第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽胰脾外科(西安710032)　李　軍　白　娟　竇科峰　安家澤

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β細(xì)胞素下調(diào)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響及其機(jī)制探討*

第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽胰脾外科(西安710032)李軍△白娟◇竇科峰安家澤▲

摘要目的：在肝癌細(xì)胞系中通過(guò)下調(diào)β細(xì)胞素 (BTC)的表達(dá)研究其對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響并探究其影響機(jī)制。方法：通過(guò)siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)BTC后,通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SMMC7721和MHCC97-H細(xì)胞的侵襲能力變化，并用RT-PCR和Western blot檢測(cè)與肝癌侵襲能力相關(guān)的PI3K/AKT-XIAP信號(hào)通路的表達(dá)變化。結(jié)果：與陰性對(duì)照組相比,siRNA下調(diào)組中SMMC7721和MHCC97-H細(xì)胞的侵襲能力明顯降低，PI3K/AKT-XIAP信號(hào)通路受到明顯抑制。結(jié)論：下調(diào)BTC表達(dá)可能通過(guò)抑制PI3K/AKT-XIAP信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞的侵襲能力。

主題詞肝腫瘤細(xì)胞增殖 β細(xì)胞素 腫瘤抑制蛋白質(zhì)類

肝癌是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率居第6位[1]，致死率居第2位的惡性腫瘤。我國(guó)的肝癌形勢(shì)尤為嚴(yán)峻，占全球肝癌發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)的一半以上[2]。為改善肝癌治療現(xiàn)狀，肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。作為表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Epidermal growth factor,EGF)家族中的一個(gè)成員,β細(xì)胞素(Betacellulin,BTC)在腫瘤的機(jī)制研究中日益受到重視,BTC在肝癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌組織中都有較高的表達(dá)[3]。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)BTC的高表達(dá)與肝癌組織的病理特征密切相關(guān)，提示BTC與肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)[3]。但目前關(guān)于BTC調(diào)控肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清楚。因此,本研究通過(guò)siRNA轉(zhuǎn)染的方式在肝癌細(xì)胞系MHCC97-H和SMCC7721中下調(diào)BTC的表達(dá),進(jìn)而研究下調(diào)BTC對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響并進(jìn)行機(jī)制探索。

材料和方法

1材料①肝癌細(xì)胞系：人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、MHCC97-H。②實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM培養(yǎng)基；磷酸緩沖液(PBS)；FBS；0.25%胰蛋白酶；DMSO；注射用鏈霉素粉針劑；注射用氨芐青霉素粉針劑；重組人BTC蛋白。BTC inhibitors 及其陰性對(duì)照NC，脂質(zhì)體2000。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DEPC純水；rTaq酶、Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)；DNA marker、DNA Loading buffer(中國(guó)大連Takara公司)，SYBRPremix EX Taq熒光實(shí)時(shí)定量(RT)試劑盒；三氯甲烷、二甲基甲醇、99.97%的Alcohol(天津永大化學(xué)制劑公司)；瓊膠糖(上海澤邁生物技術(shù)有限公司)。鼠抗人BTC多克隆一抗(美國(guó)Cell Signaling Technology試劑公司);鼠抗人β-actin多克隆一抗(美國(guó)Cell Signaling Technology試劑公司)；鼠抗人MMP-2多克隆一抗(美國(guó)Cell Signaling Technology試劑公司)，鼠抗人MMP-9多克隆一抗(美國(guó)Cell Signaling Technology試劑公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗(美 國(guó) Cell Signaling Technology試劑公司)；鼠抗IXAP多克隆一抗(美國(guó)Cell Signaling Technology試劑公司)；細(xì)胞裂解液；硝酸纖維膜(Millipore 中國(guó)有限公司)；5X蛋白上樣緩沖液(中國(guó))； 10X電泳緩沖液；TBS-T漂洗液。Matrigel膠(BD公司)；transwell小室(美國(guó)Millipore公司)。

