3′。

1.2.2表達(dá)載體SLO-pET28a的構(gòu)建首先以SLO-PUC57質(zhì)粒為模版擴(kuò)增目的片段。PCR擴(kuò)增體系為：滅菌雙蒸水136 μL，5×PCR緩沖液40 μL，dNTPs16 μL，SLO-PUC57(0.2 ng/μL)2 μL，上游引物(25 mmol)2 μL,下游引物(25 mmol)2 μL,ExTaq DNA聚合酶2 μL反應(yīng)條件如下:94 ℃預(yù)變性4 min后，94 ℃變性30 s，62 ℃退火60 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果。然后PCR擴(kuò)增所得SLO基因片段經(jīng)膠回收后，用NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，與經(jīng)過同樣雙酶切的pET-28a載體在T4 DNA連接酶的作用下16 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)，提取其質(zhì)粒雙酶切鑒定和測(cè)序。

1.2.3SLO表達(dá)及可溶性分析提取鑒定正確的SLO-pET28a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)型菌株BL21(DE3)感受態(tài)中，挑取單菌落接種至LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h活化菌種后，按1%的比例接種于新鮮的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.8左右時(shí)，加入終濃度0.4 mmol的IPTG，25 ℃誘導(dǎo)8 h，離心收集菌體。取1 g菌體，加入10 mL PBS，超聲破碎后，離心分離上清和沉淀。取誘導(dǎo)培養(yǎng)前的菌體和誘導(dǎo)后菌體、破碎后上清和沉淀進(jìn)行12%SDS-PAGE分析。

1.2.4SLO的純化采用Ni-Hp進(jìn)行純化，以20 mmol Tris-HCl，0.5 mol NaCl，50 mmol 咪唑?yàn)槠胶庖?，?jīng)過梯度洗脫測(cè)試，采用20 mmol Tris-HCl，0.5 mol NaCl，300 mmol咪唑一步洗脫，根據(jù)280 nm處的紫外吸收值收集穿出和洗脫。之后將20 mmol Tris-HCl，0.5 mol NaCl，300 mmol洗脫液上樣至20 mmol Tris-HCl，0.5 mol NaCl平衡的Sephadex G-50脫掉咪唑。

1.2.5SLO的生物學(xué)鑒定(1)Western Blot驗(yàn)證SLO與血清中ASO的相互作用將純化后的SLO和商業(yè)SLO各5 μg一同做12%SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉1.5 h，ASO試劑盒檢測(cè)值為185 U/mL用5%的脫脂奶粉稀釋1 000倍，室溫孵育1 h后，換成1∶2 000稀釋的羊抗人IgG-HRP室溫孵育1 h，去處膜清洗后加入顯色液，判斷其與血清中ASO的匹配關(guān)系。(2)ELISA檢測(cè)SLO與ASO校準(zhǔn)品的相互作用將純化后的SLO和商業(yè)SLO用包被液稀釋至1 μg/mL，每孔100 μL加至酶標(biāo)板中，37 ℃孵育1 h，后3% BSA 4 ℃封閉過夜。用3% BSA稀釋ASO試劑盒的校準(zhǔn)品，獲得終濃度為4 U/mL的樣品，之后等倍稀釋，并依次分別加入酶標(biāo)板中，37 ℃孵育1 h，換成1∶2 000稀釋的羊抗人IgG-HRP，37 ℃孵育1 h，TMB顯色1 min后2 mol H2SO4終止顯色，酶標(biāo)儀450 nm處讀數(shù)，判斷重組SLO與校準(zhǔn)品的匹配關(guān)系。此試驗(yàn)做3組復(fù)孔。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間計(jì)量資料比較采用成組設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)，組間計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1重組克隆載體的構(gòu)建鑒定PCR擴(kuò)增出的片段大約在1 600 bp左右，與預(yù)期的大小相符，沒有其他非特異的條帶(圖1a)；從轉(zhuǎn)化的TOP10中提取質(zhì)粒，送樣測(cè)序，結(jié)果與PUC57中的目的序列一致，經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，切出約1 600 bp左右的片段，與目的片段大小相當(dāng)(圖1b)。

注：M為DNA Marker；1為無模板的對(duì)照；2為擴(kuò)增的SLO。

圖1a瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增SLO基因

注：M為DNA Marker；1和3為SLO-pET28a；2和4為NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切SLO-pET28a。

圖1b瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切SLO-pET28a

2.2SLO的誘導(dǎo)表達(dá)和可溶性分析轉(zhuǎn)化得到SLO-pET28a-BL21(DE3)經(jīng)過誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑濃度優(yōu)化，可表達(dá)相對(duì)分子質(zhì)量約為60×103的蛋白，目的蛋白約占總蛋白的30%(圖2a)，并且90%以上為可溶表達(dá)(圖2b)。

