木肖玉,　齊　莉,　蘇　圓,　喬　娟,　陳　義

(1. 中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所, 中國(guó)科學(xué)院活體分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100190; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 山東 泰安 271018)

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手性配體交換毛細(xì)管電泳在氨基酸手性分析中的應(yīng)用研究進(jìn)展

木肖玉1,2,齊莉1*,蘇圓1,3,喬娟1,陳義1

(1. 中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所, 中國(guó)科學(xué)院活體分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100190; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 山東 泰安 271018)

摘要:氨基酸的手性分析在生命科學(xué)中具有重要的研究意義。手性配體交換毛細(xì)管電泳法作為常用的氨基酸的手性分析方式之一,具有高效、快速、樣品遷移順序可調(diào)等優(yōu)點(diǎn),引起了研究者們極大的興趣。本文主要綜述了近年來(lái)手性配體交換毛細(xì)管電泳法在氨基酸的手性分析中的應(yīng)用研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞:手性配體交換毛細(xì)管電泳;D,L-氨基酸;手性分析;綜述

眾所周知,手性是自然界的基本屬性。一方面,手性問(wèn)題與生命體的起源、生存和演化有著密切的聯(lián)系,人們已在星際碎冰樣品及墜落于地球表面的碳質(zhì)球粒隕石(如:默奇森隕石)樣品中探索到了數(shù)種手性分子,并發(fā)現(xiàn)其中的左旋異纈氨酸的含量比右旋異纈氨酸高出18%,這表明來(lái)自外太空的手性分子可能參與了地球原始生命的起源[1];另一方面,構(gòu)成生命體的許多常見(jiàn)的生物分子(如:氨基酸、蛋白質(zhì)、核苷酸、DNA和糖等)都具有手性結(jié)構(gòu),雖然這些手性分子的對(duì)映異構(gòu)體在化學(xué)及物理特性上大致相同,但兩者在生命體內(nèi)的組成及其所起的作用卻存在著極大差別。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單元,且大多數(shù)氨基酸都存在D型和L型兩種對(duì)映異構(gòu)體,但L-氨基酸與D-氨基酸的生理活性卻并不相同,L-氨基酸是人體重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),并被廣泛地應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域;而D-氨基酸的濃度變化則與一些重要的生理疾病息息相關(guān)(如:阿爾茲海默癥、精神分裂癥等)[2];組成生物酶的氨基酸中,如用D-氨基酸來(lái)取代其中的L-氨基酸,酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)就會(huì)被破壞,就會(huì)引起酶活性的降低甚至喪失。由此可見(jiàn),氨基酸的手性問(wèn)題不僅僅是一個(gè)化學(xué)問(wèn)題,也是一個(gè)與藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、生命科學(xué)等研究領(lǐng)域密切相關(guān)的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。因此,建立高效的氨基酸對(duì)映體手性分離分析方法具有重要的研究意義。

目前,常用的針對(duì)氨基酸對(duì)映體的手性分析方法包括化學(xué)法、結(jié)晶法、膜法、酶法、比色法、分光光度法、電化學(xué)法和色譜法等。其中,色譜手性分析方法可分為高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法和毛細(xì)管電泳法等。毛細(xì)管電泳法是一種新型的手性分析方法,具有高效、快速、自動(dòng)化、多模式、樣品和試劑用量少等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái),毛細(xì)管電泳法被廣泛應(yīng)用于氨基酸對(duì)映體的手性分析中。在毛細(xì)管電泳手性分析法中,常用的手性選擇劑包括:環(huán)糊精(cyclodextrin, CD)、蛋白質(zhì)、大環(huán)抗生素、冠醚和金屬?gòu)?fù)合物等。其中,以金屬?gòu)?fù)合物為手性選擇劑的毛細(xì)管電泳法稱為手性配體交換毛細(xì)管電泳法(chiral ligand exchange capillary electrophoresis, CLE-CE)。

俄羅斯科學(xué)家Davankov等[3]于1971年最先提出構(gòu)建手性配體交換液相色譜手性分析方法的理念,其原理如圖1所示,金屬離子和手性配體會(huì)形成較穩(wěn)定的二元復(fù)合物,當(dāng)被分析物(D-手性對(duì)映體或L-手性對(duì)映體)與手性配體發(fā)生配體交換作用時(shí),會(huì)形成新的三元金屬?gòu)?fù)合物,新形成的基于D-手性對(duì)映體及L-手性對(duì)映體的三元金屬?gòu)?fù)合物之間的穩(wěn)定性會(huì)出現(xiàn)差異,因此,它們會(huì)按照各自色譜保留行為的不同而依次流過(guò)液相色譜的檢測(cè)窗口,由此而實(shí)現(xiàn)了對(duì)映體的手性分離。

圖2　手性配體交換毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離機(jī)理示意圖Fig. 2　Illustration of chiral ligand exchange capillary zone electrophoresis separation mechanismL-AA: L-amino acid; D-AA: D-amino acid. EOF: electroosmotic flow.

