陳　韜,　陳賢鉻,　徐俊燁,　范　軍*,　俞　英,　章偉光,*

(1. 華南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院, 廣東 廣州 510006; 2. 廣州研創(chuàng)生物技術(shù)發(fā)展有限公司, 廣東 廣州 510663)

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模擬移動(dòng)床色譜法拆分甲霜靈對(duì)映體

陳韜1,陳賢鉻1,徐俊燁2,范軍1*,俞英1,章偉光1,2*

(1. 華南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院, 廣東 廣州 510006; 2. 廣州研創(chuàng)生物技術(shù)發(fā)展有限公司, 廣東 廣州 510663)

摘要:模擬移動(dòng)床(SMB)色譜作為一種精確、高效的制備色譜技術(shù)引起研究者的極大關(guān)注。本文以EnantioPak OD填料為手性固定相,正己烷-乙醇(70∶30, v/v)為流動(dòng)相,在四區(qū)模擬移動(dòng)床上手性拆分甲霜靈外消旋體。采用旋光檢測(cè)器研究甲霜靈異構(gòu)體在手性柱上的洗脫順序;探討進(jìn)樣濃度、進(jìn)樣流速、各區(qū)流速和切換時(shí)間等條件對(duì)手性分離甲霜靈外消旋體的影響,并與制備色譜進(jìn)行比較。結(jié)果表明:S-(+)-甲霜靈先于R-(-)-甲霜靈被流動(dòng)相洗脫,R-(-)-甲霜靈在色譜柱上的保留強(qiáng)于S-(+)-甲霜靈;在線性和非線性條件下,模擬移動(dòng)床都能很好地拆分甲霜靈外消旋體,在優(yōu)化SMB工藝條件下,S-(+)-甲霜靈和R-(-)-甲霜靈的光學(xué)純度都大于99%;在樣品質(zhì)量濃度為15 mg/mL的條件下,模擬移動(dòng)床色譜分離的樣品量顯著高于制備色譜,而流動(dòng)相消耗僅為后者的1/9。這對(duì)于發(fā)展大規(guī)模色譜拆分甲霜靈工藝具有良好的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞:模擬移動(dòng)床色譜;洗脫體積法;手性分離;甲霜靈;洗脫順序

手性藥物對(duì)映體在生物體內(nèi)表現(xiàn)出截然不同的活性,某種對(duì)映體具有良好的藥效,而其他可能無效,甚至有害[1]。超過25%的商品化農(nóng)藥具有手性特征,但多數(shù)仍以外消旋體銷售。隨著立體化學(xué)、環(huán)境化學(xué)和生命科學(xué)的快速發(fā)展,手性問題在農(nóng)藥研究中受到重視[2,3]?？焖?、高效獲得光學(xué)純的手性產(chǎn)品成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。其中,手性固定相-色譜分離技術(shù)[4-6]不僅能對(duì)手性對(duì)映體進(jìn)行定性、定量分析,還可用于制備規(guī)模的分離。

甲霜靈(圖1)是一種在農(nóng)業(yè)中普遍使用的高效殺菌劑[18],其R-異構(gòu)體具有極強(qiáng)的殺菌效果[19],因此,得到光學(xué)純R-異構(gòu)體對(duì)減少農(nóng)藥使用、降低環(huán)境中農(nóng)藥的殘留具有重要意義。本文采用EnantioPak OD手性填料,以正己烷-乙醇為流動(dòng)相,在四區(qū)模擬移動(dòng)床色譜上手性分離甲霜靈外消旋體,研究了進(jìn)樣濃度、進(jìn)樣流速、二區(qū)和三區(qū)流速、切換時(shí)間等操作參數(shù)對(duì)甲霜靈分離的影響。

圖1　甲霜靈對(duì)映體的分子結(jié)構(gòu)Fig. 1　Molecular structures of metalaxyl enantiomers

