阿力瑪，朱和平，王瑞瑤，閆濤，蘇小虎，李璐，王丙萍，那順溫都樂，齊貴春，周歡敏內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院 內(nèi)蒙古自治區(qū)生物制造重點實驗室，內(nèi)蒙古　呼和浩特　010018

?

無標記轉(zhuǎn)Fat-1基因真核表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因綿羊細胞系的建立

阿力瑪*，朱和平*，王瑞瑤，閆濤，蘇小虎，李璐，王丙萍，那順溫都樂，齊貴春，周歡敏
內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院 內(nèi)蒙古自治區(qū)生物制造重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特010018

阿力瑪, 朱和平, 王瑞瑤, 等. 無標記轉(zhuǎn)Fat-1基因真核表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因綿羊細胞系的建立. 生物工程學報, 2016, 32(2): 212–221.

A LM, Zhu HP, Wang RY, et al. Construction of Fat-1 eukaryotic expression vector of excision markers and the establishment of transgenic sheep cell lines. Chin J Biotech, 2016, 32(2): 212–221.

摘 要:為了建立無篩選標記基因的轉(zhuǎn)Fat-1基因綿羊細胞系，本研究將PCR克隆得到的Fat-1基因，合成的attB、Loxp序列并克隆入pN1-EGFP框架載體，得到可刪除篩選標記基因的pEGFP-N1-Fat-1真核表達載體。體外轉(zhuǎn)錄合成phiC31整合酶mRNA并與線性化的pEGFP-N1-Fat-1載體共轉(zhuǎn)染綿羊胎兒皮膚成纖維細胞，G418篩選得到表達綠色熒光的單克隆，再利用pET-28a-His-NLS-TAT-Cre質(zhì)粒誘導Cre重組蛋白表達，將純化后的Cre穿膜肽轉(zhuǎn)導表達綠色熒光的單克隆細胞，將熒光淬滅的細胞系擴繁，提取基因組DNA，進行PCR及測序鑒定，得到無標記轉(zhuǎn)Fat-1基因綿羊胎兒皮膚成纖維細胞系，為生產(chǎn)無篩選標記基因的轉(zhuǎn)基因綿羊奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:Fat-1基因，真核表達載體，篩選標記，phiC31整合酶

Received: March 27, 2015; Accepted: November 19, 2015 Supported by: Biological High-tech Project of Inner Mongolia (No. 20030301).

*These authors contributed equally to this study.