M: central ionSel: selectorA: analyte

圖 1手性配體交換機(jī)理示意圖

Fig. 1Illustration of chiral ligand exchange mechanism

1985年,美國(guó)斯坦福大學(xué)的Gassmann及Zare等[4]首次將手性配體交換的原理引入到毛細(xì)管電泳中,并成功采用CLE-CE分離了氨基酸對(duì)映體。隨后,不同的研究小組建立了一系列的CLE-CE新體系,并將其應(yīng)用于氨基酸的手性分離分析研究中,其研究結(jié)果充分展示了CLE-CE在氨基酸的手性分析中所具有的重要的應(yīng)用潛力。本文主要綜述了近年來(lái)CLE-CE在氨基酸手性分析中的應(yīng)用研究進(jìn)展。

1毛細(xì)管區(qū)帶電泳手性分析

1.1手性氨基酸配體

以氨基酸作為配體的CLE-CE體系中,最常用的中心離子為Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)。Gassmann和Zare等[4]于1985年建立了以Cu(Ⅱ)為中心離子,以L-組氨酸為手性配體的CLE-CE體系,并實(shí)現(xiàn)了數(shù)對(duì)丹酰氯衍生的氨基酸的手性分離。隨后,人們建立了一系列以Cu(Ⅱ)為中心離子,以氨基酸為手性配體的CLE-CE體系。如:Yuan等[5]以Cu(Ⅱ)-L-精氨酸為手性選擇劑,在15 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了6對(duì)丹酰氯衍生的D,L-氨基酸的良好分離(手性分離度介于1.1及2.3之間);他們還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),若以Co(Ⅱ)和Ni(Ⅱ)等過(guò)渡金屬離子來(lái)取代Cu(Ⅱ)作為中心離子,或者將配體取代為L(zhǎng)-谷氨酸、L-丙氨酸和L-天冬氨酸時(shí),其手性識(shí)別能力會(huì)顯著下降,甚至?xí)耆珕适涫中苑蛛x能力。此研究結(jié)果表明:氨基酸的手性識(shí)別效率與三元金屬?gòu)?fù)合物的性質(zhì)密切相關(guān)。Lu等[6]構(gòu)建了以Cu(Ⅱ)-L-賴氨酸為手性選擇劑的CLE-CE體系,并實(shí)現(xiàn)了4對(duì)非衍生氨基酸的高效手性分離。Lecnik等[7]發(fā)展了基于Cu(Ⅱ)-L-脯氨酸的CLE-CE體系并用于分離非衍生氨基酸對(duì)映體,并發(fā)現(xiàn)此體系的手性分析效率較低。Zheng等[8]建立了基于Cu(Ⅱ)-L-纈氨酸手性選擇劑的CLE-CE體系,同時(shí)實(shí)現(xiàn)了11對(duì)丹酰氯衍生氨基酸對(duì)映體和2對(duì)非衍生氨基酸對(duì)映體的良好手性分離;后來(lái),他們[9]還發(fā)展了基于Cu(Ⅱ)-L-鳥(niǎo)氨酸復(fù)合物的CLE-CE體系,實(shí)現(xiàn)了丹酰氯衍生氨基酸對(duì)映體的高效分離。Zhao等[10]采用Cu(Ⅱ)-L-谷氨酸作為手性選擇劑,開(kāi)展了3對(duì)非衍生氨基酸對(duì)映體(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)的CLE-CE手性分析研究。Mohr等[11]構(gòu)建了以L-苯丙酰胺、L-賴氨酸和L-蘇氨酸為配體的CLE-CE體系,同時(shí)還考察了不同中心金屬離子(包括Cu(Ⅱ)、Co(Ⅱ)和Ni(Ⅱ)等)對(duì)氨基酸對(duì)映體手性分離效率的影響,發(fā)現(xiàn):采用Cu(Ⅱ)-L-賴氨酸體系能獲得最佳的手性分離效果,其中,丹酰氯衍生的D,L-甲硫氨酸的手性分離度高達(dá)17.0。除上述各研究小組所發(fā)展的以Cu(Ⅱ)為中心離子的CLE-CE體系以外,我們實(shí)驗(yàn)室還發(fā)展了一系列以Zn(Ⅱ)為中心離子,以不同的氨基酸為配體的CLE-CE新體系,實(shí)現(xiàn)了3對(duì)未衍生芳香族氨基酸對(duì)映體的基線分離及4對(duì)芴基甲酯衍生的脂肪族氨基酸對(duì)映體的部分分離[12];之后,我們優(yōu)化了基于Zn(Ⅱ)-L-賴氨酸復(fù)合物的CLE-CE分離體系,發(fā)現(xiàn)芳香族氨基酸對(duì)映體的手性分離度可達(dá)7.09[13],還發(fā)現(xiàn):當(dāng)采用D-賴氨酸作為配體時(shí),氨基酸手性對(duì)映體的遷移順序發(fā)生了變化,這表明中心離子與手性配體所形成的三元金屬?gòu)?fù)合物的結(jié)構(gòu)是影響被分析物遷移順序的關(guān)鍵因素;我們進(jìn)一步構(gòu)建了基于Zn(Ⅱ)-L-鳥(niǎo)氨酸手性選擇劑的CLE-CE體系,實(shí)現(xiàn)了3對(duì)非衍生芳香族氨基酸對(duì)映體和4對(duì)丹酰氯衍生氨基酸對(duì)映體的基線分離[14]。

