張 洪， 何建昇， 康 樂， 劉慧平

(1. 山西省分析科學(xué)研究院，山西太原 030006；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801)

氯吡嘧磺隆對斑馬魚肝臟抗氧化酶·ATP酶和AchE酶活性的影響

張 洪1，2， 何建昇1， 康 樂1， 劉慧平2

(1. 山西省分析科學(xué)研究院，山西太原 030006；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801)

摘要[目的]研究氯吡嘧磺隆對斑馬魚肝臟中抗氧化酶、ATP酶和AchE酶活性的影響。[方法]通過化學(xué)品半靜態(tài)式魚類靜態(tài)試驗研究斑馬魚肝臟中CAT、SOD、GSTs、Na+K+、Ca2+Mg2+-ATPase、AchE酶的活性和MDA含量。[結(jié)果]在低濃度處理中,氯吡嘧磺隆對CAT、SOD和GSTs起到誘導(dǎo)作用；高濃度組中氯吡嘧磺隆對CAT、SOD、GSTs、ATPase、AchE酶均起到抑制作用。[結(jié)論]亞致死劑量氯吡嘧磺隆會對斑馬魚肝臟造成損傷。

關(guān)鍵詞氯吡嘧磺隆；致死中濃度；抗氧化酶；ATP酶；AchE酶

農(nóng)藥的大量使用對水環(huán)境的污染問題已經(jīng)越來越受到關(guān)注。水體中的農(nóng)藥污染不僅危及水生生物安全，可能引起生物富集，而且通過食物鏈最終傳遞給人類，并造成一定潛在的風(fēng)險。因此，應(yīng)加強(qiáng)農(nóng)藥對水生生物的毒理學(xué)評價，用以指導(dǎo)農(nóng)藥的合理使用。氯吡嘧磺隆商品名為草枯星，具有高效、廣譜、低毒等優(yōu)點，被廣泛用于防治禾本科雜草和闊葉雜草等[1-2]。由于氯吡嘧磺隆在水中具有較高的溶解度(0.015 g/L)，因此會在水中遷徙，易引起水域污染，而目前國內(nèi)研究很少涉及該藥對非靶標(biāo)生物的毒理學(xué)研究[3-4]。筆者以水生生物斑馬魚為實驗動物，研究了氯吡嘧磺隆對斑馬魚代謝酶和抗氧化酶的影響，評價該化合物的安全性，探討其致毒機(jī)理，旨在為其合理使用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1實驗動物。斑馬魚(Barchydaniorerio),購買于山西省太原市花鳥魚蟲市場，馴養(yǎng)14 d，自然死亡率低于5%時開始試驗。

1.1.2試劑與儀器。過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、丙二醛(MDA)、ATP酶(Na+K+、Ca2+Mg2+-ATPase)、AchE酶，均購自南京建成生物工程研究所；試驗儀器有752分光光度計(上海舜宇恒平)、高速離心機(jī)、水浴箱等。

1.2試驗方法

1.2.1斑馬魚毒性試驗。在體積為10 L的魚缸內(nèi)加入斑馬魚20條，魚缸中的水為脫去氯氣的自來水，pH為7，總硬度為268 mg/kg,水中溶解氧含量為7.8 mg/kg,控制室內(nèi)溫度在25 ℃。試驗共采用10 L魚缸2個，斑馬魚40條。試驗采用半靜態(tài)水生物測試法，每24 h更換1次農(nóng)藥藥液，觀察96 h內(nèi)斑馬魚的死亡情況，采用概率分析法計算供試農(nóng)藥對斑馬魚的LC50值。

