王旻晉,王元元,范繼斌

1.四川大學(xué)華西醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科 (成都　610041)； 2.成都醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)系(成都　610083)；3.綿陽市梓潼縣工人醫(yī)院(梓潼　622150)

大黃素抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的研究*

王旻晉1,王元元2△,范繼斌3

1.四川大學(xué)華西醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科 (成都610041)； 2.成都醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)系(成都610083)；3.綿陽市梓潼縣工人醫(yī)院(梓潼622150)

【摘要】目的研究大黃素對結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用及其作用分子機(jī)制。方法通過MTT法確定大黃素有效作用濃度，采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell和基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)檢測大黃素對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。通過免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)檢測EMT事件標(biāo)志性蛋白的變化及上游信號通路的標(biāo)志性蛋白。結(jié)果MTT表明，大黃素對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480有明顯的抑制作用；細(xì)胞劃痕、Transwell和基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)表明，大黃素具有抑制結(jié)腸癌遷移和侵襲的能力；Western blot 結(jié)果表明，大黃素激活N-cadherin，抑制E-cadherin、Vimmentin、β-catenin的表達(dá)，同時抑制惡性基因VEGF、MMP-2、MMP-9的表達(dá)，抑制Akt/mTOR、STAT3 的磷酸化。結(jié)論大黃素通過抑制STAT3、PI3K-AKT信號通路進(jìn)而抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移，為其在臨床上作為治療結(jié)腸癌的輔助藥物或直接作用藥物提供理論依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】結(jié)腸癌；大黃素；轉(zhuǎn)移；信號通路

結(jié)腸癌(colon cancer)是全球最常見的惡性腫瘤之一，位居惡性腫瘤死因的第2位，是我國高發(fā)癌癥之一[1]，其發(fā)生和發(fā)展與日常飲食習(xí)慣密切相關(guān)。結(jié)腸癌的發(fā)生與轉(zhuǎn)移是一個十分復(fù)雜的生物學(xué)過程，很多分子參與其中。目前，結(jié)腸癌的治療手段主要為放、化療和手術(shù)，但放、化療有很多的缺陷[2]。近年來日常飲食中的植物化學(xué)在腫瘤預(yù)防和治療中得到廣泛的認(rèn)可，其化學(xué)成分單獨(dú)或與其他藥物共同起著對腫瘤的治療作用[3]。大黃素作為從大黃根部提取的一種蒽醌類物質(zhì)，在不同腫瘤細(xì)胞及動物模型中表現(xiàn)出抗炎、抗增殖、抗轉(zhuǎn)移等作用[4-6]。研究[7]報道，大黃素能夠抑制結(jié)腸癌、乳腺癌的遷移與浸潤，但其作用分子機(jī)制不明確。本研究以結(jié)腸癌細(xì)胞SW480為研究對象，研究大黃素抑制結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，以探討大黃素的抗腫瘤藥用價值。

1材料與方法

1.1材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480購自上海中科院細(xì)胞庫，于-80 ℃凍存；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco；胎牛血清購于杭州四季青生物公司；大黃素購自上海譜振生物科技有限公司；MTT、Transwell、基質(zhì)膠購自美國Sigma 公司；蛋白質(zhì)預(yù)染Marker購自立陶宛Fermentas公司；Tween-20購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、VEGF、STAT3、p-STAT3、AKT、p-AKT和β-Actin單克隆抗體均購自美國CST公司；PVDF 膜和 ECL 顯影液購于美國Millipore 公司；X 光膠片購于美國Kodak 公司；其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)SW480在含有10% 胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基(含105U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素)中于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2MTT將100 μLSW480細(xì)胞懸液以50 000個/mL的密度接種于96孔板，在CO2孵箱中37 ℃培養(yǎng)孵育過夜。待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度(0、15、30、40、60、75和90 μM)的大黃素100 μL繼續(xù)培養(yǎng)24、48和36 h。每組設(shè)4個復(fù)孔，另設(shè)不含細(xì)胞僅有培養(yǎng)基的空白孔為空白對照孔。藥物處理結(jié)束后，加入MTT(5 mg/mL)試劑20 μL，37 ℃ 5% CO2孵育4 h，以空白孔調(diào)零，酶標(biāo)儀檢測590 nm波長下的吸光值。

1.2.3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)將生長良好的SW480細(xì)胞以6×104個/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，待密度達(dá)到90%以上時，用200 μL的槍頭在6孔板中劃痕，PBS洗2次，加入含大黃素的雙無培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，照相觀察劃痕愈合情況。

