房冬冬劉振趙金嬌周慧龐磊李長貴

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無癥狀高尿酸血癥動物模型的建立及初步研究*

房冬冬①劉振①趙金嬌①周慧①龐磊①李長貴①

【摘要】目的：建立新型的無癥狀高尿酸血癥小鼠模型。方法：選取雄性尿酸氧化酶基因敲除雜合子C57BL/6J小鼠和野生型C57BL/6J小鼠各20只，兩類小鼠均按隨機數(shù)字表法分為對照組和模型組，每組各10只，模型組給予高酵母飼料飼養(yǎng)并予以氧嗪酸鉀鹽懸液（1次/d，250 mg/kg）腹腔注射。分別于造模前和造模后第1、2、3、4周時鼠尾靜脈取血檢測小鼠血清尿酸水平（UA），并于造模后第5周取小鼠腎臟行病理切片及HE染色。結(jié)果：造模1周后，兩模型組小鼠血清尿酸水平均較對照組明顯升高，且雜合子模型組尿酸水平明顯高于野生型模型組，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但腎臟病理切片HE染色顯示，兩種小鼠對照組和模型組均無明顯病理變化。結(jié)論：以高酵母飼料飼養(yǎng)并予以氧嗪酸鉀鹽懸液腹腔注射處理的尿酸氧化酶基因敲除雜合小鼠所構(gòu)建的高尿酸血癥動物模型具有尿酸值高，模型穩(wěn)定的特點，為較理想的小鼠高尿酸血癥動物模型。

【關(guān)鍵詞】高尿酸血癥模型； 尿酸氧化酶基因敲除雜合子小鼠； 血清尿酸

①青島大學(xué)附屬醫(yī)院 山東 青島 266003

First-author’s address：The Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266003，China

尿酸是人類嘌呤代謝的最終產(chǎn)物。在約1500萬年前人類由于基因突變失去了尿酸氧化酶基因［1］，因此人類的尿酸水平高于其他物種，這種改變有利于人類適應(yīng)當(dāng)時的生存環(huán)境，但尿酸水平仍控制在一定范圍內(nèi)。現(xiàn)在所謂的高尿酸血癥（hyperuricemia）是指嘌呤代謝紊亂和/或尿酸排泄障礙導(dǎo)致的血尿酸水平增高［2］。隨著人們生活水平的提高及飲食結(jié)構(gòu)的變化，高尿酸血癥的發(fā)病率日漸增高［3-4］，由于雌性激素的作用尿酸水平在男性中比絕經(jīng)前女性更高［5-6］。高尿酸血癥動物模型，是研究高尿酸血癥及篩選降尿酸藥物的重要工具［7-9］。目前尚未見尿酸氧化酶基因敲除雜合小鼠制作高尿酸動物模型的報道，本實驗對尿酸氧化酶基因敲除雜合小鼠進行高酵母飼養(yǎng)及氧嗪酸鉀懸液腹腔注射處理，觀察其血清尿酸等指標，目的在于獲得尿酸值較高且穩(wěn)定的理想高尿酸血癥動物模型。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 選擇以C57BL/6J小鼠為背景的尿酸氧化酶基因敲除雜合子小鼠（基因型為Uox+/-）20只及野生型C57BL/6J小鼠（基因型為Uox+/+）20只，均為雄性，6～8周齡，體質(zhì)量18～25 g，尿酸氧化酶基因敲除雜合小鼠構(gòu)建于上海南方模式生物研究中心，由本院實驗動物中心SPF級動物飼養(yǎng)房飼養(yǎng)。

1.1.2儀器和試劑 日本東芝TBA-40FR全自動生化分析儀；Nikon90i顯微鏡；高酵母飼料（北京科澳協(xié)力飼料有限公司）；氧嗪酸鉀鹽（美國Aldrich公司）。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組及建模 雜合小鼠及野生型小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按隨機數(shù)字表法分別分為對照組和模型組，每組10只。模型組小鼠予以高酵母飼料飼養(yǎng)及氧嗪酸鉀懸液腹腔注射（1次/d，250 mg/kg），對照組小鼠飼以普通小鼠顆粒飼料，并給予同體積蒸餾水腹腔注射。