1.2.2亞致死劑量毒性試驗。參照急性毒性試驗的方法，以急性毒性試驗測定的LC50值的1/10連續(xù)處理96 h。

1.2.3樣品的制備。取斑馬魚肝臟組織，加入液氮研磨粉碎，然后加入生理鹽水，8 000 r/min離心10 min，取上清液檢測酶活性。

1.2.4酶活性和MDA含量的測定。①CAT活性。通過加入鉬酸銨而迅速中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生1種淡黃色的絡(luò)合物，在405 nm處測定其生成量，計算出CAT的活性。②SOD活性。根據(jù)試劑盒說明書采用羥胺法測定，其原理為超氧陰離子自由基的最終產(chǎn)物在對氨基苯磺酸及甲萘胺的作用下呈現(xiàn)紫紅色，在530 nm處測定。③GST活性。根據(jù)動物體內(nèi)源谷胱甘肽于化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的親電化合物或代謝產(chǎn)物結(jié)合反應(yīng)，生成2，4-二硝基苯-谷胱甘肽復(fù)合物于340 nm處測定采用比色法測定。④MDA含量。根據(jù)通過硫代巴比妥酸需氧條件下孵育后產(chǎn)生粉紅色反應(yīng)，在530 nm處測定。⑤ATPase活性。根據(jù)ATP酶分解成ADP和無機(jī)磷，通過測定無機(jī)磷的含量，于660 nm處測定ATP酶活性。⑥AchE酶活性。根據(jù)水解乙酰膽堿生成膽堿及乙酸，膽堿與巰基顯色劑反應(yīng)生成對稱三硝基苯黃色化合物，根據(jù)顏色深淺于412 nm下進(jìn)行比色定量，通過水解產(chǎn)物膽堿的數(shù)量計算膽堿酯酶的活性。

1.2.5數(shù)據(jù)處理。使用SPSS統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計與分析。

2結(jié)果與分析

2.1斑馬魚毒性試驗結(jié)果通過斑馬魚毒性試驗，測得氯吡嘧磺隆對斑馬魚的LC50(96 h)值為21.7 mg/L，根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》[5]的評價標(biāo)準(zhǔn)，氯吡嘧磺隆對斑馬魚的毒性屬于低毒，氯吡嘧磺隆的亞致死劑量濃度設(shè)為2.17 mg/L。

2.2氯吡嘧磺隆對斑馬魚肝臟中抗氧化酶活性的影響從圖1可以看出，在低劑量農(nóng)藥暴露下，與對照組相比斑馬魚肝臟中CAT、SOD和GST的活性均顯著增加，而在高劑量濃度暴露下這3種酶活性顯著下降。為了防御活性氧自由基的損傷和破壞，組織和細(xì)胞中建立形成了一整套完善的抗氧化防御系統(tǒng)，如CAT、SOD、GST。該試驗中在低濃度氯吡嘧磺隆處理組中，抗氧化酶活性增加說明整個機(jī)體過氧化物增多，自由基在機(jī)體內(nèi)積累，機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，為了減輕肝臟損傷，其抗氧化酶活性增強(qiáng)。隨著處理組的氯吡嘧磺隆濃度增大，過氧化物和自由基大量積累，肝臟細(xì)胞造成不可逆的損傷，抗氧化酶活力受到顯著抑制。MDA是脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)物，其含量直接反映了細(xì)胞氧化損傷程度。MDA含量在低劑量氯吡嘧磺隆暴露下顯著增加，在高劑量氯吡嘧磺隆的暴露下較對照組和低劑量組MDA含量增加。

圖1　氯吡嘧磺隆對斑馬魚肝臟中抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響Fig.1　Effects of Halosulfuron-methy on antioxidant enzyme activity and MDA content in zebra fish liver

2.3氯吡嘧磺隆對斑馬魚肝臟中Na+K+、Ca2+Mg2+-ATPase活性的影響從圖2可以看出，在低劑量氯吡嘧磺隆暴露下斑馬魚的Na+K+、Ca2+Mg2+-ATPase活性顯著下降，在高劑量氯吡嘧磺隆暴露下Na+K+、Ca2+Mg2+-ATPase活性較對照組和低劑量組下降得更多。經(jīng)推測，可能是由于氯吡嘧磺隆首先對斑馬魚機(jī)體肝臟組織造成氧化損傷，進(jìn)而改變了ATP酶蛋白的構(gòu)象和功能，使得酶活性下降。

