吳志明,　孫志遠,　李　輝,　劉勇弟

(華東理工大學資源與環(huán)境工程學院,上海 200237)

活性污泥耐鹽降解鄰氯苯酚特性及群落結構分析

吳志明,孫志遠,李輝,劉勇弟

(華東理工大學資源與環(huán)境工程學院,上海 200237)

摘要：采用SBR反應器馴化中度嗜鹽菌為主的活性污泥,高效處理高鹽鄰氯苯酚(2-CP)廢水。不同鹽度的馴化結果表明,當NaCl質量濃度為10～80 g/L時,2-CP和COD的去除率均達到91%。當NaCl質量濃度為80 g/L,2-CP質量濃度在1 000 mg/L以上時,去除率可以維持在98%,反應器達到最佳處理效果。在此條件下,活性污泥胞外聚合物(EPS)的含量最高達到142.6 mg/g。隨著鹽度升高,EPS中的多糖含量也隨之增加。采用顯微鏡和掃描電鏡(SEM)觀察,發(fā)現(xiàn)在高鹽條件下,活性污泥中大部分微生物呈現(xiàn)球狀,且菌群有自發(fā)聚集的趨勢。16S rRNA基因文庫分析表明,產堿桿菌是污泥中的優(yōu)勢菌群,它屬于變形菌門。PCR擴增和測序分析2-CP降解途徑的關鍵酶基因,發(fā)現(xiàn)羥化酶、氯代鄰苯二酚1,2-雙加氧酶和氯代鄰苯二酚2,3-雙加氧酶同時存在于活性污泥系統(tǒng)中,表明該活性污泥可能具有多樣的2-CP降解途徑。

關鍵詞：高鹽廢水; 鄰氯苯酚; 活性污泥; 中度嗜鹽菌; 降解途徑

許多行業(yè)如肉類罐頭、蔬菜罐頭、橄欖油制造廠、石油、石油化學產品、農產品、海產品加工、酸洗、干酪加工不僅會產生高鹽廢水,還會排放各種不同的有機物[1-2]。酚類化合物在橄欖油制造廠、制革廠、煉油廠、造紙廠等高鹽廢水中是普遍的污染物,質量濃度從幾毫克每升到數(shù)百毫克每升[3-6]。使用傳統(tǒng)的物理、化學、物理化學方法,如吸附法、離子交換法、液-液萃取法、化學氧化法以及高級氧化工藝雖能有效去除氯酚,但是這些方法耗費高,也可能產生有害的副產物而危害環(huán)境[7-8]。生物法較之物理法和化學法有著經濟、高效的優(yōu)點,可以實現(xiàn)氯酚類物質的無害化處理[9]。但是,高鹽會極大地抑制氯酚類物質的生物降解,會影響微生物細胞的代謝速率[10]。Moussavi等[11]在缺氧反應器降解鄰氯苯酚研究中發(fā)現(xiàn),當NaCl質量濃度從20 g/L上升到40 g/L時,鄰氯苯酚的平均去除率迅速從99%降低到10%以下。Alva等[12]發(fā)現(xiàn)NaCl質量濃度在25～150 g/L范圍內苯酚降解中間產物順-順-粘康酸會有少量的累積。所以,利用傳統(tǒng)微生物處理高鹽有機廢水存在一些困難,通過馴化培養(yǎng)出中度嗜鹽菌或者直接投加中度嗜鹽菌將是切之可行的方法[13-15]。Moussavi等[16]在好氧顆?；钚晕勰?SBR)反應器中通過馴化耐鹽或者嗜鹽的微生物菌群實現(xiàn)了在高達8%的鹽度下對1 000 mg/L苯酚的去除率達到了99%左右。近年來研究者們通過固定化細胞(顆?；夹g)或者生物膜技術都實現(xiàn)了鄰氯苯酚或者苯酚的有效去除[11,17],但是生物膜法對于生物膜厚度、溶解氧濃度以及pH的控制是實際運行中的難題[18],而且好氧顆粒曝氣耗費高,同時高強度的曝氣也會使氯酚更多地揮發(fā)進入大氣[11]。而活性污泥SBR作為一種懸浮培養(yǎng)系統(tǒng),它的優(yōu)勢就在于其更好的可控性和操作性,可以通過調節(jié)水力停留時間(HRT)實現(xiàn)氯酚類物質的無害化處理以及改善污泥的沉降性能[19-20]。因此,應用活性污泥SBR法處理含高鹽度氯酚廢水仍然存在著優(yōu)勢。