1.2.4Transwell、基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[8]方法，將經(jīng)大黃素處理48 h 后的細(xì)胞，PBS洗2次，用無血清培養(yǎng)液重懸。將200 μL細(xì)胞懸液(3×105/mL、4×105/mL)加入上室或含基質(zhì)膠的小室，將含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基540 μL加入24孔板下室，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，取出小室，經(jīng) 4%多聚甲醛固定后，結(jié)晶紫染色，用濕棉簽擦去膜上面未穿過膜的細(xì)胞，自然風(fēng)干后，在顯微鏡下照相，低倍鏡下隨機(jī)選取5個視野計數(shù)。最終以穿膜細(xì)胞的數(shù)目代表體外遷移能力、外侵襲能力。

1.2.5免疫印跡收集經(jīng)藥物處理后的細(xì)胞， 按1×106細(xì)胞濃度加入100 μL細(xì)胞裂解液，渦旋震蕩，冰上放置1 h，將細(xì)胞裂解液 4 ℃ 13 000 rpm/min 離心15 min，取上清液加上樣緩沖液，85 ℃加熱變性10 min，樣品中蛋白經(jīng)BCA試劑盒定量，以確保蛋白上樣量一致。將細(xì)胞總蛋白通過15% SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。分別加入一抗(一抗稀釋比例均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。用TBST 洗膜后，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶5 000)37 ℃ 孵育1 h，TBST 洗滌PVDF膜5次， 每次10 min，加入ECL顯影劑后，通過X光膠片曝光。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1大黃素抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的增殖

使用不同濃度(0、15、 30、 40、60、75和90 μM)的大黃素處理結(jié)腸癌細(xì)胞SW480 24、48和72 h 后，通過 MTT 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力(圖1)。結(jié)果表明，大黃素能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)毒性，顯著抑制細(xì)胞增殖速率，并且抑制程度呈濃度依賴性。

圖1不同濃度大黃素處理SW480細(xì)胞24、48和36 h的細(xì)胞活力

2.2大黃素抑制結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和浸潤

采用45 μM大黃素處理結(jié)腸癌細(xì)胞SW480 48 h。通過劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell和基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)檢測大黃素對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和浸潤能力的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)大黃素處理后的細(xì)胞劃痕處細(xì)胞愈合程度明顯比對照低(圖2)。Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)45 μM大黃素處理后的SW480穿過基底膜的細(xì)胞個數(shù)為(107.30±14.34)，對照組穿過基底膜的細(xì)胞個數(shù)為(216.40±23.12),兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.357,P< 0.001)，表明大黃素抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移能力(圖3)?；|(zhì)膠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)大黃素處理后SW480的浸潤能力明顯降低，穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)為(205.00±17.24)，對照組穿過的細(xì)胞數(shù)為(342.00±24.63),兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.72，P<0.01) (圖4)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，大黃素抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和浸潤能力。

圖2劃痕實(shí)驗(yàn)檢測大黃素對SW480的遷移能力改變

圖3Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測大黃素對SW480遷移能力的影響

圖4基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)檢測大黃素對SW480浸潤能力的影響

2.3大黃素抑制EMT信號通路

將經(jīng)大黃素處理后的結(jié)腸癌細(xì)胞SW480細(xì)胞裂解液進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡檢測EMT相關(guān)基因的表達(dá)情況，western結(jié)果顯示：大黃素促進(jìn)了SW480細(xì)胞胞內(nèi)表皮標(biāo)志性蛋白E-Cadherin的表達(dá)，抑制了間質(zhì)化細(xì)胞標(biāo)志性蛋白N-Cadherin、vimentin的表達(dá)，同時抑制了胞內(nèi)信號傳導(dǎo)分子β-Cantein的表達(dá)(圖5)。以上結(jié)果表明大黃素通過負(fù)調(diào)控EMT事件進(jìn)而抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

圖5免疫印跡檢測EMT相關(guān)標(biāo)志性蛋白

2.4大黃素抑制惡性基因的表達(dá)

結(jié)腸癌細(xì)胞SW480經(jīng)45 μM大黃素處理48 h后，Western結(jié)果顯示：SW480細(xì)胞胞內(nèi)惡性基因MMP-9、MMP-2和VEGF的表達(dá)明顯降低進(jìn)而抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

圖6免疫印跡檢測惡性基因的表達(dá)

2.5大黃素抑制Akt/mTOR和 STAT-3 信號通路

用大黃素處理結(jié)腸癌細(xì)胞SW480 48 h后,進(jìn)行免疫印跡檢測。Western結(jié)果表明，大黃素抑制了AKT(S473)和mTOR(S2448)磷酸化水平，同時胞內(nèi)STAT3(Tyr705)的磷酸化水平降低(圖7)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大黃素抑制了Akt/mTOR 和 STAT-3 信號通路。