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

島津LC-15C型高效液相色譜儀,配有Rheodyne 7725型手動(dòng)進(jìn)樣器(20 μL定量環(huán))和SPD-20A型紫外可見光檢測(cè)器(日本島津公司); LC-3000高效液相制備色譜儀(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司);模擬移動(dòng)床色譜配備4臺(tái)NP7000C型溶劑輸送泵(江蘇漢邦科技有限公司),以VICI八通旋轉(zhuǎn)閥(美國(guó)VALCO公司)控制色譜柱的切換;IBZ Chiralyser-MP型旋光檢測(cè)器(德國(guó)IBZ MESSTECHNIK GMBH)。

甲霜靈(分析純,98%)(湖北武漢豐竹林化學(xué)科技有限公司); 1,3,5-三叔丁基苯(分析純,純度>98%)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);正己烷和無水乙醇(分析純)(天津大茂化學(xué)試劑廠); EnantioPak OD分析型色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)和8根EnantioPak OD半制備手性柱(100 mm×10.0 mm, 10 μm)(廣州研創(chuàng)生物技術(shù)發(fā)展有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1色譜柱的均一性研究

分別在8根色譜柱上注入1.0 mg/mL甲霜靈外消旋體溶液20 μL,在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)行分離,獲得甲霜靈對(duì)映體在色譜柱上的出峰時(shí)間、柱效、分離因子和分離度等數(shù)據(jù);再以1,3,5-三叔丁基苯獲得死時(shí)間(t0)和系統(tǒng)死時(shí)間(tD)。根據(jù)公式(1)計(jì)算空隙率(ε):

(1)

其中Q為流動(dòng)相流速(mL/min),Vcol為色譜柱的柱體積(mL)。

1.2.2SMB拆分甲霜靈外消旋體

1.2.2.1SMB分離簡(jiǎn)述

SMB分離甲霜靈對(duì)映體的工作在漢邦提供的模擬移動(dòng)床設(shè)備上完成。在四區(qū)模擬移動(dòng)床系統(tǒng)中串聯(lián)8根EnantioPak OD柱(100 mm×10.0 mm)形成一個(gè)閉合回路,每區(qū)2根;依據(jù)洗脫體積法[20,21]確定系統(tǒng)運(yùn)行的參數(shù),如各區(qū)流速(Qi)、切換時(shí)間(t*)和進(jìn)樣流速等;啟動(dòng)系統(tǒng),由進(jìn)樣泵將一定質(zhì)量濃度的甲霜靈溶液泵入系統(tǒng),在EnantioPak OD手性柱上完成拆分,分別接收提取液和提余液;通過高效液相色譜法測(cè)定提取液和提余液中甲霜靈異構(gòu)體的純度。

1.2.2.2洗脫體積的確定

以高效液相色譜法在EnantioPak OD (100 mm×10.0 mm)柱上分離甲霜靈外消旋體,從色譜圖上分別得到兩種對(duì)映體的洗脫時(shí)間,進(jìn)而計(jì)算洗脫體積。此時(shí),流動(dòng)相為正己烷-乙醇(70∶30, v/v)混合溶液,樣品質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL,進(jìn)樣體積為20 μL,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。

1.2.2.3SMB操作參數(shù)的確定與優(yōu)化

以洗脫體積法確定SMB操作參數(shù)時(shí),應(yīng)滿足以下關(guān)系:

QⅠ×t*≥VR,B,Ⅰ

(2)

QⅡ×t*≥VR,A,Ⅱ

(3)

QⅢ×t*≤VR,B,Ⅲ

(4)

QⅣ×t*≤VR,A,Ⅳ

(5)

其中QⅠ、QⅡ、QⅢ、QⅣ為各區(qū)流速(mL/min);VR,j,i(j=A, B)為第i區(qū)j組分的保留體積(mL), A為弱保留組分,B為強(qiáng)保留組分;t*為切換時(shí)間(min),受系統(tǒng)和色譜柱壓力的控制。

在本研究中,改變進(jìn)樣濃度、進(jìn)樣流速、二區(qū)和三區(qū)流速、切換時(shí)間等條件來研究SMB分離甲霜靈的影響,優(yōu)化操作參數(shù)以期獲得最佳的分離效果。