本文主要探究了不同鹽度下活性污泥對鄰氯苯酚的降解特性,分析不同鹽度下微生物的好氧呼吸速率及活性變化,同時研究污泥胞外聚合物EPS在不同鹽度下的分泌特性,尤其是EPS中多糖和蛋白質的含量變化,結合污泥在高鹽環(huán)境中的微生物相特征,揭示活性污泥應對高鹽環(huán)境的生理特性。利用16S rRNA分子生物學手段分析耐鹽降解鄰氯苯酚的中度嗜鹽菌群的群落結構,并通過檢測鄰氯苯酚降解的相關酶基因,闡明該菌群對鄰氯苯酚的代謝途徑。

1材料與方法

1.1SBR實驗裝置

本文活性污泥(SBR)的有效容積為2 L,系統(tǒng)采用鼓風曝氣,以黏砂塊作為曝氣頭,壓縮空氣由曝氣泵提供,空氣流量為2 L/min。反應器溫度(28±2) ℃。初始SBR周期T=12 h,進水2 min,曝氣656 min,沉降30 min,排水2 min,閑置30 min。每周期進水800 mL,排水800 mL,即容積交換率為40%。初始水力停留時間(HRT)為30 h(HRT等于操作周期時間與容積交換率的比值[21])。本文定義每12 h為一個操作單元,每一個操作單元根據實際鄰氯苯酚(2-CP)及COD降解情況,確定是否進水或者排水,靈活控制操作周期。SBR完成一次循環(huán)的時間代表一個操作周期。如SBR一個操作周期T=36 h,即包含3個操作單元,那么只在第1個操作單元初始進水,排水只在第3個操作單元污泥沉降30 min后進行。每個操作單元曝氣時間固定為656 min,污泥沉降30 min后取10 mL水樣測定2-CP及COD,隨后閑置30 min左右直到重新開始曝氣。

1.2SBR反應器啟動

本文活性污泥來自上海高橋石油石化二廠生化池的剩余污泥。初始接種污泥440 mL,污泥質量濃度6.0 g/L。污泥沉降比(SV30)為55%,污泥體積指數(shù)(SVI)為92 mL/g。經過3 d空曝去除污泥中本底有機物,開始向SBR進水。模擬廢水主要成分為葡萄糖0～1.0 g/L,KH2PO41.35 g/L,K2HPO4·H2O 2.16 g/L,NH4Cl 0.20 g/L,MgSO4·7H2O 0.13 g/L,每升模擬廢水中加入1 mL的微量元素[22]。

首先在不加NaCl的情況下,進水葡萄糖質量濃度固定為0.4 g/L,2-CP質量濃度依次經過50,100,200,300,400,500 mg/L逐步升高,對污泥進行了約38 d的連續(xù)馴化。此馴化過程每隔12 h測定出水中的2-CP,當連續(xù)2個操作周期以上2-CP的去除率達到88%以上時就開始升高2-CP質量濃度,若多個操作周期未達到88%以上的2-CP去除率,則可適當增加操作周期。在SBR高鹽運行階段也按照此方法確定操作周期。經過此馴化后,污泥質量濃度增加到6.5 g/L,污泥SV30略有升高達到60%左右。穩(wěn)定馴化結果表明,鄰氯苯酚最多需要36 h就可達88%以上的去除率,而COD去除率也在87%以上。

1.3SBR運行參數(shù)

