唐　菁，曲麗梅，曹維斌，李篤軍△

(山東省煙臺業(yè)達醫(yī)院：1.檢驗科；2.血液腫瘤科，山東煙臺 264006)

·論著·

非甾體類抗炎藥阿司匹林、吲哚美辛對胃癌MGC803細胞的抑制作用研究

唐菁1，曲麗梅1，曹維斌2，李篤軍1△

(山東省煙臺業(yè)達醫(yī)院：1.檢驗科；2.血液腫瘤科，山東煙臺 264006)

摘要:目的探討非甾體類抗炎藥阿司匹林(ASP)、吲哚美辛(Indo)促進胃癌MGC803細胞凋亡、抑制增殖的作用和機制。方法細胞增殖檢測(MTT)法檢測ASP、Indo對MGC803細胞增殖的影響；流式細胞技術(shù)檢測ASP、Indo對MGC803細胞凋亡的影響；細胞免疫化學方法檢測ASP、Indo對MGC803細胞表達C反應蛋白(CRP)、白細胞介素-6(IL-6)的影響。結(jié)果與對照組相比，ASP、Indo對MGC803細胞具有明顯的增殖抑制作用及促進MGC803細胞凋亡的作用；MGC803細胞高表達CRP、IL-6，ASP、Indo能下調(diào)MGC803細胞CRP、IL-6的表達水平。結(jié)論非甾體類抗炎藥ASP、Indo對胃癌MGC803細胞具有抑制增殖、誘導凋亡的作用，并能下調(diào)MGC803細胞中CRP、IL-6的表達。

關(guān)鍵詞:阿司匹林；吲哚美辛；腫瘤細胞增殖；CRP；IL-6

多年來，在應用手術(shù)、放化療及生物治療等方法治療腫瘤的同時，科學研究也在不斷地開發(fā)新的抗腫瘤藥物。阿司匹林(ASP)、吲哚美辛(Indo)是常用的非甾體類抗炎藥(NSAIDs)，流行病學研究發(fā)現(xiàn)，長期規(guī)律的服用NSAIDs可以明顯降低腫瘤的發(fā)生及延緩腫瘤的發(fā)展[1-2]。并且，研究發(fā)現(xiàn)，NSAIDs的抑癌機制可以分為環(huán)氧化酶-2(COX-2)依賴型和非環(huán)氧化酶-2依賴型[3]。C反應蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)作為炎性細胞因子，可通過自分泌、旁分泌或相關(guān)聯(lián)動效應來促進腫瘤生長及轉(zhuǎn)移[4-5]。本研究通過觀察ASP、Indo對胃癌細胞株MGC803增殖、凋亡的影響，同時檢測CRP、IL-6的表達變化，為臨床應用NSAIDs在胃癌方面的治療提供理論和實驗依據(jù)。

1資料與方法

1.1細胞株與主要試劑人胃癌細胞株MGC803由濱州醫(yī)學院中心實驗室提供。ASP、Indo購自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。細胞培養(yǎng)基(DMEM)、胰蛋白酶為Gibco公司產(chǎn)品，青霉素、鏈霉素購自山東魯抗制藥公司。MTT系Promega公司產(chǎn)品。PI試劑盒購自美國Sigma公司產(chǎn)品，Rabbit Anti-CRP單克隆抗體及Rabbit Anti-IL-6單克隆抗體，均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。DAB顯色試劑盒系北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2MTT法檢測ASP、Indo對MGC803細胞增殖的影響[6]取對數(shù)生長期的MGC803細胞(5×104/mL)，接種于96孔板，37 ℃、5%CO2孵箱孵育過夜后，實驗組細胞分別加入不同濃度的ASP、Indo，作用終質(zhì)量濃度分別為ASP 2、4、8、10 mmol/L；Indo 200、400、800、1 000 μmol/L；對照組加10%小牛血清DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，終止培養(yǎng)前4 h加入MTT(5 mg/mL)，4 h后置酶標儀下測定光密度(OD)值，以570 nm為檢測波長，630 nm為參考波長，以570～630 nm計算OD值。

1.3PI染色流式細胞術(shù)檢測MGC803細胞凋亡[7]取對數(shù)生長期的MGC803細胞(5×104/mL)，實驗設(shè)空白對照組、8 mmol/L ASP組、800 μmol/L Indo組共3個組別，每組各6瓶細胞，孵箱內(nèi)細胞培育48 h后終止培養(yǎng)，以0.25%的胰酶消化后，每組分別制成單細胞懸液，各收集細胞數(shù)目約(1～5)×106個，500～1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液；3 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次，離心去PBS；加入冰預冷的70%乙醇固定，4 ℃，過夜；離心棄去固定液，3 mL PBS重懸5 min；400目的篩網(wǎng)過濾1次，500～1 000 r/min離心5 min，棄去PBS；用1 mL PI染液染色，4 ℃避光30 min；流式細胞儀檢測：PI用氬離子激發(fā)熒光，激光光波波長為488 nm，發(fā)射光波波長大于630 nm，產(chǎn)生紅色熒光分析PI熒光強度的直方圖，也可分析前散射光對側(cè)散射光的散點圖。

