何謙　熊驥　曹鈺　龐路人

(四川大學華西醫(yī)院急診科， 四川 成都 610041)

·論著·

EGCG通過減少線粒體DNA水平減輕百草枯導致急性肺損傷的實驗研究*

何謙熊驥曹鈺龐路人

(四川大學華西醫(yī)院急診科， 四川 成都 610041)

【摘要】目的研究沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對百草枯導致急性肺損傷保護作用的機制。方法選用60只清潔級Ⅱ級健康SD雄性大鼠分別建立對照組、百草枯組(PQ組)和PQ+EGCG干預組(PQ+EGCG組)，每組各20只。24小時后分別取各組大鼠的肺泡灌洗液、肺組織進行肺組織干濕重比、肺泡灌洗液中mtDNA、TNF-α和IL-6測定以及肺組織HE染色。結果百草枯組肺泡灌洗液中mtDNA、TNF-α和IL-6明顯升高，而經(jīng)過EGCG預處理后，3項指標均明顯下降(均P<0.05)。肺組織干濕重比和病理評分在百草枯組明顯升高，說明肺組織出現(xiàn)明顯炎性浸潤；而在PQ+EGCG組中均明顯降低(均P<0.05)。結論本研究結果發(fā)現(xiàn)，EGCG可以通過保護線粒體、減少mtDNA釋放，降低百草枯導致的肺組織炎癥反應水平，同時為百草枯導致急性肺損傷的機制研究和治療提出了一個新的理論基礎。

【關鍵詞】沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)；急性肺損傷；線粒體DNA；炎癥反應

百草枯是一種廣泛應用的有機雜環(huán)類除草劑，具有效果好、價格低的特點。目前市面上流通的主要是濃度20%的百草枯，由于其極高的毒性，許多人由于誤服百草枯或服用百草枯自殺，病死率可達到50%～90%，并且伴有極其嚴重的肺、腎、胰臟并發(fā)癥[1-3]。目前對百草枯中毒的機制尚不明確，也沒有特效解毒藥物。有關百草枯引起的急性肺損傷機制也尚不清楚。但很多研究顯示，嚴重的局部炎癥反應在百草枯引起的急性肺損傷中發(fā)揮了重要作用[4]。

線粒體DNA(mtDNA)是一種特殊的損傷相關分子模式(damage associatedmolecularpatterns，DAMP[5,6]。最近有大量文獻報道，在各種組織損傷過程中有mtDNA的釋放，并且循環(huán)mtDNA的含量與組織損傷程度呈正相關[7,8]。同時mtDNA作為古細菌在真核生物中的內共生產物，具有未甲基化的CpG片段，可以引起機體的炎癥反應[9]。沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate, EGCG)是綠茶的提取物，具有抗氧化、抗炎活性[10, 11]。本研究旨在揭示mtDNA在百草枯導致急性肺損傷中的作用，以及研究EGCG是否可以通過減少mtDNA而保護百草枯急性中毒導致的急性肺損傷。

1材料及方法

1.1動物分組及模型建立將清潔級Ⅱ級健康雄性SD大鼠60只(體重250～300g，購自四川大學華西實驗動物中心)，分別建立對照組、百草枯組(PQ組)和PQ+EGCG干預組(CPQ+EGCG組)各20只。百草枯組大鼠經(jīng)腹腔注射20%PQ液30mg/kg(英國捷利康有限公司)，建立PQ急性中毒模型；為了保證EGCG達到最低血藥濃度，EGCG+PQ組大鼠在腹腔注射PQ前2小時通過腹腔注射EGCG 4.0mg/kg進行預處理；對照組注射等量無菌生理鹽水。

1.2肺泡灌洗液(BALF)獲取和肺組織病理學檢查建立動物模型24小時后，通過腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉實驗動物，開胸，暴露氣管及肺，用套管針插入左支氣管并固定，拔出針芯后用2ml生理鹽水灌洗左肺，然后緩慢回抽，如此反復3次，收集3次的灌洗液，回收率約75%。同時取出右上肺，于福爾馬林中固定24小時后常規(guī)石蠟包埋、切片，行HE染色，觀察肺組織病理改變情況。

