吳海霞,　王東強,　趙見超,　柯燕雄*,　梁鑫淼,2

(1. 華東理工大學藥學院, 上海 200237; 2. 中國科學院大連化學物理研究所, 遼寧 大連 116023)

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奎寧-冠醚組合型手性固定相直接拆分氨基酸的機理

吳海霞1,王東強1,趙見超1,柯燕雄1*,梁鑫淼1,2

(1. 華東理工大學藥學院, 上海 200237; 2. 中國科學院大連化學物理研究所, 遼寧 大連 116023)

摘要:合成了一種新型奎寧-冠醚組合型手性固定相(QN-CR CSP)并用于氨基酸手性對映體的直接拆分,該固定相對12種氨基酸對映體有良好的手性拆分能力。基于氨基酸手性識別中離子交換和絡合的協(xié)同作用,建立了一種新型的等溫吸附模型。通過迎頭特殊點洗脫法(FACP)測定色氨酸(Trp)在不同金屬離子添加劑條件下的等溫吸附線,驗證了模型的合理性。流動相中的Li+、Na+、K+等金屬離子與氨基酸競爭固定相中的冠醚絡合位點,隨著金屬離子與冠醚的絡合作用力和絡合吸附平衡常數(shù)增大,固定相對Trp的手性拆分能力下降。該模型的建立對理解氨基酸在此類固定相中的手性保留行為以及固定相結構的進一步優(yōu)化具有重要意義。

關鍵詞:手性固定相;奎寧;冠醚;離子交換;絡合;等溫吸附線;氨基酸;手性拆分

蛋白質組學、臨床診斷和食品分析等領域均涉及氨基酸的手性分析與拆分。氨基酸的拆分方法包括化學拆分法、色譜拆分法、酶拆分法和誘導結晶法等,其中色譜法因高效、可靠、精確而得到廣泛應用[1]?；诓煌中宰R別機理的手性固定相相繼被研制出來,如涂覆、化學鍵合手性配體[2]以及手性冠醚[3-6]等,這些手性固定相對氨基酸具有不同的手性識別機理,例如通過奎寧的離子交換作用[7-9]和冠醚的絡合作用[3-6]對氨基酸進行手性拆分。本課題組制備了奎寧-冠醚組合型手性固定相[10],固定相與氨基酸的作用模式如圖1所示。通過離子交換和絡合的協(xié)同作用,對氨基酸的手性對映體有良好的拆分能力。

圖1　奎寧-冠醚組合型手性固定相與氨基酸的作用模式Fig. 1　Action model between chiral stationary phase combined with quinine and crown ether and amino acids

1998年,Fornstedt等[11]通過測定手性對映體在固定相上的等溫吸附線證實了手性固定相表面是不均勻的。多數(shù)鍵合型手性固定相表面的作用位點可分為手性作用位點和非手性作用位點[12,13],手性作用位點主要影響化合物的選擇性。通過測定手性對映體在固定相表面的等溫吸附線,分析了其在固定相表面的吸附行為,這對揭示手性拆分機理以及固定相結構的進一步優(yōu)化具有重要的意義,該方法已經(jīng)廣泛應用于手性固定相的研究領域[14-16]。

理想色譜模型下,譜帶的遷移方程如下:

(1)

公式(1)中,C為流動相中溶質的濃度,q為溶質在固定相中的平衡濃度,F為相比,u為流動相的線速度,t為時間變量,z為軸向位置變量。

矩形濃度進樣[15]時,吸附容量的計算公式為:

(2)

其中C為樣品在流動相中的濃度,V0為死體積,Vp為進樣體積,Va為色譜柱中固定相的體積,VR(C)為濃度為C時的洗脫體積,q(C)為濃度為C時固定相的吸附容量。

通過測定不同濃度下樣品在固定相中的吸附容量,可以獲得樣品的等溫吸附線。目前測定等溫吸附線的方法主要有迎頭分析(FA)法、特殊點洗脫(ECP)法和迎頭特殊點洗脫(FACP)法[17]。其中FACP法相對簡單,準確度較高,因此本文采用FACP法測定Trp在奎寧-冠醚組合型固定相上的等溫吸附線,建立了Trp的等溫吸附模型,并對Trp在固定相上的手性拆分機理進行了研究。

