姜　波，費(fèi)洪新，宋　磊，尹麗穎，仲麗麗，張英博，李寶龍，周忠光*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

·實(shí)驗(yàn)研究·

黃芪多糖對(duì)阿爾茨海默病大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1水平的影響

姜波1，費(fèi)洪新2，宋磊1，尹麗穎1，仲麗麗1，張英博2，李寶龍1，周忠光1*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

摘要：目的探討黃芪多糖(APS)對(duì)阿爾茨海默病(AD)大鼠海馬超微結(jié)構(gòu)和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1 (LRP1)水平的影響。方法Wistar大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組，模型組，治療組(吡拉西坦0.5 g/kg)，APS高、中、低劑量組(APS 0.8、0.4、0.2 g/kg)。采用Aβ1-42雙側(cè)腦室注射大鼠誘導(dǎo)建立AD模型。給予APS連續(xù)灌胃治療30 d后取材，觀察大鼠海馬鏡下超微結(jié)構(gòu)、計(jì)算脾和胸腺臟器指數(shù)。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)海馬Aβ1-40和LRP1，血清Aβ1-40水平。采用RT-PCR法檢測(cè)海馬LRP1 mRNA的含量。結(jié)果與模型組比較，APS高、中劑量組腦海馬形態(tài)明顯改善，脾和胸腺臟器指數(shù)明顯增加(P<0.05)，海馬組織Aβ1-40水平明顯降低(P<0.05)，海馬組織LRP1和血清Aβ1-40水平明顯增加(P<0.05)。結(jié)論APS能改善AD大鼠海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)，增加海馬LRP1水平、脾和胸腺臟器指數(shù)。

關(guān)鍵詞：黃芪多糖；阿爾茨海默?。怀⒔Y(jié)構(gòu);LRP1

阿爾茨海默病(AD)是臨床上常見(jiàn)的高發(fā)于老年人的疾病之一[1]，AD主要病理是β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成老年斑(SP)，Aβ主要包括Aβ1-42和Aβ1-40，其中Aβ1-40促進(jìn)Aβ1-42沉積，利于SP的形成[2]。黃芪多糖(APS)是黃芪的主要成分之一，APS的臨床應(yīng)用十分廣泛，如APS促進(jìn)糖尿病大鼠模型皮膚傷口愈合[3]，APS治療糖尿病綜合效果較好[4]，APS減輕氧化損傷和抑制細(xì)胞凋亡[5]，APS通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子-κB途徑發(fā)揮抗氧化作用[6]，APS提高西藥順鉑的抗腫瘤效果[7]，APS通過(guò)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)來(lái)治療全身性硬皮病等[8]。本課題的前期工作顯示，APS可以改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力[9]。實(shí)驗(yàn)制備AD模型方法包括海馬注射Aβ1-42[10-12]、海馬注射Aβ1-42及腹腔注射D-半乳糖[13]、APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型[14-16]等。基于APS對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)AD大鼠的研究國(guó)內(nèi)外尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)采用APS為處理因素，以Aβ1-42誘導(dǎo)AD大鼠模型為研究對(duì)象，觀察APS對(duì)AD大鼠超微結(jié)構(gòu)、臟器指數(shù)和LRP1的影響。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)雄性Wistar大鼠36只，體質(zhì)量(230±20) g[由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心李寶龍副主任提供，質(zhì)量合格證書(shū)號(hào)碼：SCXK(黑)2013-012]。Wistar大鼠飼養(yǎng)在常溫、常濕的屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施環(huán)境中，動(dòng)物自由攝取無(wú)菌食物和水。

1.2藥品和試劑LRP1和Aβ1-40酶聯(lián)免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20140401)，Aβ1-42(Sigma公司)，吡拉西坦(東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司，批號(hào)：5140556)，APS(南京澤朗醫(yī)藥科技集團(tuán)公司)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院周忠光教授提供。

1.3儀器Applied Biosystems step one plus定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，TCNAI-G2型透射電子顯微鏡(荷蘭公司)，TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，PLZOZ-S型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，STW-1型腦立體定位儀(成都儀器廠)，6100型RT-雷杜酶標(biāo)儀(美國(guó)RT公司)等。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1復(fù)制AD模型大鼠水合氯醛進(jìn)行麻醉后，剪去頭頂部毛發(fā)，暴露頂骨，STW-1型腦立體定位儀定位大鼠海馬區(qū)，雙側(cè)腦室海馬區(qū)一次性注入10 μg凝聚態(tài)Aβ1-42(2 μg/μL)，針頭留下15 min，包扎大鼠頭部，預(yù)防感染；同時(shí)對(duì)照組大鼠雙側(cè)腦室注射等量生理鹽水。