前期經過不同2-CP質量濃度(50～500 mg/L)進行馴化后,開始逐步提高SBR反應器中NaCl的質量濃度(10～80 g/L),每一個鹽度下2-CP質量濃度從125～1 000 mg/L逐步升高,進水葡萄糖質量濃度固定為1 000 mg/L,主要的實驗參數(shù)變化如表1所示。

表1　SBR反應器高鹽馴化階段運行參數(shù)

1.4分析方法

COD測定方法參照國家監(jiān)測標準[23],2-CP水樣的測定采用液相色譜法。色譜柱采用C18柱,流動相采用甲醇和水,其中甲醇體積分數(shù)為57%,流動相流速1 mL/min,使用紫外UV檢測器,檢測波長為280 nm。好氧呼吸速率測定采用自制耗氧速率測定儀,通過線性擬和得到溶解氧DO的變化速率,斜率即為耗氧速率[24]。比耗氧速率SOUR可由耗氧速率和MLVSS的比值得到,單位mg/(g·h)。EPS的提取采用超聲+甲酰胺+NaOH的組合方法[25-26],EPS中多糖PS的測定采用經典方法苯酚硫酸法[27],蛋白質PN的測定采用考馬斯亮藍G250顯色法[28]。污泥的顯微結構采用尼康ECLIPSE 80i熒光顯微鏡顯微照相觀察,表面形態(tài)采用日立HITACHI S3400N掃描電鏡觀察。

1.5污泥群落結構分析

污泥DNA提取采用美國Qbiogene公司的FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒,細菌16S擴增選用通用引物,27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGC-TCAG-3’),1492R (5′-TACGGCTACCTTGTTA-CGACTT-3’)[29],PCR擴增反應體系及擴增條件參考課題組前期應用的方法[30]。PCR擴增產物經純化回收后進行T/A克隆,克隆載體為pMD18-T,挑取陽性克隆子送到鉑尚生物技術(上海)有限公司測序。

1.6鄰氯苯酚降解相關酶基因的擴增

目的基因PCR擴增引物采用苯酚降解途徑涉及的相關酶基因即羥化酶、苯酚1,2-雙加氧酶,苯酚2,3-雙加氧酶三大功能基因的簡并性引物[30]。擴增產物連接到PMD18-T(Takara)載體上,每個平板挑5個單克隆利用M13引物進行PCR產物驗證。對于驗證結果為陽性的單克隆,經酶連接產物轉化后鋪制平板,每個平板送3個克隆到鉑尚基因有限公司進行測序。測序結果在NCBI網站進行BLAST比對。

2結果與討論

2.1不同鹽度下2-CP及COD的去除率

高鹽污泥馴化階段,NaCl質量濃度初始值為10 g/L,進水2-CP質量濃度為125 mg/L,此時進水COD為1 183 mg/L。為了較好地控制操作周期時間,本階段每個操作單元即每隔12 h取水樣測定出水剩余2-CP質量濃度,當2-CP降解完全后測定出水COD,2-CP和COD的去除率如圖1和圖2所示。

圖1　高鹽條件下2-CP的去除

圖2　高鹽條件下COD的去除

在A階段,當NaCl質量濃度為10 g/L時,進水2-CP質量濃度從125～1 000 mg/L逐漸升高。對于2-CP的去除在3個操作單元內即可完成,最多需要36 h即可實現(xiàn)2-CP的完全去除,COD的去除率也在92%～99%。當NaCl質量濃度增加到30 g/L時,即到達B階段,進水2-CP的質量濃度從250～1 000 mg/L逐漸升高。此階段活性污泥在36 h內也實現(xiàn)了2-CP的基本完全降解,COD去除率在91%～94%。上述結果說明,在NaCl質量濃度小于50 g/L之前,從污泥對2-CP和COD的降解情況來看,鹽度對污泥的抑制作用并不明顯。