2方法①細(xì)胞培養(yǎng)：肝癌細(xì)胞株SMMC7721和MHCC97-H在含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中于5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②RT-PCR：mRNA提取采用Takara公司RNAiso Plus(Total RNA提取試劑) 并按其說(shuō)明進(jìn)行操作，反轉(zhuǎn)錄采用Takara公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix并按其說(shuō)明書進(jìn)行操作，RT-PCR在Bio-Rad公司IQ5 實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行，采用Takara公司的PCR試劑盒SYBR Premix EX TaqTMII并按其說(shuō)明進(jìn)行操作。所用到的引物序列(5’-3’)：BTC正CCTGGGTCTAGTGATCCTTCA, BTC反CTTTCCGCTTTGATTGTGTGG，XIAP正GGG AAC AAC ATGCTAAATGG，XIAP反CTGCAACCAGAACCT CAAGT，β-actin正CATGTACGTTGCTATCCAGGC，β-actin反CTCCTTAATGTCACGCACGAT。③Western blot：取鋪滿培養(yǎng)皿底約80%～90%的細(xì)胞，4℃PBS清洗后加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解細(xì)胞，12000rpm離心10min吸取上清，留樣測(cè)定蛋白濃度，其余加入等體積2XSDS蛋白上樣緩沖液并煮沸5min準(zhǔn)備電泳。按照碧云天公司蛋白凝膠配置試劑盒說(shuō)明書配膠并上樣，120V電泳結(jié)束后以橫流170 mA,2 h的條件濕轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜,含5%BSA的TBST封閉1 h，按說(shuō)明書建議濃度稀釋一抗并于 4℃搖床搖晃過(guò)夜孵育,TBST洗滌5min×3次,以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫下緩慢搖晃孵育1h，TBST洗滌5 min×3次。使用Millipore公司增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒在Bio-RAD公司ChemicalDocTM XRS+顯影儀上發(fā)光顯影,并用Image Lab軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。④siRNA轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染分為3組：FAM-對(duì)照組：轉(zhuǎn)染時(shí)加FAM -inhibitors control+脂質(zhì)體2000，該組用來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，不再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)組：轉(zhuǎn)染時(shí)加入BTC inhibitors(IB)+脂質(zhì)體2000；陰性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染時(shí)加入陰性對(duì)照inhibitors(NC)+脂質(zhì)體2000。以上轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自吉瑪公司。轉(zhuǎn)染流程如下：胰酶消化細(xì)胞并接種至6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞融合達(dá)到60%～80%時(shí),棄去培養(yǎng)液，將150 pmol inhibitors和5μl 脂質(zhì)體2000加入250μl的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液分別進(jìn)行稀釋,充分混勻后室溫靜置5 min。將兩種稀釋液混勻，室溫靜置20 min后加入6孔板。經(jīng)過(guò)6 h培養(yǎng)后，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)待用。⑤Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：以不含血清的DMEM培養(yǎng)基按1∶5稀釋Matrigel 膠，均勻包被于Transwell小室膜上，室溫凝膠后吸出上清，將小室置入含200μl完全培養(yǎng)基的96孔板中。將siRNA轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行消化、洗滌并離心后，無(wú)血清培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml,吸取200μl細(xì)胞懸液加入上室。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，PBS淋洗小室，棉簽輕柔擦拭膜內(nèi)層細(xì)胞,無(wú)水酒精固定5 min后,結(jié)晶紫染色30min。將Transwell小室倒置于顯微鏡下,在200倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野,計(jì)數(shù)穿孔細(xì)胞。

結(jié)果

1肝臟細(xì)胞系和肝癌細(xì)胞系中BTC的表達(dá)情況見(jiàn)圖1。RT-PCR檢測(cè)人肝臟細(xì)胞系HL-7702和肝癌細(xì)胞系Huh7、HepG2、SMCC7721和MHCC97-H中BTC的mRNA表達(dá)情況，四種肝癌細(xì)胞系中BTC的mRNA表達(dá)量均高于肝臟細(xì)胞系(P<0.05),并且在侵襲能力更高的SMCC7721和MHCC97-H細(xì)胞系中BTC的表達(dá)量更高。Western blot檢測(cè)BTC蛋白表達(dá)也得到一致結(jié)果。選擇BTC高表達(dá)的SMCC7721和MHCC97-H進(jìn)行下一步siRNA轉(zhuǎn)染。

RT-PCR(A)和Western blot(B)示BTC在肝臟細(xì)胞系HL-7702和肝癌細(xì)胞系Huh7、HepG2、SMMC7721和MHCC97-H中的表達(dá)(*P<0.05,***P<0.001)

圖1肝臟細(xì)胞系和肝癌細(xì)胞系中BTC的表達(dá)情況

2轉(zhuǎn)染siRNA后SMCC7721和MHCC97-H細(xì)胞中BTC的表達(dá)變化見(jiàn)圖2。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的兩種細(xì)胞BTC mRNA和蛋白含量均顯著下調(diào)(P<0.001)。PCR所示SMCC7721和MHCC97-H中Tg737的敲減率分別為61.73%和63.44%。

(***P<0.001)

圖2 PCR(A)和Western blot(B)示轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)Tg737的結(jié)果

3下調(diào)BTC對(duì)SMMC-7721和MHCC97-H細(xì)胞侵襲能力的影響見(jiàn)圖3。通過(guò)Transewell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)， siRNA下調(diào)BTC的表達(dá)后，SMMC7721和MHCC97-H細(xì)胞的侵襲能力明顯下降(P<0.01)。

(**P<0.01)

4下調(diào)BTC通過(guò)抑制AKT-XIAP通路降低SMMC7721和MHCC97-H的侵襲能力 見(jiàn)圖4。檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA后SMMC7721和MHCC97-H細(xì)胞中XIAP的mRNA和蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)XIAP的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組SMMC7721和MHCC97-H中磷酸化的AKT蛋白減少，同時(shí)AKT蛋白的表達(dá)沒(méi)有變化。

