白蕙箐，李洪萍，朱婉月，郭宮德，白秀娟（.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱5000；.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春08；.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱5000）

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水貂阿留申病糞便中DNA的提取方法及與產(chǎn)仔數(shù)的相關(guān)性

白蕙箐1，李洪萍2，朱婉月3，郭宮德1，白秀娟1
（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

水貂阿留申?。ˋleutian disease of mink），又稱漿細(xì)胞增多癥（Plasmacytosis），是由細(xì)小病毒科的阿留申病病毒（ADMV）引起的一種慢性傳染病，導(dǎo)致自身免疫系統(tǒng)紊亂并逐漸衰竭，并發(fā)強(qiáng)烈的自身免疫。主要侵害網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，其特征為漿細(xì)胞彌漫性增生、產(chǎn)生多量C-球蛋白和持續(xù)性的病毒血癥。水貂阿留申病具有自身免疫和超敏現(xiàn)象，并伴有動(dòng)脈血管炎、腎小球腎炎以及卵巢、睪丸等炎癥變化。該病使母貂空懷、流產(chǎn)、不發(fā)情、弱胎，公貂精子活力、配種能力降低，導(dǎo)致繁殖率低，皮毛質(zhì)量差，死亡率高，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

水貂阿留申病在許多水貂養(yǎng)殖地區(qū)廣泛流行，是當(dāng)前威脅養(yǎng)貂業(yè)發(fā)展的主要疫病之一。最早發(fā)現(xiàn)于1946年，至今已經(jīng)廣泛流行于歐、美、亞的20多個(gè)國(guó)家，在我國(guó)，阿留申病普遍存在于全國(guó)各個(gè)貂場(chǎng)，某些地區(qū)感染率甚至高達(dá)80%[2]。該病為慢性傳染病，潛伏期長(zhǎng)，發(fā)病前期癥狀不明顯，因此容易被忽視，從而導(dǎo)致檢疫力度不夠，病貂未能及時(shí)淘汰。病毒通過(guò)病貂的排泄物等排出體外，污染環(huán)境，感染其他健康水貂，引起該病大面積流行。阿留申病的主要傳染源是病貂和潛伏期病貂。目前還沒(méi)有從根本上治療阿留申病的藥物，只有通過(guò)加強(qiáng)檢測(cè)預(yù)防來(lái)控制阿留申病的傳播。

對(duì)水貂阿留申病的檢測(cè)多為采血或組織取樣，但由于水貂經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的特殊性，采血和取樣對(duì)其經(jīng)濟(jì)價(jià)值有較大影響，以至產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)損失。筆者采用水貂糞便檢測(cè)方法，研究牡丹江某貂場(chǎng)水貂阿留申病的發(fā)病情況并驗(yàn)證其對(duì)產(chǎn)仔數(shù)的影響。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料糞便樣品由牡丹江某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)提供。

1.2試驗(yàn)儀器手術(shù)剪、鑷子；1.5 mL離心管；微量移液器，恒溫水浴鍋，PL2002型電子天平；TGL-16GA型高速離心機(jī)，溫度梯度PCR儀，電泳儀，對(duì)流電泳槽，凝膠成像系統(tǒng)。

1.3主要試劑PBS緩沖液，Taq DNA聚合酶，dNTPs（購(gòu)自哈爾濱?；锟萍加邢薰荆?0× Buffer（購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司），Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒（購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）。

本試驗(yàn)所使用的引物是參照Qie等[3]1996年使用的引物。引物序列為：

上游：P1：5′-CTTGTCACGCTACTAGAATGGT-3′（2 587 bp～2 609 bp）

下游：P2：5′-AGCTTAAGGTTAGTTTACATG?GTTTACT-3′（3 252 bp～3 279 bp）

引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度是693 bp。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1樣品采集隨機(jī)選擇貂場(chǎng)產(chǎn)子胎數(shù)、生長(zhǎng)狀況相近的雌性水貂，取其糞便樣品于獨(dú)立密封袋中，按其產(chǎn)子數(shù)分為兩組：高產(chǎn)仔數(shù)組（產(chǎn)仔數(shù)≥7只）30只，隨機(jī)平均分為3組；低產(chǎn)仔數(shù)組（產(chǎn)仔數(shù)≤3只）30只，隨機(jī)平均分為3組。于-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2樣品預(yù)處理取0.3 g樣品放入滅菌的1.5 mL離心管中，加入1 mL的PBS緩沖液，充分震蕩5～10 min。3 000 r/min離心5 min，將上清液移至新離心管中。將上清液6 000 r/min離心5 min，收集上清液于新的離心管中。

1.4.3DNA提取加入0.6 μL溶液A到上一步得到的樣品中，振蕩30 s混勻后，室溫放置10 min。將溶液轉(zhuǎn)移到吸附柱中，室溫放置2 min，12 000 r/min離心1 min，棄穿透液，把吸附柱放回收集管內(nèi)。加0.7 μL通用洗柱液到吸附柱內(nèi)，12 000 r/min離心1 nin，棄穿透液。12 000 r/min離心1 min后棄離心管。將吸附柱套入一個(gè)新的1.5 mL離心管中，在吸附柱的濾膜中加入30 μL DNA洗脫液，室溫放置2 min。12 000 r/min離心1 min，即得DNA溶液。

1.4.4PCR擴(kuò)增將提取的病毒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，51℃退火30 s，72℃延伸1 nin，循環(huán)35次；72℃再延伸7 min，4℃保存。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