1.4免疫細胞化學檢測MGC803細胞中CRP、IL-6表達變化[8]取對數(shù)生長期的MGC803細胞(1×105/mL)，接種于放有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板，2 mL/孔，實驗設(shè)空白對照組、8 mmol/L ASP組、800 μmol/L Indo組共3個組別，每組設(shè)3個復孔，孵箱內(nèi)細胞培育48 h后終止培養(yǎng)。取出細胞玻片，PBS洗5 min，洗3次，4%多聚甲醛固定，4 ℃，過夜，蒸餾水洗5 min，洗3次，按文獻[9]滅活內(nèi)源性過氧化物酶和免疫細胞化學染色，用Leica DM 4000B顯微鏡拍照，并通過Leica QwinV3分析軟件進行染色結(jié)果的灰度值掃描分析，蛋白表達強弱與灰度值成反比。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析，分析方法包括t檢驗、χ2檢驗和Pearson線性相關(guān)分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1ASP、Indo對MGC803細胞增殖的影響結(jié)果顯示，不同濃度的ASP、Indo作用于MGC803細胞48 h后，對MGC803細胞具有增殖抑制作用，其中ASP 4、8、10 mmol/L,Indo 400、800、1 000 μmol/L組與未用藥對照組相比增殖抑制作用明顯，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1。

2.2ASP、Indo對MGC803細胞凋亡的影響流式細胞儀分析結(jié)果顯示，MGC803細胞經(jīng)8 mmol/L ASP、800 μmol/L Indo用藥48 h后均出現(xiàn)了明顯的凋亡，各實驗組的凋亡率分別為(31.9±3.21)%和(29.0±3.01)%，與對照組的(9.3±0.45)%比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

A:ASP 對MGC803細胞增殖的影響;B:Indo對MGC803細胞增殖的影響。

圖1ASP、Indo對MGC803細胞增殖的影響

2.3ASP、Indo處理后MGC803細胞中CRP、IL-6的表達變化免疫細胞化學染色結(jié)果顯示，在兩組圖的對照組細胞胞質(zhì)中可見大量的棕黃色顆粒，提示CRP、IL-6蛋白在MGC803細胞中表達為強陽性。MGC803細胞經(jīng)8 mmol/L ASP、800 μmol/L Indo用藥48 h后，與未用藥對照組相比，細胞質(zhì)褐色的CRP、IL-6蛋白的表達明顯下降，并且病理圖像分析結(jié)果顯示，8 mmol/L ASP、800 μmol/L Indo藥物處理后CRP表達灰度值分別為179±8.5、190±7.6；IL-6表達灰度值分別為165±2.4、184±3.4，均高于各自對照組的86±4.3和95±5.0，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

A:流式細胞術(shù)分析對照組MGC803細胞凋亡;B:流式細胞術(shù)分析8 mmol/L ASP誘導的MGC803細胞凋亡C:流式細胞術(shù)分析800 μmol/L Indo誘導的MGC803細胞凋亡。

圖2ASP、Indo對MGC803細胞凋亡的影響

A:免疫細胞化學分析8 mmol/L ASP、800 μmol/L Indo作用后的CRP的表達B:免疫細胞化學分析8 mmol/L ASP、800 μmol/L Indo作用后的IL-6的表達。

圖3ASP、Indo處理后MGC803細胞中CRP、IL-6的表達變化

3討論

癌癥盡管在早期診斷和防治方面取得很大成績，但目前仍是人類亟待解決的難題之一。近年的流行病學、臨床和實驗研究證實，長期服用臨床常用于解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎的NSAIDs如ASP、Indo等，與多種腫瘤的發(fā)生呈負相關(guān)，可以顯著降低乳腺、肺、前列腺、膀胱、卵巢、食道和胃及部位腫瘤發(fā)病率[3]。Waddell等[9]于1983年最早報道了NSAIDs與腫瘤的發(fā)生具有量效關(guān)系，長期服用NSAIDs可以明顯減少家族性腺瘤樣息肉(FAP)患者的息肉數(shù)量。并且后來的隨機臨床試驗也證實了每天服用劑量300～400 mg的蘇靈大(蘇靈大屬于NSAIDs，結(jié)構(gòu)同吲哚美辛)4～6個月，可以降低FAP患者腺瘤數(shù)量的70%[10]。