1.2.3高效液相制備色譜分離甲霜靈

在LC-3000型高效液相制備色譜儀上,應(yīng)用EnantioPak OD (100 mm×10.0 mm)開展甲霜靈對(duì)映體的制備分離研究。色譜條件:流動(dòng)相為正己烷-乙醇(70∶30, v/v)混合溶液;樣品質(zhì)量濃度為15.0 mg/mL,進(jìn)樣體積為0.4 mL,進(jìn)樣間隔為3.2 min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。

1.2.4HPLC法測(cè)定甲霜靈異構(gòu)體的純度

將上述提取液或提余液注入EnantioPak OD分析柱(150 mm×4.6 mm),以正己烷-乙醇(70∶30, v/v)混合液為流動(dòng)相進(jìn)行色譜分離。此時(shí),進(jìn)樣體積為10 μL,流動(dòng)相流速為1.0 mL/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。

2結(jié)果與討論

2.1色譜柱的均一性結(jié)果

模擬移動(dòng)床的分離原理及切換模式意味著每根色譜柱在整個(gè)體系中均占據(jù)同等地位,在不同的時(shí)刻都要承擔(dān)相應(yīng)的分離任務(wù),因此性能相近的手性柱才能保證模擬移動(dòng)床系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行。如表1所示,在正己烷-乙醇(70∶30, v/v)為流動(dòng)相的條件下,甲霜靈兩對(duì)映體的平均保留時(shí)間分別為3.090 min和5.095 min,分離度為3.707, RSD (n=8)為1.8%;以1,3,5-三叔丁基苯測(cè)得平均孔隙率為0.656 9, RSD (n=8)為0.52%,說明色譜柱具有良好的均一性。在后續(xù)工作中,以色譜柱的平均值作為設(shè)定模擬移動(dòng)床操作參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)。

表 1　8根半制備EnantioPak OD色譜柱的均一性測(cè)試結(jié)果

ε: porosity. Chromatographic conditions: mobile phase, hexane-ethanol (70∶30, v/v); sample mass concentration, 1.0 mg/mL; injection volume, 20 μL; detection wavelength, 220 nm; flow rate, 3.0 mL/min; column temperature, 25 ℃.

2.2SMB操作參數(shù)對(duì)甲霜靈分離的影響

2.2.1操作參數(shù)的優(yōu)化方法

在SMB相關(guān)研究中,主要通過三角形理論[1,8]、洗脫體積法[20,21]、駐波設(shè)計(jì)法[22]和建模優(yōu)化法[21]等確定其操作參數(shù)。在三角形理論中,需要測(cè)定吸附等溫線,樣品消耗量高,同時(shí)不同樣品濃度下的三角形分離區(qū)域不同,參數(shù)確定周期較長(zhǎng);而洗脫體積法具有快速、樣品消耗量少等特點(diǎn),在獲得每個(gè)組分的保留體積的基礎(chǔ)上,初步確定SMB操作參數(shù),再進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化。本文選擇以洗脫體積法來確定SMB的操作參數(shù)。

圖2為甲霜靈外消旋體在EnantioPak OD半制備柱上分離的色譜圖。計(jì)算可知,強(qiáng)保留組分B的保留體積為21.18 mL,取弱保留組分A最早和最晚出峰的保留體積7.92 mL和12.24 mL代入公式(2)～(5)得到:

QⅠ×t*≥21.18 mL

QⅡ×t*≥12.24 mL

QⅢ×t*≤21.18 mL

QⅣ×t*≤7.92 mL

圖2　甲霜靈在EnantioPak OD半制備柱上的HPLC色譜圖Fig. 2　HPLC chromatogram of metalaxyl enantiomers on an EnantioPak OD semi-preparative columnChromatographic conditions are the same as in Table 1.