在毛細(xì)管區(qū)帶電泳體系中,若僅采用單一手性選擇劑,有時(shí)并不能獲得令人滿意的手性分離效果,研究者們發(fā)現(xiàn):當(dāng)在所建立的體系中再引入另外一個(gè)手性選擇劑來(lái)構(gòu)成雙手性選擇劑體系時(shí),其手性分離效率將會(huì)得到明顯地改善。眾所周知,CD是一類毛細(xì)管區(qū)帶電泳中最常用的手性選擇劑,為了提高分析物的手性分離效率,人們嘗試著將其引入CLE-CE體系中。Zheng等[15]發(fā)展了以Mn(Ⅱ)-L-丙氨酸和β-CD作為雙手性選擇劑的CLE-CE體系,并實(shí)現(xiàn)了3對(duì)丹酰氯衍生的氨基酸對(duì)映體的有效分離。我們實(shí)驗(yàn)室亦發(fā)現(xiàn):將β-CD引入Zn(Ⅱ)-L-纈氨酸體系中時(shí),確實(shí)能明顯改善CLE-CE的手性分析效率;進(jìn)一步采用此雙手性選擇劑體系,實(shí)現(xiàn)了3對(duì)非衍生氨基酸對(duì)映體和12對(duì)丹酰氯衍生的氨基酸對(duì)映體的良好手性分離[16]。隨后,我們又分別建立了以β-CD作為手性添加劑的Zn(Ⅱ)-L-丙氨酸和Zn(Ⅱ)-L-亮氨酸CLE-CE體系,利用β-CD的手性分離協(xié)同作用,實(shí)現(xiàn)了丹酰氯衍生的氨基酸對(duì)映體的高效分離[17,18]。上述研究結(jié)果表明:在CLE-CE體系中引入其他種類的手性選擇劑時(shí),第二手性選擇劑所起的手性分離協(xié)同作用的確有利于提高CLE-CE體系的手性分離效率。