內(nèi)蒙古生物高科技項目 (No. 20030301) 資助。

1997年Spychalla等首次從秀麗隱桿線蟲的基因組中獲得Fat-1基因，并得到了Fat-1基因的cDNA序列，其翻譯產(chǎn)物是ω-3多聚不飽和脂肪酸脫氫酶 (ω-3 desaturase)，由402個氨基酸組成[1]。ω-3多聚不飽和脂肪酸脫氫酶以ω-6多聚不飽和脂肪酸為優(yōu)先底物，使其脫氫并轉(zhuǎn)化為ω-3多聚不飽和脂肪酸 (ω-3 polyunsaturated fatty acids)[2]。ω-3多聚不飽和脂肪酸為人體必需脂肪酸，具有重要的生理功能。ω-3和ω-6 PUFAS與人體健康密切相關(guān)，有研究表明ω-6/ω-3 PUFAS的比例對于維持細胞正常生長和穩(wěn)態(tài)起著關(guān)鍵的作用。大量的流行病學資料顯示，飲食中ω-6/ω-3 PUFAS比例過高，會導致機體功能障礙，引發(fā)心腦血管疾病、癌癥、精神性疾病等一系列疾病的發(fā)生。但是哺乳動物自身不能合成ω-3 PUFAS，只能從深海魚類、植物油等少數(shù)種類的外源食物中獲得，隨著生活水平的提高，如何補充ω-3 PUFAs已經(jīng)成為人類研究的熱點。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日趨成熟使利用Fat-1轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)富含ω-3 PUFAs的農(nóng)副產(chǎn)品，如肉制品、蛋和奶等成為可能[3]，這對于提高人類身體素質(zhì)有著積極的影響，也必將會帶來可觀的經(jīng)濟效益。為此，在動物中轉(zhuǎn)入Fat-1基因使其在動物體內(nèi)表達具有重要的研究價值[4]。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是研究基因功能最為常用和有效的方法之一[5]，轉(zhuǎn)基因技術(shù)介導外源DNA整合入宿主染色體基因組上以實現(xiàn)基因敲除 (Knock out)、基因敲入 (Knock in) 等[6]。Cre-Loxp是目前研究最為深入的位點特異性重組系統(tǒng)。Cre-Loxp系統(tǒng)介導的重組廣泛應(yīng)用于哺乳動物的遺傳修飾，Cre重組酶能夠?qū)Ｒ恍缘刈R別由34個堿基對的特異Loxp序列，使2個loxP之間的DNA序列發(fā)生重組[7]。如果2個Loxp位點位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除2個Loxp位點間的序列[8]。整合的DNA多數(shù)為單拷貝外源基因，而且目的基因為定點整合。Cre-Loxp系統(tǒng)包括3種重組結(jié)果，這是由于Loxp位點的排列方式不同造成的：1) 2個Loxp位點在同一條DNA鏈上，方向相反，Cre重組酶會使2個Loxp位點間的基因序列發(fā)生倒位；2) 2個Loxp位點分別位于不同的DNA鏈或染色體上，Cre重組酶會使兩條鏈間發(fā)生交換或者使染色體發(fā)生易位；3) 如果2個Loxp位點位于同一條DNA鏈上，方向相同，Cre重組酶就會有效切除2個Loxp位點間的序列[9]。近年來，Cre-Loxp系統(tǒng)被應(yīng)用于小鼠、果蠅、斑馬魚、擬南芥、水稻等多種高等真核生物的遺傳改造，實現(xiàn)外源基因在宿主染色體的定點整合或敲除、選擇標記基因的刪除[10]。

PhiC31整合酶來源于鏈霉菌噬菌體，是位點特異性重組酶絲氨酸家族的一員，可催化attB(細菌附著位點) 和attP (噬菌體附著位點) 之間的特異重組[11]。而且該反應(yīng)是單向性的，重組之后生成attL和attR雜合位點，不能再成為phiC31整合酶的底物。鏈霉菌噬菌體phiC31整合酶能介導含attB位點的外源基因定點整合入多種真核生物基因組的假attP位點，可以維持外源基因的正常結(jié)構(gòu)及高效表達[12]。但是有研究表明如果將phiC31整合酶以質(zhì)粒的形式與含有attB位點的質(zhì)粒進行共轉(zhuǎn)染會導致宿主細胞染色體異常，可能會對宿主細胞基因組造成損傷。因此，本實驗中我們利用phiC31整合酶mRNA，一種易于降解的phiC31整合酶形式介導整合事件的發(fā)生。本研究立足于ω-3 PUFAS在疾病預(yù)防與治療和飲食平衡中的重大價值，通過基因工程的手段使Fat-1基因轉(zhuǎn)入綿羊基因組中，力求生產(chǎn)出自身可以使ω-6/ω-3 PUFAS的比值達到平衡的轉(zhuǎn)基因綿羊。另外，利用phiC31整合酶mRNA使目的基因定點整合入綿羊基因組，而最重要的是誘導表達Cre穿膜肽使設(shè)計在2個Loxp位點間的Kan+與EGFP標記基因刪除，提高轉(zhuǎn)基因綿羊的生物安全性，為生產(chǎn)無篩選標記的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

pCAGGS載體、pN1-EGFP載體與綿羊胎兒皮膚成纖維細胞由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物生物技術(shù)重點實驗室保存。pET-28a-His-NLS-TAT-Cre質(zhì)粒由西北農(nóng)林科技大學王凌云老師惠贈，感受態(tài)細胞BL21 (DE3) 購自北京全式金公司。

