寧素恒，徐 軍，李強(qiáng)子，張 麗

（1.寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)有限公司，寧夏銀川 750024；2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730030）

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牛LF基因結(jié)構(gòu)和功能的生物信息學(xué)分析

寧素恒1，徐 軍1，李強(qiáng)子2，張 麗2

（1.寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)有限公司，寧夏銀川 750024；2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730030）

摘 要：本試驗(yàn)采用生物信息學(xué)方法預(yù)測和分析牛乳鐵蛋白基因（LF）編碼產(chǎn)物的理化特性、結(jié)構(gòu)功能、信號肽、N-糖基化位點(diǎn)及其同源進(jìn)化關(guān)系，以期為牛的抗病分子育種和經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)基因篩選提供理論依據(jù)。研究結(jié)果顯示牛LF基因編碼708個氨基酸，產(chǎn)物為一種不穩(wěn)定的水溶性蛋白，二級結(jié)構(gòu)以a-螺旋為主，還有6個糖基化位點(diǎn)。蛋白功能以信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脅迫應(yīng)答和免疫應(yīng)答的概率相對較高，這表明LF基因可能在牛免疫應(yīng)答和生長調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用，能對牛的抗病力和生產(chǎn)性能起作用。同源進(jìn)化關(guān)系來看，牛LF基因與馬的親緣關(guān)系最近。因此LF基因可作為荷斯坦?？共∮N的候選基因進(jìn)行進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：牛；LF基因；抗病育種；生物信息學(xué)

文獻(xiàn)著錄格式:寧素恒，徐軍，李強(qiáng)子，等.牛LF基因結(jié)構(gòu)和功能的生物信息學(xué)分析［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，57（6）: 904-907.

徐 軍（1978—），男，寧夏青銅峽人，畜牧師，本科，從事奶牛育種與疾病防治研究工作，E-mail: 409967130@qq.com。

乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）是一種天然活性鐵結(jié)合糖蛋白，廣泛存在于動物的乳汁、血液、唾液、小腸液等外分泌液中，具有抑菌、抗病毒感染、免疫調(diào)控、激活免疫應(yīng)答及溶菌酶再生等生理功能［1-2］。將乳鐵蛋白運(yùn)用于動物生產(chǎn)中可以顯著降低動物缺鐵性貧血發(fā)病率、提高動物免疫力和改善腸道微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)動物健康生長。牛LF基因被定位于牛的第22號染色體上［3］。研究發(fā)現(xiàn)牛的乳鐵蛋白濃度可遺傳（h2=0.4）［4］。Molenaar等［5］研究表明患有乳腺炎的牛乳腺組織中LF基因的表達(dá)量比未患有乳腺炎的牛群體高，說明LF基因表達(dá)與炎癥反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。此外，Dinesh等［6-10］通過研究均表明牛LF基因多態(tài)性與牛的泌乳性狀和乳腺炎抗性密切相關(guān)?；贚F基因的可遺傳性以及與乳腺炎的相關(guān)性，可以對LF基因的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。

為深入探討牛LF基因的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能，避免該基因演化造成的差異，本研究利用生物信息學(xué)方法對牛LF基因序列結(jié)構(gòu)及相關(guān)生物信息學(xué)特征進(jìn)行預(yù)測和分析，同時構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，為揭示該基因理化性質(zhì)、功能信息、遺傳特性及相關(guān)生理機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 牛LF基因序列

從GeneBank中查找得到牛的LF基因的編碼區(qū)序列（Codingsequences，CDS）（Genebank no.NC-007320）。

1.2 方法

對牛LF基因CDS編碼產(chǎn)物的氨基酸序列、其蛋白質(zhì)特性及功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析與預(yù)測。所用工具軟件與網(wǎng)址為開放閱讀框分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），編碼蛋白質(zhì)理化質(zhì)分析（http://web.expasy.org/protparam/），編碼蛋白質(zhì)疏水性/親水性分析（http://web.expasy.org/protscale/），編碼蛋白質(zhì)的N-糖基化位點(diǎn)分析（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/），編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat.pl？page=npsa-sopma.html），編碼蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)（http://swissmodel.expasy.org/和PyMOL軟件），編碼蛋白質(zhì)的信號肽跨膜區(qū)預(yù)測（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），編碼蛋白質(zhì)的功能預(yù)測（http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/），同源系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析（DNAStar軟件中的MegAlign程序）。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛LF基因序列的開放閱讀框（ORF）