圖2　氯吡嘧磺隆對斑馬魚肝臟中Na+K+、Ca2+Mg2+-ATPase活性的影響Fig.2　Effects of Halosulfuron-methy on Na+K+, Ca2+Mg2+-ATPase activity in zebra fish liver

2.4氯吡嘧磺隆對斑馬魚肝臟中乙酰膽堿酯酶(AchE)活性的影響從圖3可以看出，在低劑量氯吡嘧磺隆暴露下斑馬魚的AchE酶活性并無顯著下降，但是在高劑量氯吡嘧磺隆暴露下AchE酶活性較對照組和低劑量組下降顯著。推測其原因可能是由于氯吡嘧磺隆首先對斑馬魚機(jī)體肝臟組織造成氧化損傷，肝臟的防御體系被外源毒物破壞，致使器官的功能受到抑制，使得酶活性下降。乙酰膽堿酯酶主要功能是將乙酰膽堿水解為乙酸和膽堿，維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常生理功能，其活性是衡量生物生理活動的重要指標(biāo)之一[6]。因此，即使氯吡嘧磺隆非神經(jīng)性毒物，筆者研究了乙酰膽堿酯酶的活性。

圖3　氯吡嘧磺隆對斑馬魚肝臟中AchE活性的影響Fig.3　Effects of Halosulfuron-methy on ache activity in zebra fish liver

3討論與結(jié)論

胡傳祿等[7]研究了磺酰脲類除草劑芐嘧磺隆對斑馬魚胚胎的影響，結(jié)果表明MDA含量隨著染毒濃度的升高而增加。張彬彬[8]研究了苯磺隆對鯽魚肝臟的影響，結(jié)果表明苯磺隆對GSTs和SOD活力具有誘導(dǎo)作用。

筆者采用半靜態(tài)水生物測試法測得氯吡嘧磺隆對斑馬魚96 hLC50為21.7 mg/L，農(nóng)藥毒性為低毒，對水生生物較為安全。在致死中濃度暴露下，斑馬魚肝臟中抗氧化酶和ATP酶活性顯著下降；在亞致死劑量濃度下，斑馬魚肝臟中抗氧化酶活性升高，機(jī)體應(yīng)激水平增強(qiáng)，但ATP酶和AchE酶活性降低，表明對斑馬魚肝臟仍然造成了一定的損傷。

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[8] 張彬彬．苯磺隆對肝臟谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶和超氧化物歧化酶的影響[J].濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012,35(4):255-257.

Effect of Halosulfuron-methy on the Antioxidant Enzyme, ATPase and AchE Activities of Zebra Fish Liver

ZHANG Hong1,2, HE Jian-sheng1, KANG Le1et al

(1. Shanxi Academy of Analytical Science, Taiyuan, Shanxi 030006; 2. College of Agriculture, Shanxi Agricultural University,Taigu, Shanxi 030801)

Abstract[Objective] The aim was to study effects of Halosulfuron-methy on the activity of antioxidant enzyme, ATPase, Ache enzyme in zebra fish liver. [Method] By chemicals-semi-static fish test, CAT, SOD, GSTs, MDA and Na+K+, Ca2+Mg2+-ATPase, AchE enzym activities and MDA content in zebra fish liver were studied. [Result] Under lower concentration treatment, halosulfuron-methy induced CAT, SOD, GSTs in zebra fish liver. CAT, SOD, GSTs, ATPase, AchE enzyme were restrained with higher concentration of halosulfuron-methy. [Conclusion] Zebra fish’s liver is injured by sublethal dose of halosulfuron-methy.

Key wordsHalosulfuron-methy; LC50; Antioxidant enzyme; ATPase; AchE enzyme

基金項目山西省科技基礎(chǔ)條件平臺建設(shè)項目(2014091003-0102)；山西省財政支持農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項目(SCZZNCGZH201304， SCZZNCGZH201403)；山西省國際科技合作項目(2014081049-1)。

作者簡介張洪(1980- )，男，山西太原人，工程師，博士，從事農(nóng)藥殘留與環(huán)境毒理研究。

收稿日期2016-03-21

中圖分類號S 912

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)11-113-02