張龍　康倍佳　汪燕　李尚為

(四川大學(xué)華西第二醫(yī)院生殖中心, 四川 成都 610041)

·論著·

Angiogenin參與凍融人卵巢組織微循環(huán)重建效果分析*

張龍康倍佳汪燕李尚為

(四川大學(xué)華西第二醫(yī)院生殖中心, 四川 成都 610041)

【摘要】目的用新型玻璃化冷凍方法凍融人卵巢組織，在體外培養(yǎng)該組織時(shí)添加angiogenin，觀察其對(duì)微血管生成的影響，并將培養(yǎng)后的組織進(jìn)行異種移植，觀察兩周后移植物的血循環(huán)情況。 方法收集人卵巢組織并用NIV法進(jìn)行凍融，通過免疫組化染色比較凍融前后組織中angiogenin的表達(dá)情況，將凍融的卵巢組織放在angiogenin濃度分別為0，100，200及400ng/ml的培養(yǎng)液中培養(yǎng)7天，取出組織進(jìn)行CD34免疫組化染色，計(jì)數(shù)并比較不同angiogenin濃度組卵巢組織微血管密度差異，確定較適宜的培養(yǎng)濃度后，在適宜濃度下培養(yǎng)凍融人卵巢組織0，2，5，7天，觀察不同培養(yǎng)時(shí)間組卵巢組織的微循環(huán)重建效果，將體外培養(yǎng)后的卵巢組織移植到SCID小鼠皮下，一周后取出移植物，觀察微血管密度變化及細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果凍融后卵巢組織間質(zhì)中的angiogenin表達(dá)量下降，卵巢組織在angiogenin濃度為200ng/ml的培養(yǎng)液中生長的卵巢組織微血管密度最高。添加angiogenin后培養(yǎng)5天的卵巢組織微血管密度較培養(yǎng)2天及培養(yǎng)7天組高。 卵巢組織短期培養(yǎng)后移植至SCID小鼠皮下一周，與對(duì)照組比較，添加angiogenin 200ng/ml培養(yǎng)后的卵巢移植物微血管密度增高，間質(zhì)細(xì)胞凋亡減少。結(jié)論angiogenin可促進(jìn)凍融人卵巢組織微循環(huán)重建，可為女性的生育能力保存提供有力的支持。

【關(guān)鍵詞】Angiogenin；玻璃化冷凍；人類；卵巢組織；微循環(huán)重建；生育能力保存

卵巢是女性重要的內(nèi)分泌器官和生殖器官，其功能狀態(tài)直接影響著女性的生活質(zhì)量和生育能力。惡性疾病的化療及卵巢良性疾病等因素均可造成卵巢功能受損，甚至喪失生育能力[1]。因此，如何有效地保存女性的生育潛能是目前生殖領(lǐng)域所面臨的重大問題。女性生育力保存可通過凍存卵子,胚胎以及卵巢組織完成。凍存卵子及胚胎均需要行促排卵治療，但此方式在多種疾病的治療過程中是不能完成的。此外，胚胎冷凍還受限于女性有無伴侶的條件。所以，卵巢組織冷凍對(duì)女性生育力的保存具有重要的作用。目前，在全球范圍內(nèi)已有通過凍融卵巢組織移植獲得妊娠的報(bào)道[2]。