2.2分組實(shí)驗(yàn)大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表的排列順序，隨機(jī)將大鼠分為對(duì)照組，模型組，治療組，APS高、中、低劑量組，每組6只，共36只。

2.3給藥對(duì)照組和模型組大鼠給予生理鹽水灌胃，治療組給予吡拉西坦0.5 g/kg灌胃、APS高劑量組給予APS 0.8 g/kg灌胃、APS中劑量組給予APS 0.4 g/kg灌胃、APS低劑量組給予APS 0.2 g/kg灌胃，灌胃持續(xù)時(shí)間30 d。

2.4透射電子顯微鏡觀察海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)大鼠末次給藥2 h后，麻醉，剪開(kāi)胸腔，暴露心臟，針頭插入左心室，左心室緩慢灌注150 mL生理鹽水，密切觀察肝臟，直到肝臟變白后,然后用2.5%戊二醛灌注，取材大鼠腦組織海馬CA1部位、2.5%戊二醛固定、四氧化鋨固定、脫水、包埋、切片等過(guò)程,TCNAI-G2型透射電子顯微鏡觀察大鼠腦組織海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)。

2.5測(cè)定脾和胸腺臟器指數(shù)大鼠斷頭處死后，冰臺(tái)上迅速解剖，取材大鼠脾和胸腺，用生理鹽水清洗干凈，電子天平精確稱取大鼠脾和胸腺的臟器質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)。

2.6檢測(cè)海馬Aβ1-40、海馬LRP1和血清Aβ1-40大鼠眼球摘除，取混合血，然后大鼠斷頭迅速取海馬組織，勻漿，4 ℃靜置血液和海馬勻漿液1 h，TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)4 000 r/min離心30 min，分裝，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，使用6100型RT-雷杜酶標(biāo)儀，450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度(A)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出海馬Aβ1-40、海馬LRP1和血清Aβ1-40。

2.7Real-time-PCR法測(cè)定海馬LRP1 mRNA表達(dá)大鼠末次給藥2 h后，麻醉大鼠后處死，冰臺(tái)上迅速取大鼠海馬。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，應(yīng)用Trizol試劑盒提取海馬總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成c DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)計(jì)LRP1引物：上游引物：5’- CCG ACT GGC GAA CAA ATA CAC-3’，下游引物 :5’- ATC GGC TTT GTT GCA CGT G-3’；β-action引物：上游引物:5’- CGT GCG TGA CAT CAA AGA GAA -3’，下游引物：5’- AAC CGC TCG TTG CCA ATA GT-3’。引物由中國(guó)上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系參數(shù)：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物以2-ΔΔCt法表示LRP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

3結(jié)果

3.1APS對(duì)AD大鼠腦海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)的影響對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)比較豐富，可以見(jiàn)到神經(jīng)元雙層核膜，內(nèi)外層核膜較清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富；模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)較少，細(xì)胞器不豐富，神經(jīng)元內(nèi)外層核膜不清楚，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較少；治療組、APS高劑量組、APS中劑量組和APS低劑量組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器不同程度地增加，細(xì)胞器比較豐富，核膜較清晰。

3.2APS對(duì)AD大鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響見(jiàn)表1。

表1　APS對(duì)AD大鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

3.3APS對(duì)AD大鼠海馬Aβ1-40和血清Aβ1-40的影響見(jiàn)表2。

組 別劑量/(g/kg)海馬Aβ1-40/(ng/L)血清Aβ1-40/(ng/L)對(duì)照組 —194.63±58.39 163.86±44.19 模型組 —328.24±54.49#95.41±32.27#治療組 0.5216.08±53.67△156.40±49.13△APS高劑量組0.8220.65±65.89△149.79±42.98△APS中劑量組0.4229.78±53.33△144.14±37.36△APS低劑量組0.2292.93±52.19 101.73±25.93