1.2手性氨基酰胺配體

Chen等[19]于2002年發(fā)展了以Cu(Ⅱ)-L-氨基酰胺(包括L-苯丙酰胺、L-脯氨酰胺和L-丙氨酰胺)為手性選擇劑的CLE-CE體系,并發(fā)現(xiàn):以不同的氨基酰胺為手性配體時(shí),其對(duì)丹酰氯衍生氨基酸對(duì)映體的手性識(shí)別效率和對(duì)映體的遷移順序是不同的,當(dāng)以Cu(Ⅱ)-L-苯丙酰胺和Cu(Ⅱ)-L-丙氨酰胺作為手性選擇劑時(shí),L-對(duì)映體的遷移速度比D-對(duì)映體快,而當(dāng)以Cu(Ⅱ)-L-脯氨酰胺為手性選擇劑時(shí),D-對(duì)映體的遷移速度更快;他們還對(duì)比了以Cu(Ⅱ)-L-氨基酰胺作為手性選擇劑時(shí),氨基酸對(duì)映體在不同體系(包括毛細(xì)管電泳體系、毛細(xì)管電色譜體系和微柱液相色譜體系)中的手性分離效率和遷移順序[20],結(jié)果發(fā)現(xiàn):在毛細(xì)管電色譜體系和微柱液相色譜體系中,D-對(duì)映體的遷移速度比L-對(duì)映體快,但例外的是,在毛細(xì)管電色譜體系中,丹酰氯衍生的L-絲氨酸的遷移速度更快?；诖爽F(xiàn)象,Chen等[21]對(duì)不同體系的手性識(shí)別機(jī)理和對(duì)映體遷移順序差異的機(jī)理進(jìn)行了探討,還采用紫外光譜研究了不同pH條件下,Cu(Ⅱ)-L-脯氨酰胺復(fù)合物的存在形式和種類,他們發(fā)現(xiàn):隨著電泳緩沖液pH的增加,Cu(Ⅱ)-L-脯氨酰胺復(fù)合物的最大紫外吸收波長(zhǎng)逐漸向短波長(zhǎng)移動(dòng),表明在不同pH的緩沖溶液中,Cu(Ⅱ)-L-脯氨酰胺復(fù)合物有不同的存在形式,繼而產(chǎn)生了不同的手性分離效果。我們實(shí)驗(yàn)室近年構(gòu)建了以Zn(Ⅱ)為中心離子,以L-氨基酰胺為手性配體的CLE-CE體系,實(shí)現(xiàn)了丹酰氯衍生氨基酸對(duì)映體的高效分離[22,23],并發(fā)現(xiàn):以不同的氨基酰胺作為手性配體的CLE-CE體系具有不同的手性分析效果和不同的對(duì)映體遷移順序,當(dāng)以L-丙氨酰胺為手性配體時(shí),D-氨基酸遷移速度較快[22],而以L-脯氨酰胺為手性配體時(shí),L-氨基酸遷移速度更快[23],我們的研究結(jié)果與文獻(xiàn)[19]所報(bào)道的現(xiàn)象相反,這可能是由于中心離子不同,所形成的三元金屬?gòu)?fù)合物結(jié)構(gòu)不同,因而導(dǎo)致所構(gòu)建的CLE-CE體系的手性識(shí)別能力和氨基酸對(duì)映體的遷移順序不同。

1.3手性氨基酸離子液體配體

1.4其他手性配體

除了氨基酸、氨基酰胺和氨基酸離子液體以外,還有一些氨基酸衍生物和糖類也被人們作為CLE-CE體系中的手性配體而應(yīng)用于氨基酸對(duì)映體的手性分析研究中。如:Végvári等[34]以N-2-羥辛基-L-4-羥基脯氨酸作為手性配體,以Cu(Ⅱ)作為中心離子構(gòu)建了CLE-CE體系,并實(shí)現(xiàn)了對(duì)非衍生氨基酸對(duì)映體的有效手性分離。Schmid等[35]發(fā)展了以L-4-羥基脯氨酸衍生物(包括L-4-羥基脯氨酸、N-2-羥丙基-L-4-羥基脯氨酸和N-2-羥辛基-L-4-羥基脯氨酸)作為手性配體的CLE-CE體系,并對(duì)比了不同體系對(duì)氨基酸對(duì)映體和二肽對(duì)映體的手性分離效率的差異。我們實(shí)驗(yàn)室建立了以Zn(Ⅱ)為中心離子,以L-羥基脯氨酸為手性配體的CLE-CE體系,發(fā)現(xiàn)其對(duì)氨基酸對(duì)映體和二肽對(duì)映體的手性分離效果不夠理想,因而引入了γ-CD作為第二手性選擇劑,利用γ-CD的協(xié)同手性分離作用,顯著提高了氨基酸對(duì)映體和二肽對(duì)映體的手性分離效率[36]。我們還依據(jù)密度泛函理論,采用計(jì)算模擬法對(duì)CLE-CE體系中金屬配合物的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究,并對(duì)環(huán)糊精和L-羥脯氨酸金屬配合物的協(xié)同作用機(jī)理進(jìn)行了初步探討。Gozel等[37]以Cu(Ⅱ)-L-阿斯巴甜復(fù)合物作為手性選擇劑,在12 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了14對(duì)丹酰氯衍生氨基酸對(duì)映體的基線分離,他們發(fā)現(xiàn):與Cu(Ⅱ)-L-組氨酸體系相比,基于Cu(Ⅱ)-L-阿斯巴甜復(fù)合物的CLE-CE體系能明顯改善氨基酸對(duì)映體的手性分離效率。H?dl等[38]將3種不同的糖酸作為手性配體,對(duì)比了不同中心離子的CLE-CE體系對(duì)氨基酸對(duì)映體和二肽對(duì)映體的手性分離分析效率的影響。

2膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳手性分析

在進(jìn)行氨基酸對(duì)映體混合樣品的手性分離分析時(shí),研究者們發(fā)現(xiàn):在電泳緩沖液中加入表面活性劑能明顯改善氨基酸混合樣品的手性分離效率,同時(shí),還會(huì)對(duì)氨基酸對(duì)映體的遷移順序產(chǎn)生一定的影響。如:Sundin等[39]合成了N,N-二癸基-D-丙氨酸,以其作為手性配體,以Cu(Ⅱ)作為中心離子,開(kāi)展了丹酰氯衍生氨基酸對(duì)映體混合物的手性分離分析研究,為了改善Cu(Ⅱ)-N,N-二癸基-D-丙氨酸復(fù)合物的溶解性,他們?cè)陔娪揪彌_液中加入了十二烷基硫酸鈉,采用膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳分離模式進(jìn)行了氨基酸對(duì)映體混合物的CLE-CE手性分析研究。Chen等[40]采用以Cu(Ⅱ)-L-羥基脯氨酸作為手性選擇劑的膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳分離模式分析了氨基酸對(duì)映體混合物,發(fā)現(xiàn):陰離子型表面活性劑(包括十二烷基硫酸鈉、癸基硫酸鈉、十四烷基硫酸鈉等)不僅可以改善氨基酸對(duì)映體的分離效率,還可以改變氨基酸對(duì)映體的遷移順序;他們還發(fā)現(xiàn):在所建立的CLE-CE體系中添加非離子表面活性劑(聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸)時(shí),雖然能改善氨基酸對(duì)映體的手性分離效率,但樣品的遷移時(shí)間會(huì)明顯增長(zhǎng);而在電泳緩沖液中加入陽(yáng)離子表面活性劑(溴化十六烷基三甲銨)時(shí),雖然可改變電滲流的方向,但并不能提高氨基酸對(duì)映體的手性分離效率。他們繼續(xù)研究了兩類不同的陰離子型表面活性劑,即線型烷基苯磺酸鹽(LAS-C8、LAS-C10和LAS-C12)和直鏈烷基硫酸鹽(癸基硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉和十四烷基硫酸鈉)，對(duì)氨基酸對(duì)映體的CLE-CE手性分離效率的影響[41],還研究了以不同構(gòu)型的氨基酸(如:D-脯氨酸、L-脯氨酸、反式-4-羥基脯氨酸、順式-4-羥基脯氨酸)作為CLE-CE體系的手性配體時(shí),電泳緩沖液中所加入的十二烷基硫酸鈉對(duì)氨基酸對(duì)映體遷移順序和手性分離效率的影響[42]。Chen等[21]研究發(fā)現(xiàn):在以Cu(Ⅱ)-L-脯氨酰胺為手性選擇劑的CLE-CE體系中加入十二烷基硫酸鈉,不會(huì)引起氨基酸對(duì)映體的遷移順序的改變,但會(huì)顯著改善其手性分離效率。Lu等[6]將十二烷基硫酸鈉作為添加劑應(yīng)用于以Cu(Ⅱ)-L-賴氨酸復(fù)合物為手性選擇劑的CLE-CE體系中,實(shí)現(xiàn)了對(duì)混合氨基酸樣品的良好手性分離;同時(shí),他們還發(fā)現(xiàn):加入十二烷基硫酸鈉后,氨基酸對(duì)映體的遷移順序發(fā)生了改變,在毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離模式中D-氨基酸對(duì)映體的遷移速度更快,但在膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳分離模式中L-氨基酸對(duì)映體的遷移速度更快。Zheng等[8,43]構(gòu)建了以Cu(Ⅱ)-L-纈氨酸復(fù)合物及Cu(Ⅱ)-D-纈氨酸復(fù)合物為手性選擇劑的CLE-CE體系,以十二烷基硫酸鈉為添加劑,采用膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳分離模式,分別實(shí)現(xiàn)了未衍生氨基酸對(duì)映體和丹酰氯衍生的氨基酸對(duì)映體的混合樣品的良好手性分離。手性配體交換膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳分離機(jī)理示意圖見(jiàn)圖3。

圖3　手性配體交換膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳分離機(jī)理示意圖Fig. 3　Illustration of chiral ligand exchange micellar electrokinetic chromatography separation mechanismSDS: sodium dodecyl sulfate.

