張曜耀　肖準(zhǔn)　李尚為 　汪燕　康倍佳

(四川大學(xué)華西第二醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心， 四川 成都 610041)

·論著·

異種移植模型中血小板源生長(zhǎng)因子改善人卵巢組織移植物微循環(huán)重建研究*

張曜耀肖準(zhǔn)李尚為 汪燕康倍佳

(四川大學(xué)華西第二醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心， 四川 成都 610041)

【摘要】目的通過(guò)運(yùn)用前期研究提出新型卵巢組織玻璃化冷凍方法，改善了卵巢組織間質(zhì)和微血管存活狀況，在前期研究基礎(chǔ)上，對(duì)卵巢組織冷凍帶來(lái)的間質(zhì)損傷在凍融后進(jìn)行體外培養(yǎng)修復(fù)，培養(yǎng)中通過(guò)添加血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)改善移植后血管重建過(guò)程。方法對(duì)3例患者的卵巢組織皮質(zhì)片進(jìn)行深低溫保存。將3例共24片卵巢組織片配對(duì)分為PDGF干預(yù)組和對(duì)照組，每組各12片組織，通過(guò)體外短期培養(yǎng)24小時(shí)并在培養(yǎng)期間在PDGF組添加100ng/μl的PDGF作為干預(yù)，觀測(cè)培養(yǎng)前后卵巢組織體外生長(zhǎng)趨勢(shì)。將兩組卵巢組織移植到SCID小鼠皮下，兩周后將皮下組織取出，觀測(cè)組織血管重建情況，比較各組微血管密度計(jì)數(shù)以及組織生長(zhǎng)活性及凋亡情況。結(jié)果在異種移植模型中通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)卵巢新生微血管提示，添加PDGF因子培養(yǎng)后的卵巢組織移植物新生微血管密度計(jì)數(shù)顯著高于普通培養(yǎng)條件下的卵巢組織移植物。同時(shí)采用免疫熒光方法原位檢測(cè)組織凋亡(TUNEL)情況表明添加PDGF因子培養(yǎng)后的卵巢組織移植物凋亡細(xì)胞比例與對(duì)照組相比顯著降低。結(jié)論我們首次在卵巢組織體外培養(yǎng)過(guò)程中短期添加PDGF促進(jìn)卵巢血管生成。在異種移植模型中，我們發(fā)現(xiàn)添加PDGF因子的移植物微循環(huán)重建情況顯著改善，并且移植物凋亡情況與對(duì)照組顯著降低。以上結(jié)果為優(yōu)化卵巢組織體外培養(yǎng)以及移植物微循環(huán)重建效果提供了新思路。

【關(guān)鍵詞】卵巢冷凍； 生育力保存；卵巢移植 ；微循環(huán)重建；PDGF

不孕不育是嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量的疾病，其中很大比例為女性生育力的降低，如何維持、保存生育力是生殖醫(yī)學(xué)面臨的最大問(wèn)題[1,2]。近年女性生育力保存問(wèn)題備受學(xué)者關(guān)注。年輕的女性惡性腫瘤存活者。隨著腫瘤治愈率的提高，其存活情況得以改善的同時(shí)，具有細(xì)胞毒性的抗腫瘤治療常對(duì)卵巢造成不可逆的損傷,導(dǎo)致提前絕經(jīng)和不孕[3-5]。此外，許多非腫瘤因素如免疫性疾病、染色體異常、盆腔感染、復(fù)發(fā)性卵巢良性囊腫，醫(yī)源性因素等可造成卵巢功能受損甚至引起卵巢早衰[6-9]。卵巢組織冷凍不需要使用促排卵藥物治療，不延誤惡性腫瘤患者的治療時(shí)機(jī)，不受年齡和婚姻狀況的限制，可能有望同時(shí)保存女性生育力和生殖內(nèi)分泌功能。因此，相比較胚胎冷凍和卵子冷凍技術(shù)，卵巢組織冷凍更有優(yōu)勢(shì)和前景[10,11]。