設(shè)定切換時(shí)間t*為6.0 min,則QⅠ≥3.53 mL/min,QⅡ≥2.04 mL/min,QⅢ≤3.53 mL/min,QⅣ≤1.32 mL/min。在實(shí)際應(yīng)用中,存在傳質(zhì)阻力和軸向彌散等非理想因素,因此以參數(shù)代替來確定各區(qū)的初始流量,再根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)化和調(diào)整工藝條件。

2.2.2進(jìn)樣濃度的影響

增大進(jìn)樣濃度可以大幅提高模擬移動(dòng)床分離的樣品量。在切換時(shí)間為6 min,模擬移動(dòng)床從Ⅰ區(qū)到Ⅳ區(qū)的流速分別為3.53、1.34、1.74、1.32 mL/min,進(jìn)樣流速為0.40 mL/min的條件下,研究樣品濃度對(duì)甲霜靈分離的影響。

表 3　進(jìn)樣流速對(duì)SMB分離甲霜靈性能的影響

Switch time: 6 min.

如表2所示,樣品質(zhì)量濃度從1.0 mg/mL增大到30.0 mg/mL (即操作點(diǎn)A1到A5),提取液純度均大于99%,說明此時(shí)第Ⅱ區(qū)的洗脫體積足以洗脫弱保留組分。但提余液的純度隨樣品質(zhì)量濃度的增大變化顯著。不大于15.0 mg/mL時(shí),提余液純度均大于99%;而增大到30.0 mg/mL時(shí),樣品純度減小至90.98%。說明隨著質(zhì)量濃度增大,第Ⅲ區(qū)洗脫體積將強(qiáng)保留組分從色譜柱上洗脫進(jìn)入提余液。

2.2.3進(jìn)樣流速的影響

增大進(jìn)樣流速亦可提高進(jìn)樣量,達(dá)到提高SMB的處理效率的目的。通過減小第Ⅱ區(qū)流速或增大第Ⅲ區(qū)流速以增大進(jìn)樣流速,研究其對(duì)甲霜靈分離的影響(見表3)。

表 2　樣品質(zhì)量濃度對(duì)SMB分離性能的影響

在樣品質(zhì)量濃度為15.0 mg/mL,第Ⅲ區(qū)流速為1.80 mL/min的條件下,將第Ⅱ區(qū)流速從1.60 mL/min逐步減小至1.30 mL/min,相應(yīng)進(jìn)樣流速從0.20 mL/min增加到0.50 mL/min (見表3中B1～B5)。結(jié)果表明,提余液的純度基本不變,而提取液純度從99.36%迅速降低到91.50%,這是由于降低第Ⅱ區(qū)流速后,弱保留組分不能完全被洗脫而進(jìn)入提取液中。

在樣品質(zhì)量濃度為15.0 mg/mL,第Ⅱ區(qū)流速為1.34 mL/min的條件下,第Ⅲ區(qū)流速從1.84 mL/min逐步增加到1.98 mL/min (見表3中B6～B9),提取液和提余液的純度同時(shí)降低,這可能是因?yàn)榈冖髤^(qū)流速增大,使洗脫體積增大,強(qiáng)保留組分部分被洗脫到提余液中;此外,盡管第Ⅱ區(qū)流速和洗脫體積不變,但由于進(jìn)樣量增大,更多的弱保留組分分布在第Ⅱ區(qū),需要更大的洗脫體積才能洗脫弱保留組分,故提取液純度也降低了。

2.2.4第Ⅱ區(qū)和第Ⅲ區(qū)流速的影響

保持進(jìn)樣流速不變,同時(shí)改變第Ⅱ～Ⅲ區(qū)的流速亦對(duì)SMB分離產(chǎn)生影響。如表4所示,切換時(shí)間為6 min,樣品質(zhì)量濃度為30 mg/mL,進(jìn)樣流速為0.4 mL/min的條件下,同時(shí)減小第Ⅱ、Ⅲ區(qū)的流速(見表4中C1～C3),提取液純度從99.38%減小到98.69%,而提余液純度從86.56%增大到95.68%;進(jìn)一步增大進(jìn)樣流速到0.6 mL/min (見表4中C4～C7),提取液的純度從98.63%減小到89.03%,而提余液的純度從71.04%增大到89.13%?？赡苁且?yàn)榻档偷冖騾^(qū)流速,減小第Ⅱ區(qū)的洗脫體積,已不能滿足洗脫全部弱保留組分的要求,進(jìn)入提取液的弱保留組分增加,提取液的純度降低。隨著第Ⅲ區(qū)流速減小,相應(yīng)減小第Ⅲ區(qū)的洗脫體積,不足以洗脫更多的強(qiáng)保留組分,故提余液的純度增加。

表 4　第Ⅱ區(qū)和第Ⅲ區(qū)流速對(duì)SMB分離性能的影響

Switch time: 6 min; feed mass concentration: 30 mg/mL.