大腸桿菌DH5α菌株、小量質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pMD19-T載體、限制性內(nèi)切酶SalⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ、NotⅠ、T4 DNA連接酶、LA Taq DNA聚合酶等均購自大連TaKaRa公司。引物合成、attB基因合成、基因測序均由上海生物工程公司完成。

胎牛血清、G418、NaCl、KCl、Na2HPO4等均購自Sigma公司；抗生素、酵母膏、蛋白胨和瓊脂購自BBI公司。

1.2方法

1.2.1EGFP、Neo-HSV-TK-PolyA序列克隆

根據(jù)pN1-EGFP質(zhì)粒上的EGFP序列設(shè)計引物，并在其上游添加Loxp序列及AgeⅠ酶切位點，在其下游引物添加NotⅠ酶切位點。引物序列見表1。

反應(yīng)體系：模板pEGFP-N1 0.2 μL (837 ng/μL)，EGFP上游引物2.5 μL，EGFP下游引物2.5 μL，10×緩沖液5 μL，dNTPs 3 μL，GXL DNA聚合酶0.5 μL，去離子水補至50 μL；反應(yīng)條件：94 ℃5 min，94 ℃ 45 s，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，72 ℃ 5 min。

根據(jù)pN1-EGFP質(zhì)粒上的Neo-HSV-TK-PolyA序列設(shè)計引物，引物序列見表2。

表1　EGFP引物序列Table 1 The primer sequence of EGFP

表2　Neo-HSV-TK-PolyA引物序列Table 2 The primer sequence of Neo-HSV-TK-PolyA

添加Loxp序列及EcoO109Ⅰ酶切位點。反應(yīng)體系與條件同1.2.1。經(jīng)過膠回收，酶切連接，轉(zhuǎn)化得到的載體命名為pN1-EGFP-K。

1.2.2PhiC31整合酶識別的attB序列的克隆

AttB序列送由上海生物工程公司合成，attB序列連接在pUC57載體上，并在其兩端添加AseⅠ酶切位點。使用AseⅠ酶切pN1-EGFP-K及合成的attB序列，pN1-EGFP-K質(zhì)粒酶切體系：10×Fast Green 緩沖液 (5 μL)，pN1-EGFP-K (4 μL)，Ase I酶 (1 μL)，去離子水補至50 μL。經(jīng)過酶切、連接與轉(zhuǎn)化，載體命名為pN1-EGFP-K-attB。

1.2.3EGFP啟動子CMV序列的克隆

根據(jù)pN1-EGFP質(zhì)粒上的CMV序列設(shè)計引物擴增CMV片段，并在其引物上下游分別添加BamHⅠ和AgeⅠ酶切位點，引物序列見表3。

PCR反應(yīng)體系：模板pN1-EGFP 0.2 μL (837 ng/μL)，CMV上游引物2.5 μL，CMV下游引物2.5 μL，10×緩沖液5 μL，dNTPs 3 μL，GXL DNA聚合酶0.5 μL，去離子水補至50 μL；反應(yīng)條件：94 ℃ (5 min)，94 ℃ (45 s)，59 ℃ (45 s)，72 ℃(1 min)，35個循環(huán)，72 ℃ (5 min)。經(jīng)過膠回收，酶切連接，轉(zhuǎn)化得到載體pN1-EGFP-K-attB-CMV。

1.2.4Fat-1基因克隆

根據(jù)GenBank上的Fat-1基因序列設(shè)計引物，在其上游添加Hind Ⅲ 酶切位點，下游添加PstⅠ酶切位點。引物序列見表4。

表3　CMV引物序列Table 3 The primer sequence of CMV

表4　Fat-1引物序列Table 4 The primer sequence of Fat-1

反應(yīng)條件：98 ℃ (5 min)；98 ℃ (1 min)，61 ℃(3 min)，72 ℃ (3 min)，35個循環(huán)，72 ℃ (10 min)，4 ℃ (10 min)。將PCR產(chǎn)物及pN1-EGFP-K-attB-CMV用Hind Ⅲ和PstⅠ雙酶切后回收目的片段并連接轉(zhuǎn)化，菌落PCR及酶切鑒定正確的菌株進行測序分析。重組載體命名為pEGFPN1-Fat-1 (圖1)。

圖1　pEGFP-N1-Fat-1質(zhì)粒圖譜Fig. 1 The frame of pEGFP-N1-Fat-1 plasmid.