1實驗部分

1.1實驗儀器與試劑

Waters高效液相色譜儀配備515型HPLC泵、1500型柱溫箱和2996型紫外檢測器(美國Waters公司); KH5200B型超聲波清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司); Milli-Q超純水發(fā)生器(美國Millipore公司)。

氨基酸(純度>95%)、甲酸(FA)、二乙胺(DEA)、高氯酸鋰(LiClO4)、奎寧(QN)和三乙胺(TEA)均購自阿拉丁試劑(上海)有限公司;甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)、乙醇(EtOH)、4-硝基苯基氯甲酸酯和γ-巰丙基三甲氧基硅烷購自北京百靈威科技有限公司;氫氧化鋰(LiOH5H2O)、氫氧化鈉(NaOH)、氫氧化鉀(KOH)和硼氫化鈉(NaBH4)均購自上海凌峰化學試劑有限公司;球形硅膠(粒徑為5 μm,比表面積為300 m2/g)由華譜新創(chuàng)科技有限公司提供;3′-苯并十八冠-6-醚、活化奎寧[10]和(1S,2S)-2-氨基環(huán)己基苯基氨基甲酸酯[18]根據(jù)文獻合成;實驗用水均為超純水。

1.2奎寧-冠醚組合型手性固定相(QN-CR CSP)的制備

QN-CR CSP的合成過程如下:3′-苯并十八冠-6-醚(C-1)與(1S,2S)-2-氨基環(huán)己基苯基氨基甲酸酯經(jīng)縮合反應得到席夫堿,其經(jīng)硼氫化鈉還原得C-2。將C-2經(jīng)氯乙?；桶彼苯夥磻肅-3,其與4-硝基苯基氯甲酸酯活化的奎寧C-4反應制得選擇器C-5。選擇器C-5與γ-巰丙基三乙氧基硅烷修飾的硅膠經(jīng)自由基加成反應得固定相QN-CR CSP。最后將其置于20 mL乙醇中勻漿,以乙醇為頂替液在50 MPa下填裝于不銹鋼柱管(150 mm×4.6 mm)中。合成路線見圖2。

1.3等溫吸附線的測定

色譜條件:流動相為80%(體積分數(shù))MeOH-120 mmol/L FA-60 mmol/L MOH(MOH中的M代表不同的陽離子,分別為Li、Na和K);流速為0.8 mL/min;檢測波長為254和305 nm;色譜柱為QN-CR CSP(150 mm×4.6 mm, 150 μm);柱溫為30 ℃。用1,3,5-三叔丁基苯測定死時間為2.21 min。

采用FACP法測定氨基酸的等溫吸附線,實驗配置的定量環(huán)為5 mL。為保證進樣濃度分布接近矩形濃度,采用截點進樣(cut up injection)的方式進樣[19],進樣時間為3.5 min。

圖2　QN-CR CSP的合成路線Fig. 2　Synthesis route of QN-CR CSP

Analytek1αRsEOMpAnalytek1αRsEOMpPhg3.981.312.04DAPhe1.781.401.91DATrp2.591.943.65DBTyr1.501.903.84DBVal1.931.802.87DAIle2.551.211.46DASer2.871.422.44n.d.CThr3.361.171.06n.d.C3.761.11<0.5DC6.061.04<0.5DA

k1: retention factor;α: selectivity factor;Rs: resolution; EO: first configuration enantiomer peak; n. d.: not determined; Mp: mobile phase; A: MeOH (methanol)-FA (formic acid)-DEA (diethylamine) (100∶0.1∶0.1, v/v/v); B: MeOH-25 mmol/L FA-12.5 mmol/L TEA (triethylamine); C: 90% (v/v) ACN (acetonitrile)-5 mmol/L LiClO4.