3毛細(xì)管電色譜手性分析

毛細(xì)管電色譜法是結(jié)合了高效液相色譜和高效毛細(xì)管電泳二者優(yōu)點(diǎn)的新型分離方法。近年來(lái),研究者們也嘗試將手性配體交換和毛細(xì)管電色譜結(jié)合進(jìn)行氨基酸的手性分離分析研究。如:Schmid等[44]于2000年以甲基丙烯酸為單體,以對(duì)二氮己環(huán)丙烯酰胺為交聯(lián)劑,以乙烯基磺酸為產(chǎn)生電滲流的物質(zhì),以N-(2-羥基-3-烯丙氧基)-L-4-羥基脯氨酸為手性選擇劑,以過(guò)硫酸銨和四甲基乙二胺為引發(fā)劑,在毛細(xì)管內(nèi)原位聚合制備了具有良好手性選擇性的手性固定相,采用CLE-CE實(shí)現(xiàn)了9對(duì)氨基酸對(duì)映體的良好分離。Chen等[45]使用溶膠-凝膠法制備了具有良好機(jī)械強(qiáng)度和滲透性的硅膠基質(zhì)整體柱,在其表面化學(xué)鍵合L-苯丙酰胺,得到了手性硅膠整體柱,并成功地將其應(yīng)用于丹酰氯衍生的氨基酸對(duì)映體的CLE-CE手性分離分析研究中。Nishiyama等[46]制備了L-賴氨酰胺修飾的手性硅膠整體柱,采用毛細(xì)管電色譜法和微柱高效液相色譜法,開(kāi)展了丹酰氯衍生的氨基酸對(duì)映體的CLE-CE手性分離分析研究,并對(duì)比了其分離結(jié)果。Pittler等[47]制備了兩種硅膠基質(zhì)手性固定相,一種是L-4-羥基脯氨酸化學(xué)修飾的手性固定相,一種是N-癸基L-4-羥基脯氨酸動(dòng)態(tài)涂覆在毛細(xì)管壁的手性固定相,他們發(fā)現(xiàn):化學(xué)鍵合的手性固定相在氨基酸對(duì)映體和二肽對(duì)映體的手性分離中效果更好,而動(dòng)態(tài)涂覆的手性固定相在羥基酸對(duì)映體的CLE-CE手性分離中顯示出了其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

手性配體交換毛細(xì)管電色譜分離機(jī)理示意圖見(jiàn)圖4。

圖4　手性配體交換毛細(xì)管電色譜分離機(jī)理示意圖Fig. 4　Illustration of ligand exchange capillary electrochromatography separation mechanism on the chiral stationary phase

4應(yīng)用

CLE-CE具有高效、快速、樣品用量少和對(duì)映體遷移順序可調(diào)等優(yōu)點(diǎn),在氨基酸對(duì)映體的手性分離中顯示出其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。由于手性氨基酸具有重要的生理意義,而且它們?cè)隗w內(nèi)的代謝與氨基酸酶(如D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶、氨基酸消旋酶、L-天冬酰胺酶等)密不可分,且與白血病、帕金森病及精神分裂癥等疾病具有重要的聯(lián)系,因此,開(kāi)展基于CLE-CE的氨基酸手性分析研究、氨基酸酶的酶動(dòng)力學(xué)研究及氨基酸酶的酶抑制劑篩選研究在生命分析領(lǐng)域具有重要的研究意義和深遠(yuǎn)的應(yīng)用前景。