卵巢組織凍融意在通過此方式獲得可供利用的各級(jí)卵母細(xì)胞，但是卵母細(xì)胞并非單獨(dú)存在，其依賴于周圍大量的間質(zhì)組織及細(xì)胞的支持，其中的微血管有著重要的養(yǎng)分供給作用。研究表明，凍融前后卵巢中各種組織均有不同程度的損傷[3]。我們曾通過高通量蛋白芯片檢測凍融前后卵巢組織中多種促血管生成因子表達(dá)量，得出凍融后間質(zhì)中多種促血管生成因子水平均下降，而angiogenin則是其中下降較明顯的一種。我們推測，通過在體外培養(yǎng)液中添加angiogenin可促進(jìn)凍融組織微循環(huán)重建。目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道angiogenin添加至體外培養(yǎng)體系對(duì)凍融人卵巢組織血管生成作用的研究，本文首次針對(duì)如何優(yōu)化angiogenin血管生成作用進(jìn)行探索。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料選取我院婦科卵巢手術(shù)病人，收集手術(shù)切除送檢后剩余的卵巢皮質(zhì)組織，病檢證實(shí)有癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至卵巢者剔除。本研究涉及的人體標(biāo)本收集過程以及知情同意書經(jīng)四川大學(xué)倫理委員會(huì)以及四川大學(xué)華西第二醫(yī)院倫理委員會(huì)專家審核批準(zhǔn)。在培養(yǎng)液中快速用眼科剪剔除卵巢組織髓質(zhì)后，將厚約1mm 的卵巢組織皮質(zhì)塊分割成面積約為 2-3mm2大小的組織小塊。采用本課題組發(fā)明的新型玻璃化冷凍法---細(xì)針穿刺浸入式玻璃化冷凍法(needle immersed vitrification，NIV)進(jìn)行卵巢組織冷凍，液氮環(huán)境下保存兩周后進(jìn)行解凍復(fù)蘇。

8周齡重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠(sever combined immune deficiency mise，SCID小鼠；北京華阜康生物科技有限公司)20只，培養(yǎng)液中不添加angiogenin為對(duì)照組(NS組)，培養(yǎng)液中添加200ng/ml的angiogenin為實(shí)驗(yàn)移植組(C/T組)，每組10只。

1.2主要試劑與儀器angiogenin抗體(Abcam公司，美國)，angiogenin(Gibco公司，美國)，CD34抗體(Abcam公司，美國)，Ki67抗體(Abcam公司，美國)，TUNEL試劑盒(Enzo Life Sciences公司，美國)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司，美國)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法與分組

1.3.1將新鮮的卵巢皮質(zhì)組織及采用NIV法進(jìn)行冷凍復(fù)蘇的卵巢皮質(zhì)組織切片，用angiogenin抗體作為二抗進(jìn)行免疫組化染色。

1.3.2體外培養(yǎng)液配制培養(yǎng)液以α-MEM 為基礎(chǔ)液，添加 10% 人血白蛋白, 1% ITS (10μg/ml 胰島素, 5.5μg/ml 轉(zhuǎn)鐵蛋白和6.7ng/ml 亞硒酸鈉), 50 μg/ml 維生素C, 0.47 mmol/L丙酮酸， 2mmol/L L-谷氨酰胺，75 IU/ml 青霉素和 75 μg/ml鏈霉素。體外培養(yǎng)法采用Scott提出的培養(yǎng)方法[4]，并做一定的改進(jìn)。具體操作：將新鮮或冷凍復(fù)蘇后各組的卵巢組織片切成約 1mm×1mm× mm 大小，分組放入插入有懸掛式培養(yǎng)皿并添加了100ul matrigil(ECM： collagens, laminin, fibronectin)的12孔培養(yǎng)皿中，每孔放2片組織塊。每孔中加入800 μl 新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)皿放置在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每兩天半量更換培養(yǎng)液并觀察組織生長情況。

1.3.3采用transwell小室進(jìn)行體外培養(yǎng)凍融卵巢組織，并按照培養(yǎng)液中添加的angiogenin濃度分為4組，A組培養(yǎng)液中angiogenin濃度為0，B組培養(yǎng)液中angiogenin濃度為100ng/ml，C組培養(yǎng)液中angiogenin濃度為200ng/ml，D組培養(yǎng)液中angiogenin的濃度為400ng/ml，每組10片卵巢皮質(zhì)組織，體外培養(yǎng)7天后取出進(jìn)行CD34及Ki67免疫組化染色。

1.3.4采用angiogenin濃度為200ng/ml的培養(yǎng)液進(jìn)行凍融卵巢皮質(zhì)組織培養(yǎng)，并按照培養(yǎng)時(shí)間長短分為0天/2天/5天及7天組，在相應(yīng)培養(yǎng)時(shí)間將卵巢組織取出進(jìn)行CD34染色。