卵巢間質(zhì)對(duì)卵巢組織片體外培養(yǎng)或移植后卵泡的支持和營(yíng)養(yǎng)以及微循環(huán)的建立具有重要作用。在間質(zhì)完整性的前提下，血管新生過(guò)程還與一系列血管生成調(diào)節(jié)因子相關(guān)。血管生成過(guò)程包括：細(xì)胞外基質(zhì)的重建；內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖；新生血管腔形成；周圍細(xì)胞募集以穩(wěn)定新生毛細(xì)血管以及最終的成熟血管形成。參與這一過(guò)程調(diào)控的因子呈網(wǎng)絡(luò)狀分布，其中正性調(diào)節(jié)因子主要為血管生成因子，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)家族，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)家族和血管生成素，此外，還有其他通過(guò)上調(diào) VEGF表達(dá)來(lái)促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF),血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF),表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)等以及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族。其中，血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF) 是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的重要多肽生長(zhǎng)因子,可促進(jìn)結(jié)締組織細(xì)胞(如血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞)增殖等。近年來(lái)，體內(nèi)外研究證實(shí)PDGF在腫瘤等組織中與血管生成作用密切相關(guān)。然而，PDGF是否能影響卵巢組織移植物的血管再生目前尚罕見(jiàn)報(bào)道。在本課題研究中，我們擬采用添加促進(jìn)血管生成因子添加一些促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子進(jìn)行短期體外培養(yǎng)，以促進(jìn)移植后卵巢組織新生血管生成，改善移植物微循環(huán)的及時(shí)建立和穩(wěn)定性，通過(guò)形態(tài)學(xué)、凋亡檢測(cè)、微血管計(jì)數(shù)等方法評(píng)價(jià)PDGF改善間質(zhì)存活和促進(jìn)微循環(huán)建立的效果，為優(yōu)化和改進(jìn)女性生育力保存體系提供研究思路，為惡性腫瘤存活者以及其他卵巢早衰易患人群的生育力保存和構(gòu)建人類卵子庫(kù)提供研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料選取我院婦科手術(shù)病人卵巢組織，共收集標(biāo)本3例，病人年齡范圍為20～26歲，中位年齡23.7歲。均為子宮惡性腫瘤附件切除患者。收集送病理檢查后剩余部分卵巢皮質(zhì)組織，病檢證實(shí)有癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至卵巢者剔除。本研究涉及人體標(biāo)本收集過(guò)程以及知情同意書經(jīng)四川大學(xué)倫理委員會(huì)以及四川大學(xué)華西第二醫(yī)院倫理委員會(huì)專家審核批準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)本收集將卵巢組織標(biāo)本放入含10%FBS的L-15培養(yǎng)液中，放置于冰盒中在10分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，在無(wú)菌超凈工作臺(tái)內(nèi)，更換新鮮培養(yǎng)液，在培養(yǎng)液中快速用眼科剪剔除卵巢組織髓質(zhì)后，將厚約1mm的卵巢組織皮質(zhì)塊分割成面積約為2～3mm2大小的組織小塊，每例患者標(biāo)本隨機(jī)等量分配到新鮮組及不同冷凍方法組。每例卵巢組織標(biāo)本可分割為約10片組織小塊，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)專家證實(shí)所取標(biāo)本均無(wú)癌細(xì)胞卵巢轉(zhuǎn)移。冷凍方法分為玻璃化冷凍(NIV法)，其中每一例收集凍存的標(biāo)本均留取少許組織固定，包埋，切片，染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，進(jìn)行了基本的解凍復(fù)蘇后冷凍效果評(píng)價(jià)。

1.2.2NIV冷凍NIV冷凍法為本課題組首創(chuàng)的新型玻璃化冷凍方法，在該方法中，采用了一種特殊載體——超細(xì)針灸針。針灸針為我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)療器械，它由針臂和針體兩部分組成。本實(shí)驗(yàn)中采用直徑為0.18 mm，長(zhǎng)為20 mm 的針。具體操作：在標(biāo)本收集液中將人卵巢組織片每3～4片穿于一根針體上，室溫下用鑷子鉗夾針臂端放入平衡液 B：7.5%(v/v) DMSO+7.5% (v/v) EG 10分鐘；再放入冷凍液 B：15% DMSO+15% EG+0.5 M sucrose 2分鐘。組織經(jīng)過(guò)脫水后，用消毒紗布輕輕吸去組織周圍剩余的冷凍保護(hù)劑，以減少保護(hù)劑體積，再同時(shí)鉗夾多根針臂快速浸入裝有液氮的金屬容器中，并在液氮中將針和組織裝入充有液氮預(yù)冷的冷凍小管中，放入液氮罐中保存一周以上。