圖7免疫印跡分析AKT-mTOR和STAT3

3討論

大黃素是一種傳統(tǒng)中藥，作為具有抗腫瘤作用的蒽醌類藥品，主要用于抗菌、利尿、止咳等治療[9]。1976首次提出大黃素具有抗腫瘤的作用[10]。后續(xù)研究[11-13]表明大黃素對前列腺癌、肺癌、乳腺癌均具有抗增殖作用。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，大黃素對腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，但對正常細(xì)胞或組織沒有明顯的毒性作用。癌癥轉(zhuǎn)移是癌癥治療過程中最為關(guān)鍵的因素[14]。大量文獻(xiàn)[15-16]報道，大黃素通過阻斷細(xì)胞周期和促凋亡進(jìn)而抑制多種癌細(xì)胞。研究[17]表明，大黃素具有抗轉(zhuǎn)移和浸潤的作用。EMT是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程，表現(xiàn)為上皮標(biāo)志蛋白E-Cadherin表達(dá)降低，間質(zhì)化標(biāo)志蛋白N-Cadherin和Vimentin表達(dá)上調(diào)[18]。在本研究中，大黃素抑制了EMT過程的發(fā)生，表現(xiàn)為E-Cadherin高表達(dá)，而N-Cadherin和Vimentin低表達(dá)。

隨著研究的深入，EMT過程的發(fā)生受越來越多分子共同調(diào)控。文獻(xiàn)[19]報道，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPS)在癌癥細(xì)胞中調(diào)控EMT時間的發(fā)生。本研究檢測了其中兩個基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9。經(jīng)大黃素處理后，MMP-2、MMP-9表達(dá)明顯被抑制。進(jìn)而檢測調(diào)控該基質(zhì)金屬蛋白酶的上游Akt/mTOR 和 STAT-3 信號通路，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Akt/mTOR 和 STAT-3的磷酸化水平明顯降低。血管生成是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中一個標(biāo)志性事件，腫瘤細(xì)胞通過釋放VEGF調(diào)控胞外基質(zhì)進(jìn)而激活下游信號促進(jìn)腫瘤的惡化和癌癥轉(zhuǎn)移[20]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大黃素能夠顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW480胞內(nèi)VEGF的表達(dá)。因此可推斷出大黃素通過抑制Akt/mTOR 和 STAT-3 信號通路、調(diào)控MMP-2、MMP-9 酶活性和抑制VEGF的表達(dá)進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果解釋了大黃素抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，為其作為抗腫瘤藥物提供了理論基礎(chǔ)。研究表明，大黃素通過多個作用靶點(diǎn)影響多種癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移和增殖，但其作用機(jī)制不同[21-23]，說明藥物作用的直接靶點(diǎn)還不明確。筆者將在后續(xù)的研究中采用藥物蛋白組學(xué)的方法對其藥物直接作用靶點(diǎn)進(jìn)一步驗(yàn)證與研究，為其在臨床上更為廣泛地運(yùn)用提供理論基礎(chǔ)。

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Emodin′s Suppression on Metastasis of Colorectal Cancer

WangMinjin1,WangYuanyuan2△,FanJibin3.

1.DepartmentofLaboratoryMedicine,WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China; 2.SchoolofBiomedicalSciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China; 3.ZitongWorkers′HospitalinMianyang,Zitong622150,China

【Abstract】ObjectiveTo study the suppression and its underlying molecular mechanism of emodin on the. MethodsMTT method was used to identify the effective working concentration of emodin. Scarification, Transwell and Matrigel assays were used to measure the influence of emodin on the metastasis of colorectal cancer cells. Western blot was used to detect the expression of proteins involved in EMT and marker proteins in upstream signaling pathway. Results MTT assay demonstrated that emodin significantly inhibited the proliferation of SW480. Scarification, Transwell and Matrigel assays showed that emodin suppressed the metastasis and invasion of colorectal cancer. Western blot showed that emodin promoted the expression of N-cadherin while inhibited the expression of E-cadherin, Vimmentin and β-catenin. Meanwhile, emodin decreased the expression levels of VEGF, MMP-2, MMP-9 and the phosphorylation of Akt/mTOR and STAT3. ConclusionEmodin suppressed STAT3 and Akt/mTOR signaling pathway, which further inhibited the metastasis of colorectal cancer. This study provides theoretical evidence that emodin functions as adjunct or direct drugs that targeting at colorectal cancer cells.

【Key words】Colorectal cancer; Emodin; Metastasis; Signal pathway

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.01.004

*基金項(xiàng)目：四川省教育廳基金項(xiàng)目(No:13ZB0225)；四川省衛(wèi)生廳基金項(xiàng)目(No:130303)

通信作者：△王元元， E-mail：vicky6936vicky@126.com

【中圖分類號】R735.35

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160301.0944.006.html

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