1.2.5PhiC31整合酶mRNA體外轉(zhuǎn)錄

根據(jù)上海生工優(yōu)化合成的phiC31整合酶序列設(shè)計引物，并在其上游添加T7啟動子及BamHⅠ酶切位點，在其下游引物添加NotⅠ酶切位點。經(jīng)過PCR擴增，膠回收，酶切并與pN1-EGFP載體連接，得到載體pN1-EGFP-phiC31。然后利用純化的線性pN1-EGFP-phiC31進行體外轉(zhuǎn)錄，體外轉(zhuǎn)錄體系：5×轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液4 μL，ATP/CTP/GTP/UTP mix 8 μL，線性化的pN1-EGFP-phiC31 1 μL，轉(zhuǎn)錄酶混合物2 μL，無酶水 (DEPC) 5 μL，充分混勻，37 ℃保溫2 h后對體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并純化，測定其濃度，–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6PhiC31整合酶mRNA與pEGFP-N1-Fat-1共轉(zhuǎn)染

當傳代2次的胎兒皮膚成纖維細胞生長至70%–80%時，用phiC31整合酶mRNA與pEGFP-N1-Fat-1共轉(zhuǎn)染。將5 μg pEGFP-N1-Fat-1質(zhì)粒及1 μg phiC31整合酶mRNA與細胞混合后加入到電擊杯中，使用BTX ECM2001電穿孔儀150 V 2 ms電擊一次，室溫放置10 min，再將細胞轉(zhuǎn)移到24孔板中加入培養(yǎng)液混勻放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日觀察細胞生長狀況，如果死細胞過多需換液，48 h后觀察細胞表達綠色熒光的情況。陽性對照為轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒pN1- EGFP。

1.2.7轉(zhuǎn)基因細胞的DNA水平上的鑒定

經(jīng)過400 μg/mL的G418培養(yǎng)液篩選12 d左右直至長出的陽性細胞克隆，挑取單克隆擴大培養(yǎng)，此時加入的G418濃度減半。細胞擴增后傳至24孔板中，直到細胞傳至60 mm培養(yǎng)皿中部分提取基因組DNA作PCR鑒定，一部分凍存。

1.2.8Cre穿膜肽切除轉(zhuǎn)基因細胞中的篩選標記

用轉(zhuǎn)化有pET-28a(+)-His-NLS-TAT-Cre質(zhì)粒的大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21使用IPTG誘導Cre穿膜肽表達。將細胞解凍并傳代2次，與100 μg/mL的His-NLS-TAT-Cre重組蛋白共孵育4 h，蛋白轉(zhuǎn)導后用PBS清洗2次，繼續(xù)培養(yǎng)3–4 d后消化起來，將細胞稀釋到很小的濃度，在顯微鏡下用滅過菌的吸管隨機吸取單個細胞加入到96孔板的每一個孔中進行單細胞篩選，待細胞生長密度可以達到傳代標準時在熒光顯微鏡下觀察，找出無綠色熒光的單克隆做標記并擴大培養(yǎng)，直至培養(yǎng)到卡式瓶中把細胞消化起來，一部分提取基因組作鑒定，一部分凍存。

2　結(jié)果與分析

2.1EGFP、Neo-HSV-TK-PolyA序列擴增結(jié)果

根據(jù)EGFP及Neo-HSV-TK-PolyA序列的引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定在771 bp及1 277 bp處有條帶，與目的片段大小相符 (圖2)。

pN1-EGFP-K質(zhì)粒分別經(jīng)過AgeⅠ、NotⅠ及StuⅠ、EcoO109Ⅰ雙酶切，電泳分析顯示切出大小為771 bp和1 277 bp的DNA片段 (圖3)。

2.2AttB序列克隆結(jié)果

將pN1-EGFP-K-CMV-attB質(zhì)粒進行AseⅠ酶切，電泳檢測到3、9號載體切出300 bp左右的條帶，與attB片段大小吻合 (圖4)，證明attB片段已經(jīng)連接成功。

圖2　EGFP及Neo-HSV-TK-PolyA的PCR擴增產(chǎn)物Fig. 2 PCR amplification products of EGFP and Neo-HSV-TK-PolyA.