對比A階段和B階段的馴化結果可以看出,當NaCl質量濃度從10 g/L升高到30 g/L時,若進水2-CP質量濃度相同時,在相同的操作單元時間內總是能將2-CP完全去除。比如進水2-CP質量濃度同樣是500 mg/L時,只需2個操作單元即24 h內就能將2-CP降解完全。但是,COD的去除率在較高鹽度下有所下降。由圖2可以看出,在相同進水2-CP條件下,B階段的出水COD比A階段的要高,其出水COD在100 mg/L以上。

當NaCl質量濃度增加到50 g/L時,即代表C階段。只考察進水2-CP質量濃度1 000 mg/L時2-CP及COD降解情況。每隔12 h測定2-CP的質量濃度,發(fā)現(xiàn)運行36 h后2-CP的去除率達到了86%,此時反應器中2-CP的質量濃度為140 mg/L,出水COD則高達480 mg/L左右,COD去除率為82%(未在圖中顯示)。為使出水2-CP及COD降低,此階段操作周期延長到48 h,在第17個到第19個操作周期測定出水2-CP及COD,結果表明48 h 內2-CP能夠完全降解,COD的去除率也達到了95%以上。

通過以上馴化過程,將下一階段的操作周期時間調整為48 h。為了使SBR反應器更好地去除2-CP以及降解COD,后續(xù)馴化培養(yǎng)過程將靈活地改變操作周期。若經過多個周期后,出水中的2-CP或者COD質量濃度仍較高,可考慮適當調整周期時間,以實現(xiàn)2-CP和COD的完全降解。

繼續(xù)增加NaCl質量濃度到80 g/L,如圖1和圖2所示的D階段,進水2-CP質量濃度仍為1 000 mg/L。此階段2-CP在48 h的去除率達到98%以上;同時測定反應器48 h后的出水COD,結果表明COD的去除率也達到了94%左右,此時出水COD為160 mg/L。可以看出,在48 h的操作周期內,對于此條件下的2-CP和COD保持著較高的去除率。當NaCl質量濃度仍為80 g/L,進水2-CP質量濃度繼續(xù)提高到1 500 mg/L時,發(fā)現(xiàn)在48 h的一個操作周期時間內2-CP和COD的去除率都達到了98%以上,而且出水COD降低到了40 mg/L以下。此條件下2-CP和COD的去除率已經基本一致,經過48 h的反應已基本實現(xiàn)2-CP的完全去除,且不再有中間產物的累積。

2.2不同NaCl質量濃度下污泥呼吸速率的變化

表2對比了不同的NaCl質量濃度和2-CP質量濃度下活性污泥的外源好氧呼吸速率SOUR,即每個操作周期的初始SOUR值。當NaCl質量濃度達到50 g/L,進水葡萄糖和2-CP質量濃度都為1 000 mg/L時,SOUR相比其他條件下的測定值最大,為9.79 mg/(g·h)。李玲玲等[31]研究了NaCl質量濃度對活性污泥中微生物利用葡萄糖進行代謝的活性影響,表明當NaCl質量濃度小于30 g/L時,污泥的SOUR值仍較高,在10 mg/(g·h)以上。而當NaCl質量濃度升高到50 g/L時,污泥的SOUR值降低到了5.83 mg/(g·h)。相比之下,本研究馴化后的活性污泥在NaCl質量濃度50 g/L下的SOUR值比NaCl質量濃度30 g/L下的高,反映了污泥較好的耐鹽活性。但是,當NaCl質量濃度升高到80 g/L,2-CP質量濃度上升到1 500 mg/L時,SOUR下降到1.39 mg/(g·h),說明此時高濃度的2-CP和高鹽已經較大程度地抑制了污泥的活性。雖然在隨后的降解過程中發(fā)現(xiàn),2-CP和COD在48 h的操作周期內去除率仍可以達到98%以上,但是由于瞬時沖擊負荷的影響,污泥的好氧呼吸速率受到明顯抑制。