1.3.5采用angiogenin濃度為0的培養(yǎng)液進(jìn)行卵巢組織體外培養(yǎng)后進(jìn)行異種移植作為對(duì)照組(NS組)，用angiogenin濃度為200ng/ml的培養(yǎng)液進(jìn)行卵巢組織體外培養(yǎng)后進(jìn)行異種移植作為實(shí)驗(yàn)移植組(C/T組)，每組10片組織，體外培養(yǎng)時(shí)間為7天，受體為8周齡的SCID小鼠，移植部位為皮下，移植后1周取出移植物，固定切片后行CD34染色，并用TUNEL試劑盒檢測組織凋亡情況。

1.4檢測指標(biāo)

1.4.1凍融前后angiogenin表達(dá)情況通過免疫組織化學(xué)染色顯示angiogenin的表達(dá)部位，各部位中凍融前后表達(dá)量的變化趨勢。

1.4.2微血管計(jì)數(shù)微血管判定及微血管密度計(jì)數(shù)方法[5]: 每張切片先在低倍(100 倍)視野鏡中選出血管最豐富的三個(gè)區(qū)域,然后在 400 倍視野下由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師同時(shí)計(jì)數(shù)微血管 3 次, 取其平均值。凡被CD34 免疫組化染色染成棕色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇的,均作為一個(gè)血管計(jì)數(shù),管腔結(jié)構(gòu)形成并不作為判定的必要條件,已形成明顯肌層的血管不參與計(jì)數(shù)。

1.4.3Ki67陽性細(xì)胞比例Ki67 指數(shù)指 100 個(gè)細(xì)胞中Ki67 的陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算方法: 每張切片于 400 倍鏡下選定 5 個(gè)視野, 每個(gè)視野計(jì)數(shù) 100 個(gè)細(xì)胞, 共500 個(gè)細(xì)胞, 計(jì)算每張切片上的陽性表達(dá)百分?jǐn)?shù)即為 Ki67 指數(shù)，根據(jù)陽性百分比( PP) 和陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱( SI) 制定判定標(biāo)準(zhǔn)。PP 0 分: 陽性細(xì)胞數(shù) 0～5%, 1分: ～25%, 2 分: ～50%, 3 分: >50%；SI 0 分:陰性, 1 分: 核著色淺, 陽性反應(yīng)僅沿核膜及核仁周圍分布, 2 分: 陽性細(xì)胞內(nèi)呈彌漫性顆粒狀而核仁不著色, 3 分: 陽性細(xì)胞核內(nèi)為均一棕色。PP 和 SI 相加后 ≥1 分為陽性表達(dá)；≥4 分為高表達(dá)[6]。

1.4.4組織凋亡檢測采用TUNEL試劑盒對(duì)使用angiogenin濃度為200ng/ml的培養(yǎng)液培養(yǎng)7天后行異種移植一周的卵巢組織進(jìn)行凋亡檢測，采用未添加angiogenin的培養(yǎng)液中培養(yǎng)7天后行異種移植一周的卵巢組織作為對(duì)照。結(jié)果判定:參照 Kim 所述方法，間質(zhì)凋亡陽性率 = 染色陽性的間質(zhì)細(xì)胞面積/組織總面積×100%;當(dāng)評(píng)判間質(zhì)細(xì)胞凋亡面積時(shí)，用圖像分析軟件半定量測定[7]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用chi-square 檢驗(yàn)分析不同濃度angiogenin培養(yǎng)組組織血管壁Ki67評(píng)分構(gòu)成比；采用單因素方差分析比較干預(yù)培養(yǎng)組和空白培養(yǎng)組移植后微血管密度以及凋亡陽性細(xì)胞百分比。其中P<0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件為SPSS17.0。

2結(jié)果

2.1Agiogenin在新鮮卵巢組織的卵泡顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞胞漿中表達(dá)。凍融后Angiogenin的表達(dá)量呈下降趨勢，凍融前后卵泡液中的angiogenin表達(dá)量下降趨勢不明顯，而間質(zhì)細(xì)胞中的angiogenin表達(dá)量下降趨勢明顯(圖1～2)。