2.3重組SLO的分離純化離心收集菌體、超聲破碎后用Ni-Hp純化，低濃度咪唑洗雜后，用高濃度咪唑洗脫得到純度約為95%的SLO(圖3)，后用Sephadex G-50脫掉咪唑，最終產(chǎn)量約為12 mg/g菌體。

2.4重組SLO的生物學(xué)鑒定以試劑盒檢測(cè)的含ASO的血清為一抗，用Western Blot驗(yàn)證重組的SLO與血清中ASO反應(yīng)能力，顯色曝光(圖4a)，結(jié)果顯示，重組SLO與血清的ASO反應(yīng)能力較強(qiáng)，且與天然SLO相當(dāng)。以ASO校準(zhǔn)品為一抗，用ELISA驗(yàn)證SLO的抗原性，通過作圖比較，重組的SLO與ASO反應(yīng)能力較好，且與天然SLO相當(dāng)(圖4b)。以校準(zhǔn)品ASO濃度為橫坐標(biāo)，復(fù)孔吸光度均值為縱坐標(biāo)，STDEV為偏差，作圖比較，二者吸光度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：M為蛋白 Marker；1為誘導(dǎo)前全菌體蛋白；2為誘導(dǎo)后

全菌體蛋白。

圖2aSDS-PAGE分析SLO-pET28a-BL21(DE3)的

誘導(dǎo)表達(dá)

注：M為蛋白 Marker；1為超聲破碎后上清；2為超聲破碎后沉淀。

圖2b目的蛋白的可溶性分析

注：M為蛋白 Marker；1為超聲破碎后上清；2為經(jīng)Ni-Hp柱的穿出；3為收集的洗脫蛋白；4為外購天然SLO。

圖3Ni-Hp純化SLO

注：M為部分蛋白 Marker；1為重組的SLO；2為外購天然SLO。

圖4aWestern Blot驗(yàn)證重組的SLO與血清中ASO反應(yīng)

圖4b　　ELISA驗(yàn)證重組的SLO與ASO校準(zhǔn)品反應(yīng)

3討論

SLO是A群鏈球菌的代謝產(chǎn)物之一，因?yàn)樵谂R床檢測(cè)中的重要應(yīng)用，SLO也受到了越來越多的關(guān)注[6]。該蛋白的全長(zhǎng)有571個(gè)氨基酸，其中包括信號(hào)肽在內(nèi)的1～77氨基酸與SLO的溶血活性和抗原性不相關(guān)，并且對(duì)宿主細(xì)胞有毒害作用[7]。Bhakdi 等[8]在鏈球菌中提取出相對(duì)分子質(zhì)量為68×103和57×103的SLO，并且均有同等的溶血活性。所以本研究選擇表達(dá)SLO的78～571氨基酸片段，理論相對(duì)分子質(zhì)量約為57×103。雖然原核表達(dá)缺乏翻譯后的蛋白修飾加工系統(tǒng)，但是對(duì)于原核來源的蛋白質(zhì)，采用大腸桿菌表達(dá)，卻是不錯(cuò)的選擇，真核表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致過度糖基化[9]。為了利于純化，且不大幅度影響蛋白的結(jié)構(gòu)功能，本研究在蛋白的N端加入了6×His。

作為鑒定抗原抗體反應(yīng)的手段，ELISA綜合表現(xiàn)更為全面，在有校準(zhǔn)品對(duì)照時(shí)，若使用的抗體均識(shí)別抗原上的特定位點(diǎn)，可以做成靈敏的定量方法，市場(chǎng)上有單抗夾心定量抗原的試劑盒。WB抗原純度較低且沒有夾心抗體能展現(xiàn)其優(yōu)勢(shì)，在應(yīng)用于科研方面，圖片結(jié)果更能被接受，WB被廣泛采用[10]。在半定量細(xì)胞蛋白時(shí)，不需要純化該蛋白，僅需一種一抗即可。

為了確認(rèn)重組SLO能否作為試劑盒的原料應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)，購買了市場(chǎng)上應(yīng)用良好的ASO膠乳比濁試劑盒，以獲取濃度較為準(zhǔn)確的ASO校準(zhǔn)品和ASO血清樣本。以天然SLO為對(duì)照，用重組抗原去匹配試劑盒的校準(zhǔn)品和該試劑盒檢測(cè)的血清，分別采用ELISA和WB去驗(yàn)證。全面認(rèn)證了重組SLO對(duì)校準(zhǔn)品和血清ASO的響應(yīng)。

總之，本研究成功構(gòu)建了SLO原核表達(dá)菌株，經(jīng)過表達(dá)條件的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)。親和純化后得到了高純度的目的蛋白，之后通過驗(yàn)證重組SLO與ASO校準(zhǔn)品和ASO血清樣本，確認(rèn)他們有良好的結(jié)合能力，為該蛋白在診斷試劑中的應(yīng)用做好了鋪墊。

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DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.11.047

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)11-1556-04

(收稿日期：2016-01-13修回日期：2016-02-23)