圖3　pN1-EGFP-K質(zhì)粒雙酶切凝膠電泳結(jié)果Fig. 3 Dual-restriction digestion of pN1-EGFP-K plasmid.

圖4　pN1-EGFP-K-CMV-attB酶切鑒定Fig. 4 pN1-EGFP-K-CMV-attB restriction digestion identification result.

2.3EGFP啟動子CMV序列克隆結(jié)果

2.3.1EGFP啟動子CMV序列擴增

以pN1-EGFP為模板所克隆的CMV片段，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測約600 bp的DNA片段，與目的片段大小相符 (圖5)。

2.3.2pN1-EGFP-K-attB-CMV質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

pN1-EGFP-K-CMV質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和AgeⅠ雙酶切，進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示切出612 bp大小的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符 (圖6)。

2.4Fat-1基因克隆結(jié)果

2.4.1Fat-1基因擴增結(jié)果

根據(jù)GenBank上的Fat-1基因序列，設(shè)計引物，PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測出大小約1 800 bp左右的目的片段，與目的基因大小吻合 (圖7)。

圖5　EGFP啟動子CMV擴增結(jié)果Fig. 5 EGFP promoter CMV amplification result.

圖6　pN1-EGFP-K-attB-CMV質(zhì)粒酶切鑒定Fig. 6 pN1-EGFP-K-attB-CMV restriction digestion identification result.

圖7　Fat-1 PCR電泳結(jié)果Fig .7 Fat-1 gene electrophoresis result.

2.4.2pEGFP-N1-Fat-1重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

pEGFP-N1-Fat-1質(zhì)粒經(jīng)過Hind Ⅲ和PstⅠ雙酶切，電泳檢測到1、2、3、4號都有切下大小1 800 bp左右片段 (圖8)，初步驗證目的基因已連接入框架載體，送往上海生物工程公司測序。測序結(jié)果與預(yù)期相同，表明pEGFP-N1-Fat-1重組載體構(gòu)建成功。

2.5Fat-1基因的定點整合細胞轉(zhuǎn)染

本實驗以轉(zhuǎn)染pN1-EGFP的細胞作為陽性對照，將phiC31整合酶mRNA與pEGFP-N1-Fat-1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)染后48 h觀察細胞轉(zhuǎn)染情況。圖中A、A′為轉(zhuǎn)染pEGFP-N1的細胞在明場及激發(fā)光下的細胞 (lOOX)，B、B′為轉(zhuǎn)染phiC31整合酶mRNA與pEGFP-N1-Fat-1質(zhì)粒的細胞在明場及激發(fā)光下的細胞 (lOOX)，轉(zhuǎn)染效率比較高 (圖9)。

圖8　pEGFP-N1-Fat-1的酶切鑒定Fig. 8 Results of enzyme digestion of recombinant plasmid of pEGFP-N1-Fat-1.

圖9　細胞轉(zhuǎn)染后熒光檢測Fig. 9 Fluorescence detection of the transfected cells.