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

3.4 APS對(duì)AD大鼠海馬LRP1的影響見(jiàn)表3。

表3　APS對(duì)AD大鼠海馬LRP1的影響

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

3.5APS對(duì)AD大鼠海馬LRP1 mRNA含量的影響見(jiàn)表4。

表4　APS對(duì)AD大鼠海馬LRP1 mRNA含量的影響

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

4討論

AD是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一，其病變區(qū)域主要集中在海馬、皮質(zhì)等[17]，而海馬的CA1區(qū)與AD關(guān)系密切，因此主要觀察海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)變化。經(jīng)過(guò)APS治療后，APS組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)較為規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器增加，說(shuō)明海馬神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)得到不同程度地恢復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測(cè)定各組大鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，模型組的大鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)降低，提示模型組大鼠脾和胸腺相對(duì)質(zhì)量減輕，預(yù)示模型組免疫功能降低。經(jīng)過(guò)APS治療后，APS高、中劑量組脾指數(shù)和胸腺指數(shù)升高，說(shuō)明APS可以增加脾和胸腺相對(duì)質(zhì)量，增加機(jī)體的免疫功能。

AD腦內(nèi)Aβ1-40可通過(guò)BBB進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入血液中，Aβ1-40參與影響腦組織和血液的Aβ1-40庫(kù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，模型組小鼠海馬Aβ1-40增加，可促進(jìn)腦組織Aβ1-42成熟，加速腦組織形成SP，同時(shí)血清Aβ1-40降低，提示血清Aβ1-40通過(guò)BBB進(jìn)入腦，進(jìn)一步增加腦Aβ,從而加重AD進(jìn)程。經(jīng)過(guò)APS治療后，APS高、中劑量可將海馬Aβ1-40跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn)到腦外，減少腦組織Aβ1-40，以此治療AD。

為了探尋海馬Aβ1-40與血清Aβ1-40的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)通過(guò)酶聯(lián)免疫及其RT-PCR方法檢測(cè)了與Aβ1-40轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)的LRP1，LRP1促進(jìn)Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)出腦。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明APS高、中劑量可增加海馬LRP1表達(dá)來(lái)下調(diào)海馬Aβ1-40，改善AD海馬CA1區(qū)的超微結(jié)構(gòu)。

綜上所述，APS可改善AD大鼠海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)AD大鼠免疫功能，APS防治AD的機(jī)制與降低海馬LRP1表達(dá)有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1]SUGINO H,WATANABE A,AMADA N,et al.Global trends in alzheimer disease clinical development:increasing the probability of success[J].Clinical Therapeutics,2015,37(8):1632-1642.

[2]張賡,吳金娟,姜淼,等.中醫(yī)藥治療阿爾茨海默病的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014,20(6):217-222.

[3]YANG Ye,WANG Fei,YIN Dengke,et al.Astragulus polysaccharide-loaded fibrous mats promote the restoration of microcirculation in/around skin wounds to accelerate wound healing in a diabetic rat model[J].Colloids and Surfaces B-Biointerfaces,2015,(136):111-118.

[4]SI M W,YANG M K,FU X D.Effect of hypothalamic-pituitary-adrenal axis alterations on glucose and lipid metabolism in diabetic rats[J].Genetics and Molecular Research,2015,14(3):9562-9570.

[5]陳玨曉,王雅芳,李麗,等.黃芪多糖對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2015,31(8):1062-1066.

[6]明海霞,陳彥文,張帆,等.黃芪多糖聯(lián)合順鉑處理降低Lewis肺癌移植瘤CD44表達(dá)并降低血糖Ⅳ型膠原蛋白和透明質(zhì)酸的水平[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2015,31(7):909-913.

[7]MING Haixia,CHEN Yanwen,ZHANG Fan,et al.Astragalus polysaccharides combined with cisplatin decreases the serum levels of CD44 and collagen type IV and hyaluronic acid in mice bearing Lewis lung cancer[J].Xi bao yu Fen zi mian yi xue za zhi,2015,31(7):909-913.

[8]HAO Zhenfeng,SU Youming,LIU Jingyang,et al.Astragalus polysaccharide suppresses excessive collagen accumulation in a murine model of bleomycin-induced scleroderma[J].International Journal of Clinical and Experimental Medicine,2015,8(3):3848-3854.