2　結(jié)果與分析

2.1水貂阿留申病病毒糞便提取結(jié)果選取患病水貂糞便，根據(jù)上述方法，提取糞便中阿留申病病毒的DNA結(jié)果可見圖1。擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為693 bp，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物介于500 bp～750 bp之間，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1　從糞便中提取的阿留申病病毒DNA PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果M：DL-2 000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～6：PCR產(chǎn)物

2.2水貂阿留申病對(duì)產(chǎn)仔數(shù)影響分析結(jié)果所采糞樣進(jìn)行阿留申病病毒DNA提取后，對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)為693 bp。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳結(jié)果見圖2、3。

圖2　低產(chǎn)仔數(shù)組阿留申病病毒DNA PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果M：DL-2 000分子量標(biāo)準(zhǔn)；K：空白對(duì)照；1～5：PCR產(chǎn)物

兩組水貂阿留申病帶毒率見表1，對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，利用SPSS 20.0軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，高產(chǎn)仔數(shù)組與低產(chǎn)仔數(shù)組帶毒率的差異顯著（P<0.05）。所以，水貂阿留申病對(duì)水貂產(chǎn)仔數(shù)的降低有影響。

圖3　高產(chǎn)仔數(shù)組阿留申病病毒DNA PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果M：DL-2 000分子量標(biāo)準(zhǔn)；K：空白對(duì)照；泳道1～10：PCR產(chǎn)物

表1　兩組水貂阿留申病帶毒率

3　討論

3.1糞便提取DNA通過(guò)采血或者組織取樣的方式進(jìn)行水貂阿留申病的檢測(cè)，對(duì)被檢水貂個(gè)體造成一定傷害，不利于其經(jīng)濟(jì)價(jià)值的保護(hù)。本試驗(yàn)利用糞便DNA提取技術(shù)，從患病水貂糞便中成功提取阿留申病病毒DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)得到清晰明亮的條帶，利用該方法可以進(jìn)行阿留申病的檢測(cè)。劉維全[4]用ELISA法，成功的在水貂糞便中檢測(cè)出冠狀病毒和呼腸孤病毒。譚斌等[5]利用患病水貂糞便，通過(guò)血清學(xué)鑒定、PCR鑒定等試驗(yàn)，分離出水貂病病毒性腸炎的強(qiáng)毒株。以往的試驗(yàn)均證明從水貂糞便中提取病毒DNA的方法切實(shí)可行，與本試驗(yàn)結(jié)果相符。該方法不僅操作簡(jiǎn)便，而且對(duì)被檢水貂不會(huì)造成干擾和傷害，將經(jīng)濟(jì)損失降到最小化，有很高的應(yīng)用價(jià)值，為水貂阿留申病的檢測(cè)提供了新的檢測(cè)手段。

3.2水貂阿留申病對(duì)產(chǎn)仔數(shù)的影響本試驗(yàn)結(jié)果顯示，高產(chǎn)仔數(shù)組阿留申病帶毒率低于低產(chǎn)仔數(shù)組水貂帶毒率，兩組水貂帶毒率差異顯著（P< 0.05）。表明水貂阿留申病對(duì)產(chǎn)仔數(shù)有一定影響，患病水貂產(chǎn)仔數(shù)下降。李增光[6]報(bào)道，阿留申病使養(yǎng)貂產(chǎn)仔率下降30%左右。宋月峰[7]表述，阿留申病會(huì)導(dǎo)致母貂空懷率和死胎率上升，平均產(chǎn)仔數(shù)下降。籍玉林等[8]研究表明，阿留申病陽(yáng)性母貂的窩產(chǎn)仔數(shù)和窩均存活數(shù)均低于陰性母貂。以往試驗(yàn)結(jié)果均與本試驗(yàn)結(jié)果相符。分析原因，可能是水貂阿留申病對(duì)感染水貂的生殖系統(tǒng)有很大影響和損傷，引起公貂精子水平下降，母貂空懷、流產(chǎn)、不發(fā)情等，從而造成產(chǎn)仔數(shù)的下降。基于本試驗(yàn)研究中樣本含量較少，在本試驗(yàn)基礎(chǔ)上，有待通過(guò)提高樣本量進(jìn)行深入研究從而得出更切實(shí)可靠的結(jié)論。

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[4]劉維全，韓慧民.水貂腸道冠狀病毒和呼腸孤病毒的病原性及在腹瀉中的作用[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，1993（12）：27-29．

[5]譚斌，陳微晶，武華.致病性水貂腸炎病毒MEV-ZJ1株的分離與鑒定[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2011，38（2）：149-152．

[6]李增光.水貂阿留申病[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，1985，15．

[7]宋月峰，宋曉東，王曉龍.水貂阿留申病的防治[J].中國(guó)動(dòng)物保健，2013，15（4）：69-70．

[8]籍玉林，曲維江.水貂阿留申病循環(huán)免疫復(fù)合物含量與抗體水平對(duì)產(chǎn)仔成活的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1995，15（3）：224-227.

中圖分類號(hào)：S865.2+2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：0529-6005（2016）05-0054-02

收稿日期：2015-01-23

作者簡(jiǎn)介：白蕙菁（1990-），女，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物養(yǎng)殖，E-mail：huiqing_bai@163.com

通訊作者：白秀娟，E-mail：bxj630306@163.com