1.3實時熒光定量PCR技術測定肺泡灌洗液中mtDNA濃度使用DNA提取試劑盒(美國Qiagen公司)提取BALF中全部DNA。嚴格按照試劑盒說明書進行操作，最終將DNA溶解于200μl DNA溶解液中[11]。BALF中mtDNA測定基于SYBR-Green染色的熒光定量PCR技術，步驟為：初始階段50 ℃，2 分鐘；第一步變性溫度為95 ℃，3 分鐘；進行95℃ 10秒、55 ℃ 15秒和72 ℃ 10秒，共39個循環(huán)。標準曲線為攜帶有人類mtDNA的質粒(美國ORIGENE公司) 10 倍梯度稀釋獲得。mtDNA濃度使用標準的轉換系統(tǒng)轉換成拷貝數(shù)(copies)。BALFmtDNA濃度的計算公式為：c=Q*VDNA/VPCR*1/VEXT。其中c 為BALF中mtDNA 的濃度，Q 為熒光定量PCR 檢測的樣本中mtDNA 的拷貝數(shù)，VDNA為每個BALF樣本中提取DNA 的總體積，本研究中為200μl；VPCR代表熒光定量PCR 時加入DNA 的體積，本研究中為1 μl；VEXT代表提取DNA 時使用的BALF的量，本實驗中為50 μl。

1.4TNF-α、IL-6測定肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6分別采用相應的試劑盒(索萊寶，北京)進行測定，所有步驟均嚴格按照說明書進行。

1.5肺干濕重比(DWR)檢測開胸取右下肺組織，稱重后置80℃烤箱烘烤48小時，干燥至恒重。肺干濕比=濕重/干重。

1.6肺組織損傷評分標準在處死動物后取得的肺病理切片中，對鏡下肺組織的以下5種病理改變進行綜合評估：肺泡腔壁水腫增厚、肺泡內出血、中性粒細胞浸潤肺泡腔或浸潤肺泡壁及肺泡壁透明膜形成。根據(jù)每項有無指標病變，進行評分(0=無病變，1=有病變)，累加各項評分的總分作為肺病理損傷評分， 0分為正常肺組織，5分為損傷最嚴重的肺組織。

2結果

2.1各組大鼠BALF中mtDNA及炎癥因子水平PQ組BALF中mtDNA顯著高于對照組(P<0.05)，PQ+EGCG組BALF中mtDNA水平較PQ組顯著降低(均P<0.05)。PQ組BALF中TNF-α、IL-6顯著高于對照組(均P<0.05)，PQ+EGCG組BALF中mtDNA水平較PQ組顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1　各組大鼠BALF中mtDNA及炎癥因子水平比較

注：與對照組比較，①P<0.05;與PQ組比較，②P<0.05

2.2各組大鼠肺干濕重比情況PQ組肺干濕重比顯著高于對照組(P<0.05)，PQ+EGCG組肺干濕重比較PQ組顯著降低(P<0.05)，見表2。

2.3各組大鼠肺組織病理改變情況PQ組較對照組肺組織出現(xiàn)肺泡壁組織水腫、肺間質出血以及中性粒細胞浸潤等典型肺損傷的病理結構改變，PQ+EGCG組出現(xiàn)肺組織病理損傷程度較PQ組顯著改善；PQ組肺病理評分顯著高于對照組(P<0.05)，PQ+EGCG組肺病理評分較PQ組顯著降低(P<0.05)，見圖1。

表2　各組大鼠肺干濕重比較±s)

注：與對照組比較，①P<0.05；與PQ組比較，②P<0.05

圖1各組肺病理改變情況

Figure 1Pathological changes of lung tissue

注：PQ組(B)肺損傷程度明顯較對照組(A)嚴重，EGCG+PQ組(C)肺病理損傷程度較PQ組(B)減輕

2.4各組大鼠肺組織損傷程度按損傷肺組織病理評分評定肺損傷程度，結果見表3。

表3　各組大鼠肺損傷程度比較±s)

注：與對照組比較，①P<0.05；與PQ組比較，P<0.05

3討論

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，百草枯引起大鼠急性肺損傷主要以彌漫性肺泡損傷為特征性表現(xiàn)，肺組織HE染色可見肺泡壁增厚、破損，同時大量炎性細胞浸潤，肺組織干濕重比明顯升高。進一步肺泡灌洗液檢查發(fā)現(xiàn)，炎癥因子TNF-α、IL-6和mtDNA的表達明顯增加。本研究還首次發(fā)現(xiàn)，在百草枯導致大鼠急性肺損傷之肺泡灌洗液中mtDNA含量明顯升高。在預先給予EGCG處理后，大鼠急性肺損傷程度明顯減輕，肺泡灌洗液中mtDNA和炎癥因子水平明顯下降。