我們實(shí)驗(yàn)室建立了以Zn(Ⅱ)-L-鳥(niǎo)氨酸復(fù)合物為手性選擇劑的CLE-CE體系,以D-色氨酸作為D-氨基酸氧化酶的底物,將所發(fā)展的CLE-CE方法率先用于D-氨基酸氧化酶的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究中[14]。近年來(lái),我們還將本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建的一系列高效CLE-CE新體系應(yīng)用于L-氨基酸氧化酶[16,32]、L-酪氨酸氧化酶[17,18]、L-天冬酰胺酶[29]的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究及酶的抑制劑篩選[17,18,23,28,30,48]研究中;不僅開(kāi)展了氨基酸對(duì)映體及二肽的純度分析[36],而且還將所構(gòu)建的CLE-CE體系用于活體鼠腎缺血模型中D-氨基酸氧化酶的酶活性分析研究[22];并進(jìn)一步采用CLE-CE方法對(duì)所制備的新型酶反應(yīng)器進(jìn)行了酶性能的評(píng)價(jià)研究,探索了固定化L-天冬酰胺酶在急性淋巴細(xì)胞白血病治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值[29]。

5總結(jié)與展望

CLE-CE自1985年首次由美國(guó)科學(xué)家Gassmann及Zare提出以來(lái),已引起了人們?cè)絹?lái)越濃厚的研究興趣。近年來(lái),雖然研究者們已通過(guò)開(kāi)發(fā)不同的中心離子和手性配體,建立了一系列高效的CLE-CE新體系,并應(yīng)用于氨基酸、羥基酸和小肽等對(duì)映體的手性分離分析及氨基酸酶的酶反應(yīng)研究中,但迄今為止,CLE-CE的研究依然面臨著一些困難和挑戰(zhàn),如:目前中心離子(主要局限于Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)及Mn(Ⅱ)等)和手性配體(主要局限于氨基酸、氨基酸衍生物、氨基酰胺、氨基酸離子液體等)的種類有限,分析對(duì)象(一般為具有羥基、氨基和羧基等基團(tuán)的化合物)的范圍較窄,CLE-CE機(jī)理研究和基于CLE-CE的生物樣品的分析應(yīng)用仍然較少等。而這些難題的解決將會(huì)極大地推進(jìn)CLE-CE方法和毛細(xì)管電泳技術(shù)的發(fā)展,因此,研究者們?cè)谖磥?lái)尚需開(kāi)發(fā)更多的新配體,構(gòu)建更新穎的CLE-CE體系,深入研究其機(jī)理,并需進(jìn)一步拓展其應(yīng)用范圍。合成制備多種金屬配位能力強(qiáng)且易于發(fā)生配體交換作用的新型手性配體應(yīng)是未來(lái)人們解決這些疑難問(wèn)題的關(guān)鍵,開(kāi)拓多元手性選擇劑亦是提高CLE-CE手性分離效率的途徑之一,而引入更多的熱力學(xué)理論計(jì)算模型并通過(guò)分析手性分離過(guò)程中的熱、熵、焓等多種參數(shù)的變化是未來(lái)人們深入開(kāi)展CLE-CE機(jī)理研究的有效通道;研究者們今后還應(yīng)將所建立的高效CLE-CE體系進(jìn)一步用于藥物分析、手性新藥開(kāi)發(fā)、酶型藥物評(píng)價(jià)、疾病診療及活體分析等領(lǐng)域,以推進(jìn)CLE-CE方法和毛細(xì)管電泳技術(shù)的快速深入發(fā)展。

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Development of chiral ligand exchange capillary electrophoresis for enantioseparation of D,L-amino acids

MU Xiaoyu1,2, QI Li1*, SU Yuan1,3, QIAO Juan1, CHEN Yi1

(1. Key Laboratory of Analytical Chemistry for Living Biosystems, Institute of Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;3. Shandong Agricultural University, Taian 271018, China)

Abstract:Enantioseparation of D,L-amino acids is of great significance in life science. As one of the most useful methods, chiral ligand exchange capillary electrophoresis possesses many advantages, including high efficiency, fast speed and tunable migration order, and it has attracted great research interest. This review summarizes the development of chiral ligand exchange capillary electrophoresis for enantioseparation of D,L-amino acids in recent years.

Key words:chiral ligand exchange capillary electrophoresis (CLE-CE); D,L-amino acids; enantioseparation; review

DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.05038

*收稿日期:2015-05-28

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21175138,21321003).

中圖分類號(hào):O658

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1000-8713(2016)01-0021-07

色譜手性分離?？Ｕ撆c綜述

*通訊聯(lián)系人.Tel:(010)82627290,E-mail:qili@iccas.ac.cn.

Foundation item: Project of the National Natural Science Foundation of China (Nos. 21175138, 21321003).