表2　2-CP和NaCl質量濃度不同時的SOUR值

2.3不同NaCl質量濃度下胞外聚合物EPS的變化規(guī)律

眾多研究已經證實,胞外聚合物(EPS)富含許多高分子類物質,包含多糖、蛋白質、核酸、脂類、糖醛酸、腐殖酸等[32]。EPS在細胞表面聚集,有助于污泥絮體三維凝膠網狀結構的形成,這樣一種結構是由EPS的各種組分通過氫鍵結合和多價陽離子架橋的復雜交互作用形成的。EPS不僅使污泥細胞聚集強化污泥絮體的穩(wěn)定性,而且也為細胞抵御不利的外界環(huán)境提供了保護層[33]。這些物質中,只有多糖是胞外合成的,而蛋白質、脂類物質和核酸都是從胞內分泌出來的或是細胞消解時釋放出來的[34]。研究表明,EPS呈流變性的雙層結構,包含松散附著型EPS (Loosely Bound EPS,LB-EPS)和緊密黏附型EPS(Tightly Bound EPS,TB-EPS)[34-35]。其中,TB-EPS與細胞結合緊密,相對穩(wěn)定地附著于細胞壁外;而LB-EPS為可向周圍擴散的無明顯邊緣黏液層,較為疏松,密度小,具有流變性。由于多糖和蛋白質的空間分布不同,不同的提取方法影響了EPS提取的實際含量。兩者的提取方法上的主要區(qū)別在于,LB-EPS需要較為溫和的方法提取。一般研究者提取的EPS都是TB-EPS或者總EPS。本文采用堿法和超聲結合的方法提取的EPS屬于TB-EPS。對處于不同時期馴化穩(wěn)定的活性污泥胞外聚合物EPS的測定分析如表3所示。

大部分研究表明污泥EPS組分以蛋白(PN)、多糖(PS)為主。表3中數(shù)據顯示,不同時期提取的污泥樣品EPS中的蛋白(PN)含量變化不明顯,高鹽條件下的PN含量略有升高,從最初的11.44 mg/g升高到了17.72 mg/g,之后在進水2-CP質量濃度繼續(xù)升高到1 500 mg/L時又略微降低,PN含量為15.95 mg/g。但是,EPS中的多糖(PS)含量卻有明顯的變化。隨著NaCl質量濃度以及進水2-CP質量濃度的升高,PS含量從最初的NaCl質量濃度10 g/L條件下的16.43 mg/g,逐步上升到了NaCl質量濃度為80 g/L下的142.61 mg/g,隨后,當進水氯酚質量濃度變?yōu)? 500 mg/L時,PS含量又有所降低,其值為94.56 mg/g。EPS總量上,從初始的27.87 mg/g升高到160.33 mg/g,之后又下降到110.51 mg/g。當系統(tǒng)NaCl質量濃度從10 g/L升高到80 g/L時,除了EPS含量的升高,PS/PN的比值也在增加,在NaCl質量濃度為80 g/L時PS的含量達到了PN的8.05倍。Wang等[34]的研究發(fā)現(xiàn),當鹽度從0.5%升高到6%時,在缺氧-好氧SBR反應器中以葡萄糖為降解基質的活性污泥的TB-EPS的含量從18.6 mg/g升高到74.5 mg/g,而其中mPS/mPN的比值從0.34增加到了0.71。可見,本文在含有高質量濃度2-CP的高鹽環(huán)境下,EPS中的PS大量分泌,并且占據主導作用,mPS/mPN的比值有明顯變化。