2.6轉(zhuǎn)Fat-1基因綿羊胎兒皮膚成纖維細胞的鑒定

提取6個細胞系的基因組，對定點整合斷裂位點PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，PCR檢測結(jié)果顯示1、2、4、5、6、8號沒有條帶出現(xiàn) (圖10)，表明attB片段沒有擴增出來，而對這6個基因組進行Fat-1基因PCR擴增，出現(xiàn)目的條帶 (圖11)，大小與目的基因吻合，初步判定Fat-1基因已整合入綿羊基因組中。

2.7無篩選標記轉(zhuǎn)Fat-1基因細胞系的鑒定

將所得到的EGFP與Fat-1基因PCR擴增產(chǎn)物分別進行1%瓊脂糖凝膠電泳，由電泳圖可見1、3、10、12號擴增出EGFP基因 (圖12)，而2、4、5、6、7、8、9、11、13、14號沒有擴增出EGFP片段，初步斷定為篩選標記已去除。取2、4、5、6、7、8、9、11、13、14號基因組進行Fat-1基因的PCR擴增發(fā)現(xiàn)10個樣品都擴增出目的基因 (圖13)，初步判定這些是切除標記基因并轉(zhuǎn)入Fat-1基因的細胞系。

圖10　attB PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果Fig. 10 The results of PCR amplification products of attB.

圖11　Fat-1基因PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果Fig. 11 The results of PCR amplification products of Fat-1 gene.

3　討論

圖12　EGFP基因PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果Fig. 12 The results of PCR amplification products of EGFP gene.

圖13　Fat-1基因PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果Fig. 13 The results of PCR amplification products of Fat-1 gene.

多不飽和脂肪酸為人體必需脂肪酸，具有重要的生理功能。攝入高水平的ω-3PUFAS可以促進嬰幼兒大腦、視網(wǎng)膜和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，還可以降低心血管疾病和炎癥的發(fā)生[13]。哺乳動物體內(nèi)缺乏△12以上的脂肪酸脫氫酶不能直接合成ω-3及ω-6PUFAS，只能從食物中獲取[14]。因此本研究構(gòu)建轉(zhuǎn)入Fat-1基因的真核表達載體，為以后使其轉(zhuǎn)入動物基因組中生產(chǎn)出可以自身合成多聚不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)基因家畜。

PhiC31整合酶是來源于鏈霉菌屬噬菌體的重組酶，它可以將帶有attB的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒定點地整合入哺乳動物基因組假attP位點。phiC31整合酶介導的位點特異性整合較隨機整合與病毒載體系統(tǒng)安全的多，是生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的理想工具[15]。有研究表明，當phiC31整合酶以質(zhì)粒的形式與載體共同轉(zhuǎn)染細胞后，對這些細胞進行檢測發(fā)現(xiàn)細胞核型分析異常，phiC31整合酶持續(xù)表達會影響轉(zhuǎn)基因細胞的生長與后期動物的發(fā)育。因此本研究使用一種快速的易于降解的phiC31整合酶mRNA的形式與攜帶目的基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞，因為mRNA易于降解，因此本實驗中用到的儀器等都經(jīng)過了處理，構(gòu)建的含有phiC31整合酶基因的載體由上海生物工程公司合成，其功能已有研究證實比較可靠。phiC31整合酶介導的位點特異性整合遠離內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄起始位點和與癌癥有關(guān)的基因，這就使其避免了基因表達紊亂。因此phiC31整合酶介導的重組反應(yīng)安全性比較高[16]。

自20世紀80年代以來，生物安全問題已引起世界各界的熱議，2000年5月《卡塔赫納生物安全議定書》出爐[17]。該書意在解決轉(zhuǎn)基因生物安全的問題。此后，各國研究組織與機構(gòu)開始關(guān)注轉(zhuǎn)基因動物的安全性問題，政府也出臺了相應(yīng)的法律法規(guī)來管理和規(guī)范轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)品的研究與應(yīng)用[18]。目前，轉(zhuǎn)基因食品安全在我國引發(fā)人們的熱議，轉(zhuǎn)基因家畜研究是一個重要的領(lǐng)域，因此研究降低轉(zhuǎn)基因家畜安全隱患是一個關(guān)鍵性的問題，而轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)時大都會使用篩選標記基因，這些標記基因的使用和殘留會引起轉(zhuǎn)基因生物環(huán)境與產(chǎn)品的安全性[19]，因此本實驗中構(gòu)建的載體帶有兩個同向的Loxp位點，而且EGFP基因與Neo-HSV-TK-PolyA基因都在兩個Loxp位點之間，如果后期需要可以使構(gòu)建好的載體與Cre酶共同轉(zhuǎn)染刪除EGFP基因和Neo-HSV-TK-PolyA基因[20]。而且本實驗中構(gòu)建的pEGFP-N1-Fat-1載體含有attB位點，它可以識別動物基因組上的假attP位點并在phiC31整合酶的介導下使目的基因定點整合入哺乳動物基因組中[21]。因此本文中構(gòu)建的真核表達載體為無選擇標記的安全轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究提供基礎(chǔ)，特別是在將來利用本研究的結(jié)果實施選擇標記的刪除，從而獲得無選擇標記的供體細胞，通過體細胞核移植技術(shù)生產(chǎn)無選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因個體。這將推動轉(zhuǎn)基因動物育種技術(shù)向前邁出重要的一步。