開放閱讀框?yàn)榛驈钠鹗济艽a子到終止密碼子之間的一段核苷酸序列。牛LF基因ORF分析結(jié)果如圖1，全長為2 127 bp。5′端起始密碼子是ATG，3′端終止密碼子是TAA，編碼蛋白質(zhì)由708個氨基酸組成。

圖1　牛LF基因CDS區(qū)的ORF分析

2.2 牛LF基因編碼氨基酸理化性質(zhì)的預(yù)測

牛LF基因編碼708個氨基酸，20種氨基酸所占比例亮氨酸（Leu）數(shù)目最多（表1），占整個氨基酸組成的10.3%，甲硫氨酸（Met）數(shù)目最少，占0.7%，負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp + Glu）為76，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為92，其分子式為C3449H5437N965O1022S40，分子質(zhì)量為10.913 ku，半衰期為30 h，基因編碼產(chǎn)物不穩(wěn)定指數(shù)為40.99，大于40，表明該基因編碼產(chǎn)物不穩(wěn)定［11］。

表1　牛LF編碼蛋白的氨基酸組成

2.3 牛LF基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

牛LF基因編碼氨基酸序列親水性/疏水性預(yù)測結(jié)果如圖2所示，其中第7位丙氨酸（Ala）疏水性最強(qiáng)（+2.400）；第243位的天冬氨酸（Asp）親水性最強(qiáng)（-2.882）。整條氨基酸肽鏈中，親水氨基酸占62.15%，疏水氨基酸占37.85%，總平均疏水性為-0.328，表現(xiàn)為親水性，因此，可推斷牛LF基因編碼的蛋白質(zhì)是一種可溶性蛋白。

圖2　牛LF基因編碼蛋白的疏水性預(yù)測結(jié)果

2.4 牛LF基因編碼蛋白質(zhì)N-糖基化位點(diǎn)的預(yù)測

蛋白質(zhì)糖基化是真核生物蛋白質(zhì)翻譯后加工的重要修飾之一，蛋白質(zhì)糖基化修飾對蛋白質(zhì)折疊、分選及其定位有重要影響，使用在線軟件http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/對LF基因N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖3所示。牛LF基因編碼蛋白氨基酸序列中存在6個潛在的N-糖基化位點(diǎn)。

2.5 牛LF基因編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用在線軟件http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa-automat.pl？page=npsa-sopma.html對牛乳鐵蛋白二級結(jié)構(gòu)組分進(jìn)行分析，其中a-螺旋（Hh）占34.89%，β-折疊（Ee）占19.49%，β-轉(zhuǎn)角（Tt）占11.44%，無規(guī)則卷曲（Cc）占34.18%。乳鐵蛋白二級結(jié)構(gòu)中，Hh占主導(dǎo)地位。三級結(jié)構(gòu)見圖4，從預(yù)測結(jié)果來看，三級結(jié)構(gòu)主要成分為Hh，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。

圖3　荷斯坦牛LF基因編碼蛋白N-糖基化位點(diǎn)

圖4　荷斯坦牛LF基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型預(yù)測

2.6 牛LF基因編碼蛋白質(zhì)的功能預(yù)測

牛LF基因編碼蛋白質(zhì)的功能預(yù)測見表2，該蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脅迫應(yīng)答和免疫應(yīng)答的概率相對較高，分別為0.985，0.830和0.357，這表明LF基因可能在牛免疫應(yīng)答和生長調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用，可能對牛的抗病力和生產(chǎn)性能起作用。

表2　牛LF基因編碼蛋白質(zhì)的功能預(yù)測

2.7 牛LF基因編碼蛋白質(zhì)信號肽跨膜區(qū)的預(yù)測

信號肽是決定新生肽鏈在細(xì)胞中的定位或決定某些氨基酸殘基修飾的一些肽段。在線軟件http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/分析結(jié)果顯示（圖5），牛LF基因編碼產(chǎn)物C值為0.728，Y值為0.819，S值為0.961，其切割點(diǎn)位于19～20位的氨基酸之間，基本可以判定LF基因編碼產(chǎn)物存在信號肽。

圖5　荷斯坦牛LF基因編碼蛋白質(zhì)信號肽跨膜區(qū)