1.2.3玻璃化法冷凍(NIV法)的復(fù)蘇從液氮中取出冷凍管，空氣中晃動(dòng)10秒，將玻璃化的組織小滴或超細(xì)針上的組織塊由冷凍管里取出后，立即浸于37 ℃預(yù)熱的1 M sucrose液中放置5 min,使組織表面的玻璃化液完全溶解。再將組織于室溫下迅速移到0.5 M sucrose液中放置5 min, 接著在0.25 M sucrose液中5 min。最后, 解凍的卵巢組織在基礎(chǔ)液中漂洗3 次, 一起放入37 ℃培養(yǎng)箱孵育15～20分鐘, 進(jìn)行下部分實(shí)驗(yàn)。

1.2.4卵巢組織體外培養(yǎng) 卵巢組織體外培養(yǎng)液以α-MEM 為基礎(chǔ)液，添加 10% 人白蛋白, 1% ITS (10μg/ml 胰島素, 5.5μg/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白和6.7ng/ml 亞硒酸鈉), 0.3IU/ml 人卵泡刺激素 (Gonal-F), 50 μg/ml 維生素C, 0.47 mmol/L 丙酮酸， 2mmol/L L-谷氨酰胺 ， 75 IU/ml 青霉素和 75 μg/ml鏈霉素。

體外培養(yǎng)法采用Scott提出的培養(yǎng)方法，將新鮮或冷凍復(fù)蘇后各組的卵巢組織片切成約1 mm×1 mm×1 mm 大小，分組放入24孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每孔放4片組織塊。培養(yǎng)皿底部預(yù)先用100μl 細(xì)胞外基質(zhì)包埋，使組織塊能更好在培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)。每孔中加入800 μl 新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)皿放置在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。

1.2.5形態(tài)學(xué)分析(H&E染色)新鮮、冷凍復(fù)蘇后或經(jīng)過(guò)短期體外培養(yǎng)后的卵巢組織經(jīng)常規(guī)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，按5μm連續(xù)切片，間隔10張進(jìn)行蘇木素-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察始基卵泡的形態(tài)。為了避免重復(fù)計(jì)數(shù)，只有卵母細(xì)胞核深染的卵泡被計(jì)數(shù)在內(nèi)。形態(tài)分析參照Gougeon提出的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.6免疫組織化學(xué)分析細(xì)織標(biāo)本經(jīng)常規(guī)處理、切片，脫蠟至水;微波抗原修復(fù);體積分?jǐn)?shù) 3 % H雙氧水阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶; 一抗稀釋，4度孵育過(guò)夜; 二抗室溫孵育 30 min; DAB 顯色.蘇木素復(fù)染，二甲苯透明。已知陽(yáng)性的組織作為陽(yáng)性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗為陰性對(duì)照。微血管判定及 MVD 計(jì)數(shù)方法參照文獻(xiàn)[12]: 每張切片先在低倍(100 倍)視野鏡中選出血管最豐富的三個(gè)區(qū)域,然后在400 倍視野下由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師同時(shí)計(jì)數(shù)微血管3次, 取其平均值。凡被CD34免疫組化染色染成棕色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇的,均作為一個(gè)血管計(jì)數(shù),管腔結(jié)構(gòu)形成并不作為判定的必要條件,已形成明顯肌層的血管不參與計(jì)數(shù)，由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師來(lái)進(jìn)行微血管判斷。

1.2.7凋亡測(cè)定(TUNEL法檢測(cè))新鮮或冷凍復(fù)蘇后的卵巢組織經(jīng)常規(guī)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，按5μm連續(xù)切片，間隔10張進(jìn)行TUNEL染色。按照Promega DeadEndTM Fluorometric Tunel system檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書中步驟操作。