2.2.5切換時(shí)間的影響

SMB的切換時(shí)間對(duì)其分離性能的影響非常顯著。在進(jìn)樣質(zhì)量濃度為30.0 mg/mL,進(jìn)樣流速為0.6 mL/min,第Ⅰ到IV區(qū)的流速依次為3.53、1.26、1.86、1.32 mL/min的條件下,研究切換時(shí)間對(duì)SMB分離性能的影響(見表5)。

表 5　切換時(shí)間對(duì)SMB分離性能的影響

結(jié)果表明,隨著切換時(shí)間從6.0 min減小到5.0 min,提取液的純度從98.63%減小到71.83%,而提余液的純度從71.04%增大到99.67%。說明各區(qū)流速不變時(shí),隨著切換時(shí)間的減小,用于第Ⅱ區(qū)和第Ⅲ區(qū)的洗脫體積都減小,則第Ⅱ區(qū)的洗脫體積逐漸不足以洗脫弱保留組分,部分弱保留組分進(jìn)入提取液;第Ⅲ區(qū)的洗脫體積洗脫強(qiáng)保留組分的量減小,進(jìn)入提余液的強(qiáng)保留組分減小,提余液的純度上升。

2.2.6柱尾濃度分布分析

圖3為操作點(diǎn)B2和C1條件下的柱尾濃度分布圖。在操作點(diǎn)B2條件下(見圖3a), 2號(hào)色譜柱對(duì)應(yīng)提取液出口,此時(shí)甲霜靈弱保留組分的含量很少,強(qiáng)保留組分的含量很高,在流動(dòng)相自左向右的洗脫下得到高純度的提取液;6號(hào)色譜柱對(duì)應(yīng)提余液出口,此時(shí)甲霜靈弱保留組分的含量很高,強(qiáng)保留組分的含量很少,得到高純度的提余液(見表3)。

圖3　操作點(diǎn)(a)B2和(b)C1的柱尾濃度分布圖Fig. 3　Concentration distribution of entries (a) B2 and (b) C1

在操作點(diǎn)C1條件下(見圖3b), 2號(hào)色譜柱對(duì)應(yīng)提取液出口,此時(shí)甲霜靈弱保留組分的含量很少,強(qiáng)保留組分的含量很高,在流動(dòng)相自左向右的洗脫下,得到高純度的提取液(見表4); 6號(hào)色譜柱對(duì)應(yīng)提余液出口,此時(shí)甲霜靈弱保留組分含量和強(qiáng)保留組分含量相差不大,弱保留組分含量大于強(qiáng)保留組分,在流動(dòng)相的洗脫下,弱保留組分和一部分強(qiáng)保留組分都進(jìn)入提余液。

2.3制備色譜分離甲霜靈的結(jié)果

在LC-3000型高效液相制備色譜上制備分離甲霜靈對(duì)映體,并與SMB分離甲霜靈的結(jié)果(見表3中操作點(diǎn)B8)進(jìn)行比較。結(jié)果表明,在相同樣品濃度的條件下,SMB的樣品處理量為540 mg/h,約為高效液相制備色譜的5倍,而流動(dòng)相消耗量為0.31 L/g,僅為高效液相制備色譜的1/9,說明采用SMB的樣品處理量更高,而溶劑消耗更低。

2.4甲霜靈對(duì)映體的洗脫順序

對(duì)操作點(diǎn)B2下的提余液和提取液進(jìn)行HPLC分析,分別采用紫外檢測(cè)器和旋光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)(見圖4)。