2.2在不同濃度angiogenin培養(yǎng)液中生長的凍融卵巢組織中的微血管密度計(jì)數(shù)顯示，隨著angiogenin濃度上升，微血管密度計(jì)數(shù)增加。其中培養(yǎng)液中添加100ng/ml的angiogenin的B組相較于未添加的A組已出現(xiàn)微血管密度增加趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而繼續(xù)增加濃度的C組較B組有更好的效果，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但進(jìn)一步增加濃度的D組卻與C組之間差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3～4。

2.3在體外干預(yù)后異種移植條件下，C/T組的微血管密度計(jì)數(shù)較NS組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而TUNEL凋亡檢測提示C/T組組織凋亡較NS組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5～6)。

圖1新鮮卵巢組織中angiogenin的表達(dá)

Fig. 1The expression of angiogenin in fresh ovarian tissue

圖2冷凍后卵巢組織中angiogenin的表達(dá)

Fig. 2The expression of angiogenin in cryopreserved ovarian tissue

圖3angiogenin濃度為200ng/ml組CD34表達(dá)

Fig. 3The expression of CD34 in group with 200ng/ml of angiogenin

圖4未添加angiogenin組CD34表達(dá)情況

Figer 4The expression of CD34 in group without angiogenin

圖5C/T組凋亡情況

Figer 5Apoptosis in C/T group

圖6NS組凋亡情況

Figer 6Apoptosis in NS group

2.4采用Ki67染色后觀察到不同angiogenin濃度培養(yǎng)液中生長的卵巢組織均有增生活性細(xì)胞存在，其中可觀察到較多的血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，說明有較多的新生血管形成。其中C組Ki67高評(píng)分比例較A、B兩組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但與D組之間差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5固定的angiogenin濃度為200ng/ml的培養(yǎng)液進(jìn)行體外培養(yǎng)的卵巢組織中，培養(yǎng)2天以后即開始出現(xiàn)微血管密度計(jì)數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而培養(yǎng)5天的組織與培養(yǎng)2天及7天的組織相比，微血管密度計(jì)數(shù)更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.6肉眼可見少部分移植組織色澤蒼白，多數(shù)為淡粉色，較新鮮，移植組織周圍血管網(wǎng)形成，且組織已貼附于小鼠皮膚生長。

3討論

卵巢組織冷凍是女性生育力保存的重要手段之一。因卵巢組織冷凍不需要使用促排卵藥物治療，不延誤惡性腫瘤患者的治療時(shí)機(jī)，不受年齡和婚姻狀況的限制，可能有望同時(shí)保存女性生育力和生殖內(nèi)分泌功能，故其較胚胎冷凍和卵子冷凍技術(shù)具有更廣闊的應(yīng)用前景。與卵子冷凍及胚胎冷凍相比，組織冷凍復(fù)蘇效果受到更多的限制。凍融胚胎體積小，質(zhì)量輕，降溫速度快，復(fù)蘇后僅依靠胚胎的自身分化潛能即可繼續(xù)發(fā)育。但是卵巢組織的存活與生長并發(fā)揮功能，需要保存的不僅僅是各級(jí)卵母細(xì)胞，還包括大量的間質(zhì)細(xì)胞與組織。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)程序化冷凍方法對(duì)卵巢組織間質(zhì)的保存不如玻璃化冷凍法。

有學(xué)者回溯總結(jié)了卵巢移植的一些研究指出：冷凍后卵巢組織移植卵巢功能的恢復(fù)和維持不如新鮮卵巢組織移植[8]?？梢酝茰y，冷凍過程對(duì)卵巢組織間質(zhì)的損傷進(jìn)一步影響了移植后卵巢組織的微循環(huán)重建和細(xì)胞修復(fù)。在卵泡發(fā)育過程中，卵巢間質(zhì)具有支持、營養(yǎng)、促細(xì)胞增殖、遷移和穩(wěn)定局部微環(huán)境的作用，部分細(xì)胞外基質(zhì)可以結(jié)合生長因子，參與調(diào)控卵泡發(fā)育和血管新生過程。因此，卵巢間質(zhì)對(duì)卵巢組織片體外培養(yǎng)或移植后卵泡的支持和營養(yǎng)以及微循環(huán)的建立具有重要作用。在間質(zhì)完整性的前提下，血管新生過程與一系列血管生成調(diào)節(jié)因子相關(guān)。