1.2.2觀察指標與測定方法 雜合小鼠和野生型小鼠均分別于造模前和造模后第1、2、3、4周時鼠尾靜脈取血，室溫下靜置1 h后，3500 rpm，4 ℃離心15 min，收集血清，應(yīng)用全自動血液生化儀檢測記錄血尿酸（UA）、尿素氮（BUN）、肌酐（CR）、甘油三酯（TG）、膽固醇（CH）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的水平，并對所得數(shù)據(jù)進行分析。

1.2.3病理切片及HE染色 造模第5周將小鼠麻醉后，迅速打開腹腔，取腎臟，置于4%的甲醛溶液中固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋，包埋后腎臟縱切以觀察腎門、腎盂結(jié)構(gòu)，蘇木素-伊紅染色，封片，于Nikon90i顯微鏡下觀察組織切片。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料均以（±s）表示，比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1四組小鼠不同時期血尿酸水平比較 造模前，各組小鼠血尿酸水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。造模1～4周，雜合子模型組小鼠血尿酸水平與造模前比較均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。野生型模型組小鼠血尿酸水平1～4周也明顯升高，與給藥前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩模型組小鼠血清尿酸水平均高于對照組（P＜0.05）；雜合子模型組小鼠與野生型模型組小鼠組比較，造模后1～4周尿酸水平升高更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1、圖1。

表1　四組小鼠不同時期血尿酸水平比較（±s） μmol/L

表1　四組小鼠不同時期血尿酸水平比較（±s） μmol/L

*與野生型對照組比較，P＜0.05；△與雜合子對照組比較，P＜0.05；#與野生型模型組比較，P＜0.05

組別　　造模前　　造模1周　　造模2周　　造模3周　　造模4周野生型對照組（n=10）　164.4±12.8　164.8±14.0　167.4±13.0　168.5±15.9　164.9±9.07雜合子對照組（n=10）　161.5±17.7　167.1±14.4　167.3±13.7　169.3±13.1　167.0±12.9野生型模型組（n=10）　163.3±15.8　 237.6±12.4*　250.2±10.5*　247.7±16.8*　242.4±12.4*雜合子模型組（n=10）　161.9±20.5　 284.1±35.9△#　288.6±22.7△#　285.5±18.1△#　281.0±24.0△#

圖1　造模后1～4周Uox+/+和Uox+/-小鼠尿酸水平

2.2各組小鼠血肌酐、尿素氮、甘油三酯、膽固醇，谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶的變化 造模前后，所有模型組小鼠血肌酐、尿素氮、甘油三酯、膽固醇、谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶水平與相應(yīng)對照組比較無明顯差異。

2.3各組小鼠腎臟病理切片HE染色比較 建模5周后處死小鼠留取腎臟標本進行HE染色，光鏡下觀察，模型組小鼠腎皮質(zhì)、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯病理改變，與各自對照組比較無顯著差別，見圖2～3。

圖2　腎臟病理切片HE染色結(jié)果（×100）

圖3　腎臟病理切片HE染色結(jié)果（×400）

3　討論

在中國高尿酸血癥患病率高達5.0%～23.5%，已接近歐美發(fā)達國家水平［10］。近年來國內(nèi)外研究資料顯示，高尿酸血癥患者中約20%可發(fā)生痛風(fēng)。另外，作為心腦血管疾病的獨立危險因素，高尿酸血癥可誘發(fā)和加重動脈粥樣硬化性疾病，增加心腦血管疾病發(fā)病率和死亡率［11-13］，同時，高尿酸血癥也與代謝綜合征、腎臟疾病密切相關(guān)［14-18］。人類在進化過程中尿酸氧化酶基因失活，導(dǎo)致嘌呤代謝的終產(chǎn)物以尿酸的形式存在，這是人類易患高尿酸血癥的重要原因［19-20］，當(dāng)然這還與多種因素有關(guān)［21-22］。而低級動物體內(nèi)卻能產(chǎn)生尿酸氧化酶（Uox），它可將尿酸分解為更易溶于水的小分子尿囊素排出體外，這是許多低級動物（包括小鼠）維持尿酸穩(wěn)態(tài)的主要途徑。