1.2.8異種移植至重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠采用8周齡雄性SCID小鼠，經(jīng)培養(yǎng)的人卵巢組織異種異體移植至SCID小鼠腎包膜下或皮下，觀察移植短期(兩周后)卵巢組織細(xì)胞存活和新生血管情況 微血管評(píng)價(jià)：免疫組織化學(xué)或免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)卵巢新生微血管。分析組織細(xì)胞凋亡情況：采用免疫組化和免疫熒光方法原位檢測(cè)組織CD31及表達(dá)，凋亡(TUNNEL)，并檢測(cè)凋亡相關(guān)因子。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用chi-square 檢驗(yàn)分析干預(yù)組和對(duì)照組移植后TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分率；采用方差分析比較干預(yù)組和對(duì)照組移植后微血管密度。其中P<0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件為SPSS 15.0。

2結(jié)果

將3例解凍卵巢組織(每例患者各8片組織，共24片組織)分為PDGF干預(yù)組與對(duì)照組(各12片)，添加干預(yù)組在常規(guī)培養(yǎng)液中添加了100ng/ml的PDGF，空白對(duì)照組按照常規(guī)培養(yǎng)，在體外培養(yǎng) 24小時(shí)后, 光鏡下觀察組織塊形狀干預(yù)組與空白對(duì)照組相比，組織塊向間質(zhì)向外生長(zhǎng)程度較好。在8周齡雌性SCID小鼠，分別將添加PDGF因子的干預(yù)組及未添加干預(yù)因子的空白對(duì)照組的人卵巢組織片各12片異體移植至SCID小鼠腹部皮下(每只小鼠腹部皮下移植2片，共移植12只老鼠。兩周后將組織片取出通過(guò)HE切片在光鏡下觀察移植卵巢組織形態(tài)學(xué)顯示卵巢組織存活良好(圖1)。對(duì)比PDGF干預(yù)組以及對(duì)照組的卵泡計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，PDGF干預(yù)組的卵巢組織中形態(tài)正常卵泡數(shù)目顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。進(jìn)一步通過(guò)免疫組織化學(xué)進(jìn)行卵巢組織CD31染色檢測(cè)卵巢新生微血管情況(圖2)，結(jié)果表明添加PDGF因子培養(yǎng)后的卵巢組織移植物微血管密度顯著高于普通培養(yǎng)條件下的卵巢組織移植物(P<0.05)。

圖1PDGF組和對(duì)照組卵巢組織HE切片圖

Fig.1HE stain of ovarian fissue

注：(A) 添加PDGF干預(yù)組移植后兩周卵巢組織片HE染色情況，卵泡形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)緊密，與新鮮對(duì)照組相比間質(zhì)較為疏松。(B) 對(duì)照新鮮卵巢組織片HE染色情況，卵泡形態(tài)正常，間質(zhì)形態(tài)大致正常，間質(zhì)較為疏松。(放大倍數(shù)400倍)。

圖2各組卵巢組織片免疫組化圖(CD31染色)

Fig.2Immunochistochemistry of Ovarian tissue

(A) 添加PDGF組移植后兩周卵巢組織片免疫組化染色CD31表達(dá)情況，CD31陽(yáng)性表達(dá)的微血管密度較高。(B) 對(duì)照新鮮卵巢組織片免疫組化染色CD31表達(dá)情況，CD31陽(yáng)性表達(dá)的微血管密度較低(放大倍數(shù)400倍)。

采用免疫熒光方法原位檢測(cè)組織凋亡(TUNEL)情況表明添加PDGF因子培養(yǎng)后的卵巢組織移植物凋亡細(xì)胞比例與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3PDGF組與對(duì)照組卵巢組織移植物的卵泡計(jì)數(shù)，微血管密度及凋亡比例

Fig.3Ovariantollicale, density of blood lessed and apoptosis

注：(A) 添加PDGF組移植后兩周卵巢組織片卵泡計(jì)數(shù)，PDGF干預(yù)組的卵巢組織中形態(tài)正常卵泡數(shù)目顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。(B) 添加PDGF組移植后兩周卵巢組織片微血管密度，添加PDGF因子培養(yǎng)后的卵巢組織移植物微血管密度顯著高于普通培養(yǎng)條件下的卵巢組織移植物(P<0.05)。(C) 添加PDGF組移植后兩周卵巢組織中卵泡凋亡比例，添加PDGF因子培養(yǎng)后的卵巢組織移植物凋亡細(xì)胞比例與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)。