我們的前期研究通過高通量蛋白芯片檢測凍融前后卵巢組織中促血管生成因子的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，angiogenin的表達(dá)在冷凍后下降顯著。免疫組化結(jié)果表明angiogenin在新鮮及解凍后的卵泡液中都有表達(dá)，在新鮮組織間質(zhì)細(xì)胞中也有大量angiogenin的表達(dá)，但在凍融后的卵巢皮質(zhì)間質(zhì)組織中angiogenin的表達(dá)明顯減少。根據(jù)結(jié)果我們可以推斷，添加angiogenin將作用于間質(zhì)細(xì)胞，從而促進(jìn)血管生成。

本研究在卵巢組織體外培養(yǎng)過程中短期添加angiogenin因子按不同添加濃度進(jìn)行體外培養(yǎng)。前期實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)含有200ng/ml angiogenin培養(yǎng)液中的卵巢組織片的微血管計(jì)數(shù)較空白對(duì)照組高。既往有研究者對(duì)人卵泡液中的angiogenin濃度進(jìn)行測定，得到的濃度約為276ng/ml[9]。本研究對(duì)照了添加angiogenin濃度分別為0,100ng/ml，200ng/ml以及400ng/ml的培養(yǎng)液對(duì)體外干預(yù)培養(yǎng)卵巢組織血管生成的影響。結(jié)果表明在添加angiogenin 200ng/ml的培養(yǎng)液中卵巢組織片血管計(jì)數(shù)最高。研究結(jié)果提示隨著angiogenin濃度增加，組織中微血管生成越多，當(dāng)angiogenin濃度達(dá)到200ng/ml時(shí)效果已經(jīng)達(dá)到最優(yōu)，繼續(xù)增加angiogenin的濃度并不能顯著增加微血管密度。我們認(rèn)為其可能的原因是由于angiogenin作為蛋白質(zhì)分子，其發(fā)揮作用需要與相應(yīng)受體結(jié)合，當(dāng)受體達(dá)到飽和，繼續(xù)增加濃度不能增加其效果。

研究亦發(fā)現(xiàn)，凍融卵巢組織培養(yǎng)前后間質(zhì)細(xì)胞中均見VEGF呈斑片狀弱表達(dá)，培養(yǎng)48小時(shí)后VEGF表達(dá)和微血管均增加并達(dá)到峰值，說明冷凍卵巢組織復(fù)蘇后通過短期體外培養(yǎng)，可以調(diào)動(dòng)血管生成過程[10]。但是，在不添加干預(yù)因子的卵巢組織體外培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)2天時(shí)血管密度計(jì)數(shù)達(dá)到峰值而培養(yǎng)4天以及培養(yǎng)6天后微血管密度下降，本實(shí)驗(yàn)采用添加了angiogenin的培養(yǎng)液進(jìn)行卵巢組織體外干預(yù)培養(yǎng)，并對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的卵巢組織微血管密度進(jìn)行計(jì)數(shù)后發(fā)現(xiàn)，從培養(yǎng)2天開始干預(yù)組微血管密度較空白對(duì)照組高，培養(yǎng)5天后的干預(yù)組卵巢組織微血管密度最高，與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比微血管保持的時(shí)間更久，此結(jié)果說明添加Angiogenin可以能持續(xù)促進(jìn)新生血管形成以及保持已建立的微血管。本結(jié)果適用于本實(shí)驗(yàn)條件，說明體外培養(yǎng)到5天，未血管密度計(jì)數(shù)比培養(yǎng)2天及7天高，但并不是說所有的體外培養(yǎng)都應(yīng)培養(yǎng)到5天。通過不同的培養(yǎng)條件，比如添加多種促學(xué)管生成因子協(xié)同培養(yǎng)，或者在未來采用組織工程材料進(jìn)行培養(yǎng)支持可能更好的促進(jìn)微循環(huán)重建，使得凍融卵巢組織的利用更加有效。