REFERENCES

[1] Ruxton CH, Reed SC, Simpson MJ, et al. The health benefits of omega-3 polyunsaturated fatty acids: a review of the evidence. J Hum Nutr Diet, 2004, 17(5): 449–459.

[2] Wu X, Ouyang HS, Duan B, et al. Production of cloned transgenic cow expressing omega-3 fatty acids. Transgenic Res, 2012, 21(3): 537–543.

[3] Yao QH, Zhang XC, Fu T, et al. ω-3 polyunsaturated fatty acids inhibit the proliferation of the lung adenocarcinoma cell line A549 in vitro. Mol Med Rep, 2014, 9(2): 401–406．

[4] De Carlo F, Witte TR, Hardman WE, et al. Omega-3 eicosapentaenoic acid decreases CD133 colon cancer stem-like cell marker expression while increasing sensitivity to chemotherapy. PLoS ONE, 2013, 8(7): e69760.

[5] Powell BC, Walker SK, Bawden CS, et al. Transgenic sheep and wool growth: possibilitiesand current status. Reprod Fertil Dev, 1994, 6(5): 615–623.

[6] Lan C, Ren LN, Wu M, et al. Deletion of marker gene in transgenic goat by Cre/LoxP system. Chin J Biotech, 2013, 29(12): 1847–1854 (in Chinese).

蘭翀, 任麗娜, 吳敏, 等. 利用Cre/LoxP系統(tǒng)刪除轉(zhuǎn)基因山羊體內(nèi)的選擇標記基因. 生物工程學報, 2013, 29(12): 1847–1854.

[7] Zhao Y, Yu T, Xing SC. Application of Cre/lox site-specific recombination system in transgenic plants. Chin J Biochem Mol Biol, 2010, 26(2): 95–103 (in Chinese).

趙妍, 余濤, 邢少辰. Cre/lox位點特異重組系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用. 中國生物化學與分子生物學報, 2010, 26(2) : 95–103.

[8] Wang ZR, Liu XM, Zhou JR, et al. Efficacy evaluation of Cre-LoxP recombinase system to delete the endogenous selectable marker gene. Chin J Biochem Mol Biol, 2014, 30(2): 194–201 (in Chinese).

王志蕊, 劉西梅, 周荊榮, 等. Cre-Loxp重組系統(tǒng)刪除內(nèi)源性選擇標記基因的效能評價. 中國生物化學與分子生物學報, 2014, 30(2): 194–201.

[9] Lu JJ, Maddison LA, Chen WB. φC31 integrase induces efficient site-specific excision in zebrafish. Transg Res, 2011, 20(1): 183–189.

[10] Li L, Guo R, Chang XS, et al. Generation of islet β cell-specific Cre recombinase targeting vector by homologous recombination in bacteria. Acad J Sec Milit Med Univ, 2014, 35(2): 185–190 (in Chinese).

李玲, 國蓉, 常緒生, 等. 利用細菌內(nèi)同源重組技術(shù)構(gòu)建胰島β細胞特異性表達Cre重組酶的基因敲入打靶載體. 第二軍醫(yī)大學學報, 2014, 35(2): 185–190.