除臨床研究以外，還有大量的實驗動物模型和體外的試驗研究證明NSAIDs具有明顯抑癌作用。Pollard等[11]報道，Indo在致癌物質(zhì)誘導的結(jié)腸癌動物模型中具有一定的抑癌活性。隨后的試驗研究也證實了不同種類的NSAIDs對結(jié)腸癌的不同程度的抑癌作用[12]。孫振華[13]在體外試驗中發(fā)現(xiàn)，ASP能夠抑制原癌基因ErbB2的表達，進而抑制其下游細胞生存相關(guān)的信號通路，從而誘導了宮頸癌細胞系HeLa細胞凋亡。Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)，ASP能夠通過抑制Mcl-1的表達來增強細胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2高親和力靶向抑制劑ABT-263介導的抗腫瘤作用，從而對肝癌細胞起到誘導凋亡的作用。孫振海[7]研究結(jié)果顯示，NSAIDs塞來布昔可以通過抑制結(jié)腸癌細胞SW480中BiP蛋白的表達，從而起到促進腫瘤細胞凋亡的作用。董兆如[15]的研究顯示，低濃度ASP(1 mmol/L)聯(lián)合干擾素α(IFN-α)較單獨作用于肝癌細胞時，凋亡數(shù)量明顯增加，提示低濃度ASP協(xié)同IFN-α誘導肝癌細胞凋亡有較好的效果。本課題以胃癌細胞株MGC803細胞為靶細胞，將4、8、10 mmol/L ASP與400、800、1 000 μmol/L Indo作用于MGC803細胞48 h后，發(fā)現(xiàn)其對MGC803細胞具有明顯的增殖抑制作用。并且研究還發(fā)現(xiàn)，8 mmol/L ASP、800 μmol/L Indo用藥48 h后，細胞凋亡明顯增加。

IL-6原稱B細胞刺激因子2、B細胞分化因子、IFN-β2、雜交瘤/漿細胞瘤生長因子、26×103蛋白、肝細胞刺激因子等。產(chǎn)生IL-6的細胞主要有單核/巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、角質(zhì)細胞及T細胞(主要是Th2)等，此外還包括骨髓瘤細胞株、宮頸癌細胞株等。IL-6的生物學活性，除了在細胞因子網(wǎng)絡(luò)中可發(fā)揮多種效應，如免疫調(diào)節(jié)、刺激造血、防御作用、急性期反應等外，還具有促進腫瘤生長的作用。如IL-6合成增加與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生有關(guān)，IL-6在體外可促進漿細胞瘤和骨髓瘤細胞的生長。某些腫瘤可高表達IL-6，使細胞增殖失控，對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起重要作用[16]。研究證明，部分肺癌細胞系可以產(chǎn)生IL-6，作為自分泌、旁分泌的生長因子，促進腫瘤生長及向周圍組織侵襲。并且白血病、腎癌、骨髓瘤等多種腫瘤細胞生長也均依賴于IL-6的自分泌能力[5,17]。CRP是一種急性時相反應蛋白，作為炎癥和急性組織損傷的非特異標志物廣泛應用于臨床。近幾年臨床研究顯示，許多胃腸、肝膽、胰腺癌患者的血清CRP水平會升高[18]。并有研究顯示，CRP聯(lián)合CEA、CA724對胃癌的早期診斷和病情判斷也有一定的臨床應用價值，但CRP在胃癌細胞中的表達水平及作用機制還有待進一步研究[19]。因此，本實驗將CRP、IL-6作為研究的靶因子，免疫細胞化學發(fā)現(xiàn)CRP、IL-6在胃癌MGC803細胞中呈高表達狀態(tài)，并且與空白對照組相比，8 mmol/L ASP、800 μmol/L Indo用藥48 h后， MGC803細胞中CRP、IL-6的表達明顯下降，說明 ASP、Indo對胃癌MGC803細胞的增殖抑制、誘導凋亡的作用機制可能與其抑制細胞中CRP、IL-6的產(chǎn)生有關(guān)。

先前針對NSAIDs的抑癌機制大都集中于其能抑制具有誘導炎癥反應和致癌變作用的COX-2的表達有關(guān)，本課題將具有促進腫瘤細胞生長的CRP、IL-6作為研究靶分子，發(fā)現(xiàn)NSAIDs ASP、Indo抑制胃癌細胞增殖、誘導凋亡的可能作用機制與其抑制細胞中CRP、IL-6的產(chǎn)生有關(guān)，從而為臨床應用NSAIDS的抗癌治療提供了一定試驗基礎(chǔ)。

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Experimental study of the inhibition mechanism of ASP and Indo on human gastric carcinoma cell line MGC803

TangJing1,QuLimei1,CaoWeibin2,LiDujun1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofHematology,YantaiYedaHospital，Yantai,Shandong264006，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the effect of ASP and Indo inducing the apoptosis and inhibiting the proliferation of human gastric carcinoma MGC803 cell in vitro and its mechanism.MethodsInhibition rate was tested by MTT method;apoptosis induced by ASP and Indo in MGC803 cells was investigated by applying flow cytometry analysis techniques;the expression of CRP and IL-6 was analyzed by immunocytochemistry(ICC) analysis.ResultsCompared with the control,ASP and Indo significantly inhibited the proliferation and induced apoptosis of MGC803 cells;CRP and IL-6 were strongly expressed on MGC803 cells,and ASP and Indo down-regulated the expression levels of CRP and IL-6.ConclusionNSAIDs ASP and Indo can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of MGC803 cells,and can down-regulating the expression of CRP and IL-6.

Key words:ASP;Indo;tumor cell proliferation;CRP;IL-6

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.10.016

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)10-1341-03

(收稿日期：2015-12-01)

作者簡介：柴曉文，男，副主任技師，主要從事臨床免疫方向的研究。