EGCG是綠茶中的主要活性成分，具有強大的抗氧化、消除活性氧集團和抗炎性作用，大量研究顯示，其抗炎性作用主要是通過抑制細胞內NF-κB介導的炎性信號通路[12-15]。本研究結果顯示，在EGCG預處理情況下，肺泡灌洗液中的3種炎癥因子表達水平出現(xiàn)明顯下降，同時肺組織HE染色顯示肺組織水腫程度降低，炎性細胞浸潤減少，肺組織干濕重比水平下降。說明EGCG確實可以降低百草枯導致的急性肺組織炎性反應，改善急性肺損傷程度。但是對于EGCG保護作用的機制仍不清楚，需要進一步研究。

目前有文獻報道EGCG的抗氧化作用[16]，線粒體作為細胞內能量供應的細胞器，其功能損傷和異常極易導致電子傳遞鏈的中斷，引起活性氧集團的大量產生而進一步損傷細胞。mtDNA的釋放被認為是發(fā)生在線粒體氧化應激損傷之后，表現(xiàn)為線粒體的嚴重水腫，部分mtDNA發(fā)生水解，通過線粒體膜上的通透性孔道釋放[17]。本研究百草枯所致急性肺損傷中肺泡灌洗液的mtDNA水平明顯升高，說明肺泡上皮細胞出現(xiàn)嚴重的線粒體損傷，mtDNA從線粒體中逐漸被釋放到肺間質中。而EGCG預處理后，mtDNA水平明顯下降，表明EGCG可能作用于線粒體，減輕線粒體的氧化應激損傷并穩(wěn)定線粒體膜，減少mtDNA釋放到細胞外。

目前有大量研究表明，循環(huán)mtDNA可以激發(fā)炎癥介質的大量釋放并導致全身炎癥反應，它可在體外引起神經(jīng)元細胞和膠質細胞炎癥因子的釋放[18, 19]，刺激人外周血單核細胞系THP-1釋放大量IL-6和TNF-α[20]。此外，mtDNA的釋放也可以刺激體內白細胞的活化，觸發(fā)一系列炎癥級聯(lián)反應[21]。結合我們的研究結果，我們認為釋放到細胞外的mtDNA在百草枯導致的急性肺損傷中發(fā)揮了重要作用。在EGCG預處理后，肺泡灌洗液中mtDNA水平和炎性因子表達水平均明顯下降，說明在減少mtDNA的釋放后，炎癥反應水平也相應下降，EGCG同時具有抗炎和抗氧化的作用。因此，我們有理由相信，EGCG可以部分通過穩(wěn)定線粒體，減少mtDNA的釋放來發(fā)揮其抗炎作用。

4結論

我們的研究發(fā)現(xiàn)，EGCG可以通過保護線粒體，減少mtDNA的釋放，從而降低肺組織炎癥反應水平。結合肺組織病理切片和肺組織干濕重比分析，我們認為，EGCG對于百草枯導致的急性肺損傷可以發(fā)揮有效地保護作用。因此，我們的研究為EGCG抗氧化、抗炎作用的機制提供了新的思路，也為百草枯導致急性肺損傷的機制研究和治療提出了一個新的理論基礎。

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Epigallocatechin-3-gallate protects paraquat-induced acute lung injury through inhibiting the release of mitochondrial

DNAHE Qian,XIONG Ji，CAO Yu,et al

(DepartmentofEmergency，WestChinaHospital，SichuanUniversity，Chengdu610041,China)

【Abstract】ObjectiveTo study the mechanism of the protective effects of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) on paraquat-induced acute lung injury. Methods60 SD rats were divided into the control group, paraquat(PQ) group and PQ+EGCG group. After 24 h, broncho-alveolar lavage fluid (BALF) and lung tissue were collected to measure levels of mtDNA, TNF-α and IL-6, and wet/dry ratio and HE staining, respectively. ResultsOur data showed that levels of mtDNA, TNF-α and IL-6 elevated in PQ group, which could be inhibited by EGCG(P<0.05). Wet/dry ratio and pathological score of PQ group were higher than that of the control group, which could be also inhibited by EGCG(P<0.05). ConclusionWe find that EGCG can protect paraquat-induced acute lung injury through inhibiting the release of mtDNA. Meanwhile, we also provide a novel theory for understanding and treating paraquat-induced acute lung injury.

【Key words】Epigallocatechin-3-gallate; Acute lung injury; Mitochondrial DNA; Inflammatory responses

基金項目:國家自然科學基金(0040205401B83)

通訊作者：曹鈺，教授，本刊常務編委，E-mail：yuyuer@126.com

【中圖分類號】R-33

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.06.005

(收稿日期：2016-03-29； 編輯： 母存培)