[11] Kempe K, Rubtsova M, Berger C, et al. Transgene excision from wheat chromosomes by phage φC31 integrase. Plant Mol Biol, 2010, 72(6): 673–687.

[12] Bi YX, Liu XM, Hua ZD, et al. Site-specific modification of pig genome mediated by ΦC31 integrase. Chin J Biochem Mol Biol, 2014, 30(2): 187–193 (in Chinese).

畢延震, 劉西梅, 華再東, 等. ΦC31整合酶介導豬基因組定點修飾的探討. 中國生物化學與分子生物學報, 2014, 30(2): 187–193.

[13] Benbrook CM, Butler G, Latif MA, et al. Organic production enhances milk nutritional quality by shifting fatty acid composition: a United States-wide, 18-month study. PLoS ONE, 2013, 8(12): e82429.

[14] Lister JA. Transgene excision in zebrafish using the φC31 integrase. Genesis, 2010, 48(2): 137–143.

[15] Allen BG, Weeks DL. Transgenic Xenopus laevis embryos can be generated using φC31 integrase. Nat Methods, 2005, 2(12): 975–979.

[16] Zou LT. Study the gene inversion and deletion mediated by phage phiC31/att site-pecific recombinant system[D]. Chongqing: Southwest University, 2014 (in Chinese).

鄒麗婷. 噬菌體phiC31/att位點重組系統(tǒng)介導的基因倒位和刪除研究[D]. 重慶: 西南大學, 2014.

[17] Wang ZP, Zhang SZ. Safety of transgenic animal food. J Anhui Agri Sci, 2007, 35(19): 5868–5869 (in Chinese).

王正鵬, 張樹珍. 轉(zhuǎn)基因動物食品的安全性. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2007, 35(19): 5868–5869.

[18] Wang L, Li XL. Ethical dilemmas of safety of genetically modified food in China. J Anhui Agri Sci, 2014, 42(33): 1854–1856 (in Chinese).

王磊, 李曉蘭. 我國轉(zhuǎn)基因食品安全的倫理困境.安徽農(nóng)業(yè)科學, 2014, 42(33): 11854–11856.

[19] Pandey SN, Lee YC, Yokota T, et al. Morpholino treatment improves muscle function and pathology of Pitx1 transgenic mice. Mol Ther, 2014, 22(2): 390–396.

[20] Smith MC, Brown WR, McEwan AR, et al. Site-specific recombination by phiC31 integrase and other large serine recombinases. Biochem Soc Trans, 2010, 38(2): 388–394.

[21] Chavez CL, Calos MP. Therapeutic applications of the PhiC31 integrase system. Curr Gene Ther, 2011, 11(5): 375–381.

(本文責編陳宏宇)

Construction of Fat-1 eukaryotic expression vector of excision markers and the establishment of transgenic sheep cell lines

Lima A*, Heping Zhu*, Ruiyao Wang, Tao Yan, Xiaohu Su, Lu Li, Bingping Wang, Shunwendoule Na, Guichun Qi, and Huanmin Zhou
Key Laboratory of Biological Manufacturing of Inner Mongolia Autonomous Region College of Life Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, Inner Mongolia, China

Abstract:In order to establish marker-free transgenic cell lines, we cloned Fat-1 gene, attB and Loxp sequences by PCR.Then we inserted these sequences to pN1-EGFP vector and got pEGFP-N1-Fat-1 expression vector. PhiC31 integrase mRNA which was generated by in vitro transcription and a pEGFP-N1-Fat-1 expression vector co-electroporated into sheep fetal fibroblasts, and then we got transgenic cell lines expressing green fluorescence. Prokaryotic expression and purification of Cre recombinant protein was performed. Cre recombinant protein was transducted into stably-transfected cell colonies. We identified cell colonies by sequencing and established marker-free transgenic cell lines and eventually established marker-free transgenic cell lines which were building more safely basic for producing Fat-1 transgenic animals.

Keywords:Fat-1 gene, eukaryotic expression vector, marker gene, phiC31 integrase

Corresponding author:Huanmin Zhou. E-mail: huanminzhou@126.com