2結果與討論

2.1手性固定相的表征

手性選擇器C-5的1H-NMR(CDCl3) (δ值)數(shù)據(jù):1.25(t,3H),1.46～1.48(t,2H),1.60(s,1H),1.71(s,2H),1.84(s,1H),2.03(s,2H),2.11(s,2H),2.27(s,2H),3.00(d,1H),3.38(t,1H),3.59(s,2H),3.65(s,7H),3.73(s,4H),3.88～3.93(m,6H),4.11～4.16(m,6H),4.29(s,2H),4.41(d,1H),4.61(s,1H),4.76(d,1H),4.90～4.95(t,2H),5.42(s,1H),6.63(d,1H),6.78(d,1H),6.89～6.96(t,2H),7.21(t,2H),7.35～7.44(m,6H),7.89(s,1H),8.10(d,1H),8.28(s,1H),8.72(s,1H)。

2.2氨基酸手性對映體的分離

選取系列氨基酸對映體為分析物對QN-CR CSP的手性拆分性能進行評價,其中12個氨基酸能夠得到拆分(見表1),在該固定相上,D-型氨基酸在色譜柱中首先被洗脫。色譜柱對Trp和Tyr的手性拆分能力尤為出色(見圖3),手性選擇因子(α)分別為1.94和1.90。

2.3陽離子對手性選擇性的影響

固定相結構中的18冠-6基團對Li+、Na+和K+等陽離子產(chǎn)生絡合作用[20,21],本文通過在流動相中添加不同的陽離子,考察了Trp在不同陽離子存在條件下的保留情況和手性選擇性,結果見圖4。隨Li+、Na+和K+半徑依次增加,Trp的保留時間變短,手性選擇性下降。流動相中的金屬離子與Trp中的氨基競爭冠醚的絡合位點,其中K+與18冠-6的絡合能力最強,固定相對Trp的保留和手性選擇性下降最明顯。

圖3　Trp和Tyr的手性分離Fig. 3　Enantioseparations of Trp and Tyr

圖4　Trp在不同陽離子條件下的分離Fig. 4　Separations of Trp with different cationic additives

2.4Trp的吸附等溫線

2.4.1氨基酸在QN-CR CSP上的吸附模型

對氨基酸而言,QN-CR CSP結構中存在兩種主要的活性吸附位點:離子交換位點(A)和冠醚的絡合作用位點(B)。氨基酸的羧基和離子交換位點產(chǎn)生離子交換作用,氨基與冠醚產(chǎn)生絡合作用。流動相中的陰離子(FA-)和氨基酸競爭與奎寧發(fā)生離子交換作用,金屬離子M(M為Li+、Na+或K+)和氨基酸競爭與冠醚發(fā)生絡合作用。

在推導等溫吸附方程時,做了如下假定:假定1.如果氨基酸的氨基與絡合位點相互作用,且離子交換位點和絡合作用位點的距離足夠近,其羧基會同時與離子交換位點發(fā)生靜電相互作用,所產(chǎn)生的吸附模式為AB-X,其中X代表氨基酸分子。假定2.金屬離子能夠與冠醚發(fā)生絡合作用,如果冠醚絡合位點被金屬離子所占據(jù),被金屬離子占據(jù)的位點會形成新的離子交換位點,對氨基酸產(chǎn)生吸附作用,因此隨著流動相中金屬離子的種類和濃度的變化,固定相中的離子交換位點的總量也隨著變化。假定3.氨基酸在流動相中的濃度足夠小,氨基酸分子之間的相互作用不予考慮。

根據(jù)上述假設,可以算出絡合交換和離子交換產(chǎn)生的吸附容量。具體的推導過程如下。

(1)絡合交換:

(3)

公式(3)中的KM為金屬離子與冠醚的絡合吸附平衡常數(shù)。

(4)

公式(4)中的K1為氨基酸與冠醚的絡合吸附平衡常數(shù)。

考慮金屬離子與氨基酸的絡合競爭吸附,通過絡合和靜電相互協(xié)同作用(AB-X)產(chǎn)生的氨基酸吸附容量qCR[22]為:

(5)

公式(5)中的q1為固定相中冠醚的飽和絡合吸附容量。

(2)離子交換:

(6)

公式(6)中的K2為氨基酸與離子交換位點的平衡常數(shù)。

(7)

公式(7)中的KFA為FA-與奎寧的離子交換平衡常數(shù)。

考慮氨基酸與溶液中陰離子的競爭吸附,由離子交換產(chǎn)生的吸附容量qex為:

(8)

公式(8)中的q2為固定相中離子交換飽和吸附容量。

氨基酸的總吸附容量q為:

(9)

在一定的流動相條件下,金屬離子的濃度(cM)和甲酸根離子的濃度(cFA)是固定的,上式可以改寫為如下形式:

(10)

圖5　(a)滿環(huán)進樣和截點進樣色譜峰對比圖和(b)吸光度對濃度校正曲線圖Fig. 5　(a) Comparison of the chromatographic peaks of the full-loop injection and the cut up injection and (b) the absorbance-concentration calibration curve

圖6　不同陽離子條件下Trp的等溫吸附線實驗點及非線性擬合線Fig. 6　Experimental points of Trp’s adsorptions isotherms and the nonlinear fitting lines with different cationic additives

該方程與Bi-Langmuir等溫吸附線[17]形式類似,公式(10)中K3和K4分別為與金屬離子絡合平衡和甲酸根離子交換平衡相關常數(shù),K3=1+KMcM,K4=1+KFAcFA。在流動相中金屬離子濃度相同的條件下,對于Li+、Na+和K+應有K3K>K3Na>K3Li。

由于氨基酸的結構和構型不同,不同的氨基酸與固定相的離子交換和絡合交換作用會受到π-π相互作用、氫鍵和空間位阻等因素的影響,這些相互作用會影響絡合交換常數(shù)K1和離子交換常數(shù)K2的大小。

2.4.2等溫吸附線的測定

受氨基酸溶解度的限制,試驗中使用添加不同甲酸鹽的80%(體積分數(shù))MeOH溶液以考察在更大的濃度范圍內Trp的吸附行為。實驗中采用FACP方法測定等溫吸附線,該方法的準確性主要取決于進樣濃度分布是否為矩形。因此試驗中采用了截點進樣的方式,進樣濃度分布如圖5a所示,如果將5 mL定量環(huán)中的樣品全部進樣,在進樣的后半部分由于擴散作用,進樣濃度產(chǎn)生拖尾。如果在流速為0.8 mL/min時,進樣3.5 min后立即將進樣閥切換到給樣位置,得到的進樣濃度分布非常接近矩形分布。用流動相配制0.520、1.005、2.001、4.004和4.504 mg/mL的Trp溶液,測定不同質量濃度的Trp溶液的紫外響應值,用二次方程對紫外響應值(A, AU)和質量濃度(C, mg/mL)的關系進行擬合(見圖5b),C=0.182A2+2.362A,R2=0.999 96,n=5。將試驗測定的FACP洗脫曲線用該方程轉換成洗脫質量濃度C與保留時間的關系曲線,并用公式(2)計算出不同濃度下的等溫吸附容量,結果如圖6所示。