表3　不同NaCl質量濃度下EPS的含量

2.4高鹽降解2-CP活性污泥的生物相觀察

如圖3所示,在高鹽馴化前后對污泥的顯微形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),污泥在馴化前后有了明顯的變化。圖3(a)示出了高鹽馴化初始污泥A階段的顯微形態(tài),可以看到在高鹽馴化初期,污泥絮體分散均勻。經過高鹽馴化后,發(fā)現(xiàn)污泥已經發(fā)生了聚集。圖3(b)示出了活性污泥D階段的顯微結構圖。從圖中可看出,污泥已經聚集成群,污泥絮體中間有了明顯的界限,說明在高鹽條件下污泥有自發(fā)聚集的能力。如2.3節(jié)所述,在高鹽以及高質量濃度2-CP的環(huán)境下,污泥中的微生物會分泌更多的EPS尤其是多糖PS來抵抗不利環(huán)境。因此污泥絮體的自發(fā)聚集可能是源于胞外聚合物在高鹽環(huán)境中的大量分泌導致。已有的研究表明,mPS/mPN的比值決定污泥絮體的緊密狀態(tài)。EPS中的成分既含有疏水性成分如脂類和蛋白質,又含有多糖等親水性物質。因此這兩者的比值決定著污泥的表面性質。正因為EPS的作用,污泥中的微生物才得以聚集,共同承擔降解污染物以及維持污泥系統(tǒng)良好的沉降性能。

圖3　污泥顯微形態(tài)

對NaCl質量濃度為80 g/L,進水2-CP質量濃度為1 500 mg/L時馴化穩(wěn)定的污泥取樣做電鏡掃描,其表面形態(tài)如圖4所示。從電鏡掃描結果來看,污泥中球狀結構的細菌占據優(yōu)勢,并且緊密地聚集在一起,進一步說明了污泥在抵抗外界不利環(huán)境中,能夠自發(fā)凝聚,從而改變污泥整體的沉降特性。Li等[35]的研究表明EPS的分泌是細胞凝聚的必要條件,EPS對污泥的絮凝和沉降發(fā)揮著重要的作用,EPS更多的分泌有助于克服微生物細胞間的靜電斥力使得細胞凝聚。

圖4　活性污泥電鏡表面形態(tài)圖

2.5高鹽降解2-CP活性污泥的群落結構

為研究在高鹽環(huán)境降解2-CP的活性污泥的微生物群落結構變化,本文將高鹽馴化末端提取到的污泥DNA,通過16S rRNA進行PCR擴增,擴增產物通過克隆、測序以及序列比對后,構建克隆文庫,通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析污泥群落結構組成。

共隨機挑取了33個克隆子,經過菌落PCR后發(fā)現(xiàn)有3個為假陽性,選擇其中30個陽性克隆子進行測序。將得到的正反測序序列結果,利用ChromasPro拼接,拼接好的序列在NCBI網站上利用BLAST和GenBank核酸數(shù)據庫進行比對分析,査找相似度最高的序列,確定序列代表的菌種類型。選取能代表各菌屬的3個菌株構建系統(tǒng)發(fā)育樹,得到的菌株鑒定結果見表4。

表4　富集菌群的16S rRNA克隆文庫結果

通過Mothur 軟件對序列OUT進行分類,再利用ClustalW對齊選取的所有相似序列,最后用MEGA 6.06軟件構建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹,設置自展值(Bootstrap)為1 000次來評估進化樹的可信度,計算完畢后自動生成系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖5所示。從進化樹分析,這些序列分布在Alphaproteobacteria 類群(α-變形菌類)、Betaproteobacteria 類群(β-變形菌類)和Actinobacteridae類群(放線菌類)3個類群中。其中,屬于Betaproteobacteria類群的微生物在豐度上具有較大優(yōu)勢,占整個克隆文庫的90%。OUT-5與Rhodococcussp.P14的相似度達到95%,Rhodococcussp.P14是由原油污染的沉積物中分離得到的,該菌株能夠降解多種多環(huán)芳烴和脂肪烴[36]。OUT-4與ShinellafuscastrainADC-27A的相似度為99%,ShinellafuscastrainADC-27A是從降解蒽的活性污泥中分離得到的菌株[37]。OUT-3與Achromobactersp.BR3的相似度為99%,該菌株是在擁有降解某種藥物能力的膜生物反應器MBR中分離得到的,屬于無色桿菌屬。OTU-2與Alcaligenesfaecalisstrain N05的相似度為99%,該菌株是分離自根際土壤具有固氮功能的產堿桿菌屬,占整個克隆文庫的66.7%,是富集菌群的最優(yōu)勢菌株。