[9]費(fèi)洪新,高音,孫麗慧,等.黃芪多糖對(duì)阿爾茨海默病小鼠海馬組織的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2015,35(16):4426-4428.

[10]LIU Huiyu,DENG Yuanyuan,GAO Jianmei,et al.Sodium hydrosulfide attenuates Beta-Amyloid-Induced cognitive deficits and neuroinflammation via modulation of MAPK/NF-κB pathway in rats[J].Current Alzheimer Research,2015,12(7):673-683.

[11]YANG Hui,WANG Sulei,YU Linjie,et al.Esculentoside a suppresses Aβ(1-42)-induced neuroinflammation by down-regulating MAPKs pathways in vivo[J].Neurological Research,2015,37(10):859-866.

[12]VOSSEL K A,X U J C,FOMENKO V,et al.Tau reduction prevents Aβ-induced axonal transport deficits by blocking activation of GSK3β[J].The Journal of Cell Biology,2015,209(3):419-433.

[13]費(fèi)洪新,高音,孫麗慧,等.蝙蝠葛酚性堿對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2015,21(7):91-94.

[14]費(fèi)洪新,周忠光,姜波,等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬β淀粉樣前體蛋白的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014,20(20):125-128.

[15]費(fèi)洪新,韓玉生,杜徽,等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)阿爾茨海默病小鼠形態(tài)學(xué)及Aβ水平的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014,20(23):111-114.

[16]費(fèi)洪新,周忠光,劉斌.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)阿爾茨海默病小鼠NF-κBp65蛋白的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2015,35(19):5369-5371.

[17]ROSSI L,MAZZITELLI S,ARCIELLO M,et al.Benefits from Dietary Polyphenols for Brain Aging and Alzheimer's Disease[J].Neurochemical Research,2008,33(12):2390-2400.

Astragalus polysaccharides on ultrastructure and lipoprotein receptor-related protein 1 of hippocampus in Alzheimer's disease rat

JIANG Bo1,FEI Hongxin2,SONG Lei1,YIN Liying1,ZHONG Lili1,ZHANG Yingbo2,LI Baolong1,ZHOU Zhongguang1*

(1.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China；2.Qiqihar Medical University,Qiqihaer 161006,Heilongjiang Province,China)

Abstract：ObjectiveEffects of astragalus polysaccharides (APS) on ultrastructure and lipoprotein receptor-related protein 1(LRP1) of hippocampus in Alzheimer's disease (AD) rat.MethodsWistar rat were randomly divided into control group,model group,treatment group (Piracetam 0.5g/kg),APS high-dose group(APS 0.8 g/kg),APS medium-dose group (APS 0.4 g/kg),APS low-dose group (APS 0.2 g/kg).Aβ1-42was injected into the bilateral hippocampus of rat to induce AD models.The rat were killed after 30 days continuous treating.After the treatment all animals were sacrificed,ultrastructure of hippocampus was observed,calculated the organ coefficients of splenic and thymus.The levels of Aβ1-40and LRP1 in the hippocampus were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The levels of Aβ1-40in the serum were measured by ELISA.The content of LRP1 mRNA in the hippocampus was determined by reverse-transcription PCR (RT-PCR).ResultsCompared with the model group,the APS high-dose group and APS medial-dose group brain maintain normal morphological structure of hippocampus was significantly increased,the organ coefficients of splenic and thymus significantly increased (P<0.05),the levels of Aβ1-40in the hippocampus were significantly decreased (P<0.05),the levels of LRP1 in the hippocampus and the levels of Aβ1-40in the serum were significantly increased (P<0.05).Conclusion APS can maintain normal morphological structure of hippocampus of AD rat,increased LRP1 responses in the hippocampus tissue,organ coefficients of splenic and thymus.

Keywords：Astragalus polysaccharides;Alzheimer's disease;ultrastructure;LRP1

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.03.005

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81373777，81173599);高校博士學(xué)科點(diǎn)科研基金 (博導(dǎo)類(lèi)：20132327110010);黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)博士后基金(LBH-Z14196);黑龍江省青年基金(QC2015101)。

作者簡(jiǎn)介：姜波(1979-)，女，博士，副研究員，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事老年病及中藥新藥研究。

*通信作者：周忠光，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，電話-13514641639，電子信箱-feihongxin2008@163.com

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2095-6258(2016)03-0451-04

(收稿日期:2015-11-11)