將得到的等溫吸附數(shù)據(jù)用方程(10)進行擬合,等溫吸附方程中各個參數(shù)見表2, 在幾種不同流動相條件下都有K1DK2L,這兩種作用對手性選擇性的貢獻相反,但絡合吸附平衡常數(shù)遠大于離子交換平衡常數(shù),導致L-Trp在固定相中保留時間更長,說明絡合作用對固定相的手性選擇性起主要作用。據(jù)此,如能對固定相的手性結構進行進一步調整,使絡合交換與離子交換對Trp的手性選擇性貢獻一致,能進一步提高固定相的手性選擇性。隨著Li+、Na+、K+半徑的增大,K3值增大,這是由于隨著陽離子半徑增大,金屬離子與冠醚的絡合作用力增強。金屬離子與Trp競爭手性絡合吸附位點,絡合能力越強的金屬離子對固定相的手性選擇性影響越大,這與前面試驗中觀察到的金屬離子對手性選擇性的影響結果一致。

表 2　不同陽離子條件下Trp的等溫吸附參數(shù)

q1,q2,K1,K2,K3andK4are the same as in equation (10).

固定相的手性結構對甲酸根的離子交換沒有影響,固定相與甲酸根離子交換相關的常數(shù)K4應基本相同,在幾種流動相條件下,模型擬合得到的甲酸根與固定相的離子交換常數(shù)非常接近,符合吸附模型的預期。D-Trp在流動相含Li+、Na+和K+時的絡合平衡常數(shù)非常接近,L-Trp也是如此,該結果同樣符合模型的預測,因為Li+、Na+和K+等的競爭只是影響Trp的吸附量,對Trp的吸附平衡常數(shù)影響很小。以上結果說明該吸附模型基本上能夠反映Trp在固定相上的吸附行為。

3結論

本文報道了一種奎寧-冠醚組合型手性固定相的制備,該固定相對氨基酸的手性對映體具有良好的選擇性。根據(jù)固定相的結構特點,建立了氨基酸在固定相中的吸附模型,通過考察Li+、Na+和K+等對Trp手性選擇性以及等溫吸附線的影響,對Trp在該固定相的保留行為進行了詳細的研究。奎寧-冠醚組合型手性固定相對氨基酸的手性分離是一個復雜的過程,固定相對Trp的手性選擇性主要來源于冠醚的絡合與奎寧的離子交換的協(xié)同作用,該結果對理解氨基酸在此類固定相中的手性保留行為及固定相結構的進一步優(yōu)化具有重要的意義。

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Separation mechanism of chiral stationary phase based on quinine and crown ether for the direct stereoselective separation of amino acids

WU Haixia1, WANG Dongqiang1, ZHAO Jianchao1, KE Yanxiong1*, LIANG Xinmiao1,2

(1. School of Pharmacy, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China;2. Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China)

Abstract:A novel chiral stationary phase combining quinine and crown ether (QN-CR CSP) was developed to separate amino acid enantiomers. This CSP showed good enantioselectivity for some amino acids. Since the synergistic effect of ion exchange and complexation in chiral recognition of amino acids, a new adsorption isotherm was built. Using the method of frontal analysis by characteristic point (FACP), the adsorption isotherms of tryptophan (Trp) under different mobile phase conditions were determined and fitted the proposed adsorption isotherm model well. With the increase of the competition between metal cationic and amino to crown ether, the equilibrium constant of complexing adsorption was found increased. The chiral separation ability was decreased. The adsorption isotherm improved the understanding of the retention behavior of amino acids on QN-CR CSP, which was also benefit to optimize the structure of the stationary phase.

Key words:chiral stationary phases; quinine; crown ether; ion exchange; complexation; adsorption isotherm; amino acids; chiral separation

DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.07015

*收稿日期:2015-07-15

基金項目:國家自然科學基金項目(21375038).

中圖分類號:O658

文獻標識碼:A

文章編號:1000-8713(2016)01-0062-06

色譜手性分離?？ぱ芯空撐?/p>

*通訊聯(lián)系人.Tel:(021)642506222,E-mail:key@ecust.edu.cn.

Foundation item: Natural Science Foundation of China (Grant No. 21375038).