圖5　富集菌群的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹

綜合以上分析,可知本研究的菌群結構,優(yōu)勢菌屬為產堿桿菌屬,其中Alcaligenesfaecalisstrain N05是富集菌群中最優(yōu)勢的菌株,該菌屬也是常見的2-CP降解菌屬,如Alcaligenessp.A7-2和AlcaligenesxylosoxidansJH1都是屬于降解2-CP的產堿桿菌[38-39]。

2.6高鹽降解2-CP相關酶基因檢測

本文調研了2-CP的好氧降解途徑,在此基礎上選擇SRB運行末端,也就是NaCl質量濃度為80 g/L,2-CP進水質量濃度1 500 mg/L時馴化穩(wěn)定后的污泥樣品,以該污泥樣品提取到的DNA為模板,并利用1.6節(jié)所述3對簡并性引物對相關酶基因進行擴增、測序,圖6示出了OCPH、OCP-C12O、OCP-C23O基因PCR產物(圖中分別為1，2，3)的檢測結果。對PCR擴增的產物測序后,將結果提交Genebank,提交的序列號分別為KR269847、KR269848和KR269849。對產物的序列BLAST比對結果如表5所示。

圖6　功能基因PCR擴增產物電泳圖

比對結果表明(表5),2-CP羥化酶基因與課題組前期培養(yǎng)的高鹽苯酚降解基因的相似度為85%[30],這也說明2-CP的降解首先是通過羥化酶即單加氧酶的作用,羥基化形成對應的氯代鄰苯二酚。如前所述,氯代鄰苯二酚的開環(huán)可能發(fā)生在鄰位或者是間位。序列比對結果顯示,OCP-C12O的調控基因與Paracoccussp.FLY-8的相似度為86%,該菌株是降解丁草胺(除草劑)的土壤中分離得到的,具有鄰苯二酚1,2-雙加氧酶基因。OCP-C23O與假單胞菌屬PseudomonasstutzeriCCUG 29243的相似度為71%,該菌由海洋沉積物中分離得到,具有鄰苯二酚2,3-雙加氧酶基因并且能夠降解萘[40]。該污泥菌群的功能基因鑒定結果顯示同時存在兩種降解途徑,表明了在高鹽環(huán)境降解2-CP的途徑多樣性的存在。結合已有的文獻推測2-CP可能的降解途徑如圖7所示。首先,2-CP在單氧酶的催化作用下發(fā)生羥基化,形成3-氯鄰苯二酚,然后3-氯鄰苯二酚分別在3-氯鄰苯二酚1,2-雙加氧酶和3-氯鄰苯二酚2,3-雙加氧酶的作用下發(fā)生鄰位開環(huán)生成2-氯-順-順-己二烯二酸或者間位開環(huán)生成3-氯-2-羥基-粘康酸半醛,最后都進入三羧酸循環(huán)降解完全。

表5　鄰氯苯酚降解基因序列比對結果

對于污泥菌群降解途徑的研究,Alan Farrell等[41]利用惡臭假單胞菌Pseudomonasputida CP1投加入某種具有間位降解2-氯酚能力的混合菌群,發(fā)現(xiàn)整個菌群對2-氯酚的代謝途徑發(fā)生了改變,從間位開環(huán)變成了鄰位開環(huán)脫氯。由于菌群結構的多樣性,可能在降解氯酚類難降解物質時,會誘導產生多種代謝途徑。雖然在某些特定條件下菌群只顯示出一些主要的降解途徑,但是有研究者指出其中仍然包含多種與降解相關的多樣性基因,是這些基因共同作用的結果[42]。本文的研究也說明了降解途徑具有多樣性。