2.8 牛LF基因編碼蛋白的同源序列分析

使用DNAStar軟件對6個物種的LF基因編碼產(chǎn)物序列進(jìn)行同源性分析。由圖6可知，LF基因幾乎在所有的哺乳動物中都有表達(dá)。從進(jìn)化樹分析結(jié)果來看，進(jìn)化樹分為兩支，其中靈長目、偶蹄目和奇蹄目聚為一類，嚙齒目聚為一類。其中牛LF基因親緣關(guān)系與馬最近，這一結(jié)果符合動物分類學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)。

圖6　荷斯坦牛LF基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

在哺乳動物中，LF基因是基因組中多態(tài)性較豐富的區(qū)域，對LF基因遺傳變異進(jìn)行生物分析可以提供物種的遺傳多樣性信息，對動物種質(zhì)資源的保護(hù)具有重要的生物學(xué)意義。同時LF基因與牛的繁殖性狀存在關(guān)聯(lián)性［12］。因此對LF基因的生物信息學(xué)分析也對實(shí)際生產(chǎn)有一定的幫助。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定其功能特點(diǎn)，進(jìn)而影響其生命活動的代謝。牛LF基因CDS區(qū)序列全長2 127 bp，編碼708個氨基酸，編碼產(chǎn)物為不穩(wěn)定蛋白。研究表明，蛋白質(zhì)半衰期越長則蛋白質(zhì)穩(wěn)定性越高［13］，而本研究發(fā)現(xiàn)LF編碼產(chǎn)物氨基酸具有較長的半衰期（30 h）卻是不穩(wěn)定蛋白，出現(xiàn)這一特性可能與其不同生理功能的發(fā)揮存在某種聯(lián)系。糖基化是真核生物蛋白質(zhì)翻譯后重要的修飾之一，它可以影響蛋白質(zhì)的抗原決定簇、電荷性質(zhì)、熱穩(wěn)定性、免疫分子的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響機(jī)體對抗原的應(yīng)答反應(yīng)［14］，它還可以調(diào)控蛋白質(zhì)在組織和細(xì)胞中的定位、功能和活性［15］，糖基化位點(diǎn)發(fā)生變化可能與疾病的發(fā)生有關(guān)［16］，因此荷斯坦牛LF基因蛋白上潛在的糖基化位點(diǎn)可能會影響基因與病原相關(guān)分子的連接綁定，從而影響機(jī)體對乳腺炎的抵抗力。研究表明，無規(guī)則卷曲易受側(cè)鏈相互影響而改變空間構(gòu)象，a螺旋和無規(guī)則卷曲是蛋白質(zhì)肽鏈中構(gòu)成配體受體結(jié)合的活性部位［17］，LF基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)中大量的無規(guī)則卷曲可能影響蛋白質(zhì)肽鏈的結(jié)合活性，從而影響蛋白質(zhì)的功能。荷斯坦牛LF基因編碼蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脅迫應(yīng)答、免疫應(yīng)答和生長因子的概率相對較高，其中免疫應(yīng)答和生長因子的概率最高，說明該基因可能對荷斯坦牛的免疫力和生產(chǎn)力具有較高的調(diào)節(jié)能力；LF基因可能在荷斯坦牛免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用，可能對荷斯坦牛的抗病力起作用［18］。

為了保證研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究對各類型的預(yù)測均選用了多種不同軟件，不同算法，并進(jìn)行多次預(yù)測。預(yù)測所得結(jié)果一致性較高，具有較高的可信度。對牛LF基因的研究將有利于對該基因及其編碼蛋白功能的進(jìn)一步分析，了解牛LF基因與相關(guān)疾病的遺傳效應(yīng)可以為利用LF基因改良牛經(jīng)濟(jì)性狀提供參考。

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（責(zé)任編輯：盧福莊）

中圖分類號：S823

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0528-9017（2016）06-0904-04

DOI：10.16178/j.issn.0528-9017.20160635

收稿日期:2016-02-15

基金項(xiàng)目:西北民族大學(xué)引進(jìn)人才科研項(xiàng)目（xbmuyjrc201316）；西北民族大學(xué)國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201510742084）

作者簡介:寧素恒（1984—），男，山西榆社人，助理畜牧師，本科，從事奶牛育種與繁殖工作，E-mail: 107154324@qq.com。

通信作者:張 麗，E-mail: shiningstar2013@sina.cn。