解凍后移植是冷凍卵巢組織的利用的重要方法，如果要恢復(fù)內(nèi)分泌功能則必須通過移植進(jìn)行，若只為生育也許可以采用體外培養(yǎng)結(jié)合體外成熟技術(shù)來獲得可利用的成熟卵子。在實(shí)驗(yàn)階段建立卵巢異種移植模型是一種有效的研究方法，采用SCID小鼠作為移植受體可以極大極大程度降低移植后的排斥反應(yīng)。培養(yǎng)后移植一周檢測微血管密度表明angiogenin濃度為200ng/ml在體內(nèi)仍能較好的促進(jìn)血管生成。

4結(jié)論

本研究提示在angiogenin濃度為200ng/ml的培養(yǎng)液中培養(yǎng)7天并進(jìn)行移植一周后的卵巢組織凋亡比率較空白對(duì)照組低。較低的凋亡比率意味著更好的保存現(xiàn)有組織細(xì)胞，從另一個(gè)角度說明了angiogenin對(duì)卵巢組織功能的保護(hù)作用。

本研究在卵巢組織體外培養(yǎng)過程中添加不同濃度的angiogenin因子進(jìn)行體外干預(yù)，促進(jìn)移植物微循環(huán)的及時(shí)建立并保持其穩(wěn)定性，抑制凋亡發(fā)生，促進(jìn)卵巢組織血供的早期恢復(fù)。本研究從改善間質(zhì)存活和促進(jìn)微循環(huán)建立著手，為優(yōu)化和改進(jìn)女性生育力保存體系提供研究思路。但是，卵巢功能的長期恢復(fù)在移植物血循環(huán)改善的基礎(chǔ)上，還與原始卵泡的發(fā)育啟動(dòng)和生長成熟過程相關(guān)，該過程的調(diào)控因素尚需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

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The microcirculation reconstruction effect of angiogenin on cryopreserved human ovarian tissue

ZHANG Long，KANG BeiJia，LI Shuangwei，et al

(WestChinaSecondHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the microcirculation reconstruction effect of angiogenin on cryopreserved human ovarian tissue in vitro and xenotransplantation. MethodsThe human ovarian tissues were collected and freeze thawed with NIV. The expression of angiogenin was detected with immunohistochemistry before and after freeze thawing. The freeze thawing ovarian tissues were cultured in angiogenin (0，100，200 and 400ng/ml) for 7 days. The tissues were stained with CD34 immunohistochemistry to observe the effect of microcirculation of reconstruction. The human ovarian tissue cultured in vitro was implanted in the skin of SCID mice. 1 week after implantation, the vessel density and apoptosis of ovarian tissue were observed. ResultsOvarian tissues were culture for 7 days in four groups according to the concentration of Angiogenin，0,100,200 and 400ng/ml. The micro vascular density increase as Angiogenin concentration increase, but same at 200 and 400ng/ml. Angiogenesis in 5 day group was more effective than that of 2 days and 7 days. After a short term culture，the ovarian tissue were xenotransplanted to SCID mice. One week later，the micro vascular density of 200ng/ml group was higher than control group，and the apoptosis rate of this group was significantly lower than that of control group. ConclusionThe 200ng/ml of Angiogenin may be the best concentrate for in vitro culture ovarian tissue and xenontransplanted ovarian tissue. The density of micro vascular in 5 day group is the highest. Apoptosis in angiogenin intervention group is significantly lower than control group. Our research provides the research clue to optimize and improve the female fertility preservation system.

【Key words】Angiogenin；Vitrification; Human；Ovarian tissue; Reconstruction of microcirculation；Fertility preservation

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31171442)

通信作者：李尚為，教授，博士生導(dǎo)師，本刊編委，E-mail: lswivf01@sina.com

【中圖分類號(hào)】R 329.33

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.05.003

(收稿日期：2016-02-01； 編輯： 張文秀)