圖7　通過3-CC途徑降解2-CP的鄰位開環(huán)和間位開環(huán)途徑

3結論

在NaCl質量濃度小于50 g/L的條件下,污泥在36 h內可以完全去除2-CP,對COD的去除達到92%以上。當NaCl質量濃度升高到50 g/L,2-CP質量濃度為1 000 mg/L時,污泥在36 h內2-CP和COD的去除率分別為86%以及82%,出水COD仍高達480 mg/L左右。液相色譜檢測證明中間產物存在一定的累積。通過延長操作周期時間至48 h,可使2-CP完全降解,COD去除率達到95%左右,同時對污泥的好氧呼吸速率SOUR測定結果表明,此時污泥活性較高,SOUR值為9.79 mg/(g·h)。當NaCl質量濃度升高到80 g/L時,污泥活性受到了較大的抑制,SOUR值降低到1.39 mg/(g·h)。

高鹽條件下EPS中的PN含量變化不明顯,PS含量以及mPS/mPN的比值隨NaCl質量濃度升高而增加。當NaCl質量濃度為80 g/L,2-CP質量濃度為1 000 mg/L時,活性污泥胞外聚合物(EPS)的含量高達142.6 mg/g,此時多糖PS的含量是蛋白質PN的8.05倍。對高鹽2-CP馴化穩(wěn)定的污泥進行顯微形態(tài)以及掃描電鏡觀察,表明菌群在高鹽條件下有自發(fā)聚集的能力,菌群結構緊密,球狀菌占據優(yōu)勢。群落結構分析表明,污泥中菌群的優(yōu)勢菌屬為產堿桿菌,Alcaligenesfaecalisstrain N05是富集菌群中最優(yōu)勢的菌株。

功能基因檢測結果表明,污泥在高鹽環(huán)境中降解2-CP的降解途徑可能存在鄰位開環(huán)和間位開環(huán)兩種途徑,其中參與代謝的酶主要是羥化酶、氯代鄰苯二酚1,2-雙加氧酶和氯代鄰苯二酚2,3-雙加氧酶,污泥中微生物對鄰氯苯酚的降解途徑具有多樣性。

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Aerobic Activated Sludge Treatment of High-Salinity Chlorophenolic Wastewater and Community Structure Analysis

WU Zhi-ming,SUN Zhi-yuan,LI Hui,LIU Yong-di

(School of Resource and Environmental Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

Abstract:The activated sludge dominated by moderately halophilic bacteria were acclimated using SBR reactor,which used to remove the 2-chlorophenol (2-CP) efficiently from wastewater.When the mass concentration of NaCl was between 10 g/L and 80 g/L,the removal rates of both 2-CP and COD reached 91%.When the mass concentration of NaCl was 80 g/L and the 2-CP mass concentration was above 1 000 mg/L,the removal rate of 2-CP could maintain at 98%,in which the SBR reactor achieved the best treatment effect.The concentration of extracellular polymers (EPS) of activated sludge reached the highest amount of 142.6 mg/g at this operation condition.With the increase of salinity,the amount of polysaccharide in EPS increased.As observed by using microscope and scanning electron microscopy (SEM),most of the microorganisms appeared pellets and the microbial community had a tendency to gather spontaneously under the high salinity condition.16S rRNA gene clone library analysis showed that the dominated bacterial population in the activated sludge was Alcaligenes faecalis which belonged to Proteobacteria.PCR and sequence analysis of the key enzyme gene in 2-CP degradation showed that hydroxylase,chlorinated catechol 1,2-dioxygenase and chlorinated catechol 2,3-dioxygenase co-existed in the activated sludge system,which indicated the diverse 2-CP degradation pathway.

Key words:hypersaline wastewater; 2-chlorophenol (ortho-chlorophenol); activated sludge; moderately halophilic bacteria; degradation pathway

收稿日期：2015-05-27

基金項目：國家自然科學基金(51378208,41273109,41003031);中央高?；究蒲袠I(yè)務費(222201313008,WB1314002)

作者簡介：吳志明(1989-),男,福建人,碩士生,主要從事化工廢水生物處理研究。E-mail:wuzhiming2010@126.com 通信聯(lián)系人：劉勇弟,E-mail:ydliu@ecust.edu.cn

文章編號：1006-3080(2016)02-0200-10

DOI:10.14135/j.cnki.1006-3080.2016.02.008

中圖分類號：X522

文獻標志碼：A