3討論

惡性腫瘤是目前嚴(yán)重威脅人類生命的疾病，隨著醫(yī)療技術(shù)水平的進(jìn)步，早期診斷和及時(shí)有效的治療，使惡性腫瘤患者的存活率得到極大改善。但大劑量放化療治療疾病的同時(shí)，也嚴(yán)重?fù)p害患者的性腺功能，腫瘤治愈后患者的生活質(zhì)量越來(lái)越引起人們關(guān)注。在治愈疾病的同時(shí)應(yīng)注重患者心理以及社會(huì)角色的恢復(fù)，對(duì)生殖健康的維護(hù)和生育能力的保存是生殖醫(yī)學(xué)、腫瘤學(xué)科，婦產(chǎn)學(xué)科等多學(xué)科共同探討的問(wèn)題[2,13-15]。

隨著早期診斷和先進(jìn)治療手段的發(fā)展，年輕的癌癥患者存活率大大增加。然而，細(xì)胞毒性的電離輻射和化療藥物可損害卵巢，常導(dǎo)致卵巢早衰造成內(nèi)分泌及生殖功能損傷。為了改善這種困境，女性生育能力的保存是目前生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究的熱點(diǎn)，包括卵母細(xì)胞，胚胎和卵巢組織保存。其中，卵巢組織保存具有其獨(dú)特的優(yōu)越性，因?yàn)樗苊饬顺倥怕训臐撛谒幬锔弊饔门c時(shí)間的消耗。此外，卵巢組織保存保存不僅適用于育齡婦女，對(duì)于青春期前的女孩而言卵巢組織冷凍是目前唯一的生育力體外保存方法[16]。

凍融后卵巢組織內(nèi)分泌功能的長(zhǎng)期恢復(fù)一直是該領(lǐng)域研究的難點(diǎn)問(wèn)題，凍融后卵巢組織卵泡發(fā)育和微循環(huán)重建可能與卵巢間質(zhì)存活狀態(tài)有著千絲萬(wàn)縷的關(guān)系。在卵泡發(fā)育過(guò)程中，卵巢間質(zhì)具有支持、營(yíng)養(yǎng)、促細(xì)胞增殖、遷移和穩(wěn)定局部微環(huán)境的作用，部分細(xì)胞外基質(zhì)可以結(jié)合生長(zhǎng)因子，參與調(diào)控卵泡發(fā)育和血管新生過(guò)程。研究提示：凍融卵巢組織片移植后的 48小時(shí)內(nèi)，由于早期的移植物缺血，新生血管尚未建立，缺血期和再灌注期低氧環(huán)境產(chǎn)生的氧代謝產(chǎn)物引起卵泡大量丟失。有學(xué)者回溯總結(jié)了卵巢移植的一些研究指出：冷凍后卵巢組織移植卵巢功能的恢復(fù)和維持不如新鮮卵巢組織移植。因此選擇合適的冷凍方案，合理的添加細(xì)胞外基質(zhì)成分和抗氧化成分，在盡可能完好保存卵巢卵泡和間質(zhì)的前提基礎(chǔ)上，建立卵巢移植模型，在移植前篩選增加干預(yù)因子降低缺血缺氧損傷，促進(jìn)血管生長(zhǎng)，維持微血管的功能，是卵巢組織冷凍保存和復(fù)蘇后重建卵巢功能的重要步驟。

卵巢組織成功的冷凍保存后，通過(guò)復(fù)蘇后卵巢移植完全恢復(fù)卵巢功能是一個(gè)理想狀態(tài)，但移植后卵巢功能重建仍是一技術(shù)難題。結(jié)合卵巢組織移植后的缺血損傷和新生血管的建立一直是卵巢冷凍移植的重點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題，本課題提出玻璃化冷凍在保存卵巢間質(zhì)細(xì)胞和血管基質(zhì)成分具有優(yōu)勢(shì)，一方面在冷凍技術(shù)上使多細(xì)胞盡可能完整保存，以利于組織微循環(huán)的再建，另一方面探討添加干預(yù)措施降低組織缺血和氧化應(yīng)激損傷。本研究旨在改善凍融卵巢的生殖和內(nèi)分泌功能恢復(fù)，通過(guò)短期培養(yǎng)過(guò)程中添加PDGF促進(jìn)新生血管建立來(lái)改善卵巢移植后功能重建。異種移植模型中觀察到PDGF干預(yù)后卵巢組織微血管密度情況顯著增加。