目前國內(nèi)外建立高尿酸血癥動物模型的方法主要有4類，分別為酵母法、補充尿酸或尿酸前體法、尿酸酶抑制劑法及破壞尿酸酶基因法［23］。傳統(tǒng)的對野生型C57BL/6J小鼠進行藥物刺激造模的方法血尿酸升高并不理想，存在尿酸值不穩(wěn)定、小鼠狀態(tài)差等缺點，不適宜進行長期實驗。尿酸氧化酶基因敲除后，小鼠可出現(xiàn)高尿酸血癥和痛風(fēng)癥狀，成為與人類高尿酸血癥發(fā)病機制非常相似的自發(fā)性高尿酸血癥小鼠動物模型。但1994年文獻報道的模型存在下列缺陷：（1）尿酸氧化酶基因缺失的純合子小鼠于出生后4周內(nèi)有超過一半死亡；（2）該基因敲除小鼠背景為129品系，具有免疫排斥，無法在小鼠體內(nèi)模擬人類的發(fā)病過程；（3）純合子小鼠血尿酸水平是雜合子及野生型小鼠的10倍余，合并致死性腎臟疾病等，從而無法對該模型進行長期觀察及實驗。

本課題組應(yīng)用TALEN靶向基因修飾技術(shù)將C57BL/6J小鼠的尿酸氧化酶基因敲除，構(gòu)建了自發(fā)性高尿酸血癥小鼠模型，但與Uox+/+小鼠和Uox+/-小鼠相比，Uox-/-小鼠的出生率約15.8%，低于孟德爾遺傳定律的25%，而且Uox-/-小鼠死亡率較高。Uox+/-小鼠的出生率約53.3%，死亡率僅4.45%?；赨ox-/-小鼠的出生率較低，死亡率較高，價格昂貴，本實驗選用Uox+/-小鼠進行高尿酸模型研究。實驗結(jié)果顯示雜合子小鼠高酵母飼養(yǎng)+氧嗪酸鉀溶液腹腔注射造模后血尿酸升高明顯高于野生型小鼠造模組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）?？蓱?yīng)用此模型對受試藥物進行實驗研究。

本實驗認為對雜合子小鼠高酵母飼養(yǎng)并予以腹腔注射氧嗪酸鉀鹽法可建立較理想的小鼠高尿酸血癥動物模型。但本法仍不能形成持久的高尿酸血癥是其不足之處。將高酵母飼養(yǎng)與尿酸酶抑制劑氧嗪酸鉀鹽腹腔注射序貫應(yīng)用或改變給藥方式，以期獲得更可靠的的高尿酸血癥動物模型是筆者下一步的實驗研究方向。

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Establish and Primary Research of Asymptomatic Hyperuricemia Animal Model

FANG Dong-dong，LIU Zhen，ZHAO Jin-jiao，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（11）：016-019

【Abstract】Objective：To establish a new type of asymptomatic hyperuricemia model in mice.Method：Twenty male urate oxidase gene knockout heterozygous C57BL/6J mice and twenty wild-type C57BL/6J mice were selected as the objects，which were randomly divided into control group and model group according to the random number table respectively，10 mice in each group，the model group was given yeast-rich feed and potassium oxonate suspension（1 time/d，250 mg/kg） by intraperitoneal injection.The blood UA were detected before and 1，2，3，4 weeks after molding.The pathological sections and HE staining of mouse kidney were also performed at the 5th week after the molding.Result：After 1 week，the model group mice’s serum uric acid levels were obviously higher than the control group，and uric acid levels in heterozygous model group was obviously higher than that of the wildtype model group，the differences were statistically significant（P＜0.05），but the kidney pathological HE staining showed there were no changes in the two kinds of mice between the control group and the model group.Conclusion：The hyperuricemia animal model constructed by urate oxidase gene knockout heterozygous mice feeding with yeast-rich feed and given oxonic acid potassium salt suspension peritoneal injection treatment shows characteristics of high uric acid value and high stability，which conclusions to an ideal animal model in mice for asymptomatic hyperuricemia.

【Key words】Hyperuricemia model； Uric acid oxidase gene knockout heterozygous mice； Serum uric acid

*基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（31371272）

通信作者：李長貴

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.11.005

收稿日期：（2016-03-14） （本文編輯：劉蕾）