從圖4a可知,提取液和提余液的純度均大于99%。圖4b中,使用EnantioPak OD手性柱,以正己烷/乙醇(70∶30, v/v)為流動(dòng)相時(shí),S-(+)-甲霜靈的保留弱于R-(-)-甲霜靈,先被洗脫,而R-(-)-甲霜靈則較晚被流動(dòng)相洗脫。

圖4　操作點(diǎn)B2條件下提余液和提取液的HPLC色譜圖Fig. 4　HPLC chromatograms of the extract and raffinate products under B2 operation conditionsa. UV detector; b. optical rotation detector.

3結(jié)論

本文使用EnantioPak OD手性柱,以正己烷/乙醇(70∶30, v/v)為流動(dòng)相,采用四區(qū)模擬移動(dòng)床手性分離甲霜靈外消旋體。8根半制備色譜柱具有良好的均一性;以洗脫體積法初步確定SMB的運(yùn)行參數(shù),研究了進(jìn)樣濃度、進(jìn)樣流速、各區(qū)的流速和切換時(shí)間等因素對(duì)SMB分離的影響,通過優(yōu)化SMB運(yùn)行參數(shù)得到甲霜靈的兩種異構(gòu)體。本研究為開發(fā)工業(yè)規(guī)模色譜分離手性樣品提供了一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Enantioseparation of metalaxyl racemate by simulated moving bed chromatography

CHEN Tao1, CHEN Xiange1, XU Junye2, FAN Jun1*, YU Ying1, ZHANG Weiguang1,2*

(1. School of Chemistry and Environment, South China Normal University, Guangzhou 510006, China;2. Guangzhou Research & Creativity Biotechnology Co. Ltd., Guangzhou 510663, China)

Abstract:Due to some advantages such as high precision, high efficiency and low consumption of organic solvents, chromatographic separation technique by simulated moving bed (SMB) has attracted considerable attention in the past decades. Herein, the enantioseparation of metalaxyl racemate on EnantioPak OD columns has been carried out by SMB chromatography with the mixture of hexane-ethanol (70∶30, v/v). The elution order of two metalaxyl enantiomers under current chromatographic conditions was determined by HPLC with the optical rotation detector. Then, the influence of running parameters, such as the concentration, flow rate and switch time on the resolution of metalaxyl racemate has been studied in detail. In addition, the separation results from SMB and the preparative chromatography have been compared under the same concentrations. The results showed that the retention of S-(+)-metalaxyl was weaker than R-(-)-metalaxyl and S-(+)-metalaxyl was eluted first. Most importantly, metalaxyl racemate was well separated by SMB chromatography under linear or non-linear conditions, and the purity of each enantiomer product was over 99%. Furthermore, the amount separated by SMB was much more than by the preparative chromatography with racemate concentration of 15 mg/mL, and the mobile phase consumption was one-ninth of the latter. In brief, these results provide us important information for the future development of large-scale chromatographic separation of metalaxyl enantiomers.

Key words:simulated moving bed (SMB) chromatography; elution volume approach; chiral separation; metalaxyl; elution order

DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.10024 [4]Shen J, Okamoto Y. Chem Rev, 2015, 10.1021/acs. chemrev.5b00317

*收稿日期:2015-10-16

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21171059,21275056);科技部中小型企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項(xiàng)目(13C26214404534);廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A010101145,2012B010900043);廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013J4400027,201508020093).

中圖分類號(hào):O658

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1000-8713(2016)01-0068-06

色譜手性分離專刊·研究論文

*通訊聯(lián)系人.Tel:(020)39310187,E-mail:wgzhang@scnu.edu.cn(章偉光);fanj@scnu.edu.cn(范軍).

Foundation item: Project of National Natural Science Foundation of China (21171059, 21275056); Innovation Fund for Technology Based Firms, Ministry of Science and Technology, China (13C26214404534); Science and Technology Project of Guangdong Province, China (2014A010101145, 2012B010900043); Guangzhou Science and Technology Project, China (2013J4400027, 201508020093).