由于形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)分析在卵巢組織發(fā)育潛能評(píng)價(jià)中的局限性，我們通過(guò)對(duì)凋亡指標(biāo)的分析比較不同冷凍方法在保存卵巢發(fā)育潛能方面的效果。細(xì)胞凋亡指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下發(fā)生程序化死亡，細(xì)胞最后裂解成若干凋亡小體并被其他細(xì)胞所吞噬。各種環(huán)境刺激，包括溫度、創(chuàng)傷等均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在卵巢組織中，卵泡閉鎖、排卵、黃素化等過(guò)程都觀察到凋亡現(xiàn)象的發(fā)生，因此凋亡同人卵巢組織正常發(fā)育及其功能有密切關(guān)系。凋亡同形態(tài)學(xué)指標(biāo)相比，在評(píng)判卵巢組織冷凍損傷方面更為敏感；同時(shí)凋亡的發(fā)生率可能反應(yīng)了卵巢組織凍融后的發(fā)育潛能，因而是更有價(jià)值的反應(yīng)卵巢功能的指標(biāo)。通過(guò)TUNEL實(shí)驗(yàn)中凋亡發(fā)生率的分析，我們發(fā)現(xiàn)PDGF干預(yù)組凍融卵巢組織經(jīng)過(guò)短期培養(yǎng)與移植后凋亡比率顯著低于對(duì)照組，提示PDGF的添加可能通過(guò)改善卵巢組織微循環(huán)重建進(jìn)而經(jīng)過(guò)降低了卵巢組織的凋亡率。以上結(jié)果為優(yōu)化卵巢組織體外培養(yǎng)以及移植物微循環(huán)重建效果提供了新思路，為臨床保存女性生育能力，建立人類卵巢組織庫(kù)提供了研究基礎(chǔ)。

4結(jié)論

我們首次在卵巢組織體外培養(yǎng)過(guò)程中短期添加PDGF促進(jìn)卵巢血管生成。在異種移植模型中，我們發(fā)現(xiàn)添加PDGF因子的移植物微循環(huán)重建情況顯著改善，并且PDGF組移植物凋亡情況與對(duì)照組相比并凋亡顯著降低。以上結(jié)果為優(yōu)化卵巢組織體外培養(yǎng)以及移植物微循環(huán)重建效果提供了新思路。

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The study of PDGF on reconstruction of microcirculation in transplanted frozen-thawed ovarian tissue in SCID mice

ZHANG Yaoyao，XIAO Zhun,WANG Yan,et al

(CenterofReproductiveMedicine,DepartmentofObstetricsandGynecology,WestChinaSecondUniversityHospital，SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Abstract】ObjectiveThe problems of the tissue injury and the reconstruction of microcirculation in frozen-thawed ovarian tissue after transplantation are still unsolved. This research aimed at improving the reconstruction of microcirculation in frozen-thawed ovarian tissue after transplantation. MethodsDuring the in vitro culture，PDGF was selected to regulate the angiogenesis and restore the injury of stroma in the short-term culture system before ovarian tissue transplantation, to reduce the hypoxia-ischemia and apoptosis, to promote the angiogenesis and maintain the vascular stability in ovary grafts. ResultsAfter short term culture, the ovarian tissues were transplanted into the SCID mice. After the addition of PDGF during in vitro culture， microvessel density count of ovarian tissue transplantation was significantly higher than control group.At the same time in situ immunofluorescence to detect the apoptosis situation (TUNEL) showed that in the group with addition of PDGF, the proportion of apoptotic cells was statistically significant lower compared with control group.ConclusionIn a xenograft model, we found that after addition of PDGF reconstruction of microcirculation ovarian graft is improved significantly, and the apoptosis of graft was significantly reduced. This study provided the research clue to optimize and improve the female fertility preservation system.

【Key words】Ovarian vitrification; Fertility preservation; Ovarian transptransplantation; Reconstruction of microcirculation; PDGF

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(C120205)

通訊作者：李尚為，教授，博士生導(dǎo)師，本刊編委，E-mail：lswivf01@sina.com

【中圖分類號(hào)】R 329.3

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.05.004

(收稿日期：2016-02-01； 編輯： 張文秀)