(*P<0.05)

討論

人BTC基因定位于4號(hào)染色體長(zhǎng)臂上,其cDNA 全長(zhǎng)為1.3 kB,其開(kāi)放讀碼框共編碼178 個(gè)氨基酸形成BTC前體蛋白。成熟人BTC 為糖蛋白，由80 個(gè)氨基酸組成，分子量為18 kD。它首先由Song等[4]從小鼠胰腺β細(xì)胞瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并成功克隆，在胰腺、肝臟、腎臟等組織中都有較高表達(dá)。作為促癌因子EGF家族的一員，BTC主要與EGF受體家族中的ERBB-1 ( EGFR) 、ERBB-4同源二聚體結(jié)合,與ERBB-1、2、3、4 相互形成的異二聚體也有較低的親和性[5]。因此，BTC也被與腫瘤聯(lián)系起來(lái)。在肝癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌組織中都檢測(cè)到了BTC蛋白的高表達(dá)。我們課題組前期的研究中也發(fā)現(xiàn)BTC蛋白的高表達(dá)與肝癌的病例特征密切相關(guān)，提示BTC與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。

檢測(cè)正常肝臟細(xì)胞系HL-7702和四種肝癌細(xì)胞系中BTC的mRNA和蛋白表達(dá)我們發(fā)現(xiàn)，BTC在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于正常肝臟細(xì)胞系,并且隨著肝癌細(xì)胞系侵襲能力的增強(qiáng)呈現(xiàn)出表達(dá)升高的趨勢(shì)，提示BTC的高表達(dá)與肝癌細(xì)胞的侵襲能力密切相關(guān)。因此,我們通過(guò)siRNA轉(zhuǎn)染的方式在高表達(dá)BTC的SMMC7721和MHCC97-H細(xì)胞系中下調(diào)BTC的表達(dá)并檢測(cè)侵襲能力發(fā)現(xiàn),下調(diào)BTC明顯抑制了肝癌細(xì)胞的侵襲能力,但是其中的分子機(jī)制尚不清楚。

作為EGF家族的一員，BTC與其配體的結(jié)合可以激活細(xì)胞內(nèi)的PI3K/AKT通路[6]。對(duì)PI3 K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究表明，PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可以通過(guò)促進(jìn)金屬蛋白酶的分泌[7],提高腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，還可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)X 染色體連鎖的凋亡抑制蛋白(XIAP)的表達(dá)[8]。作為凋亡抑制蛋白(IAP)家族的一員,XIAP可以增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲能力，而且XIAP在肝癌組織中的高表達(dá)與肝癌的轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)[9]。那么，BTC與其配體的結(jié)合是否可以通過(guò)PI3K/AKT通路來(lái)促進(jìn)XIAP的表達(dá)并進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲能力呢？通過(guò)檢測(cè)siRNA下調(diào)BTC后SMCC7721和MHCC97-H細(xì)胞中AKT、p-AKT和XIAP的表達(dá)我們發(fā)現(xiàn)，下調(diào)BTC可以抑制AKT的磷酸化并降低XIAP的表達(dá)，說(shuō)明下調(diào)BTC可能是通過(guò)抑制PI3K/AKT-XIAP通路來(lái)抑制肝癌細(xì)胞的侵襲能力。

至此,我們通過(guò)siRNA下調(diào)肝癌細(xì)胞系SMMC7721和MHCC97-H中BTC的方式,說(shuō)明了BTC下調(diào)可以通過(guò)PI3K/AKT通路抑制XIAP的表達(dá),進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的侵襲能力,揭示了BTC調(diào)控

肝癌侵襲能力的分子機(jī)制，也為BTC靶向治療肝癌的開(kāi)展找到了有力證據(jù)。

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(收稿：2016-01-11)

Down-regulation of betacellulin expression inhibits invasion of hepatocellular carcinoma cell through repression of PI3K/AKT pathway Department of Hepatobiliary & Pancreas Surgery, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University

(Xi’an 710032) Li JunBai JuanDou Kefenget al

ABSTRACTObjective: To study the influence of betacellulin(BTC) down-regulation on invasion of hepatocellular carcinoma(HCC) cells and to explore its mechanism. Methods: After down-regulating the expression of BTC through siRNA transfection, the invasion ability of SMMC7721 and MHCC97-H cells were respectively measured by transwell invasion assay, and the PI3K/AKT-XIAP pathway that associated with the invasion of HCC were detected by RT-PCR and Western blot. Results: The invasion capacity of SMMC7721 and MHCC97-H cells were significantly inhibited through down-regulation of gene BTC, along with the PI3K/AKT-XIAP pathway. Conclusion: Down-regulation of BTC expression inhibits the invasion of SMMC7721 and MHCC97-H cells through the repression of PI3K/AKT-XIAP pathway.

KEY WORDSLiver neoplasmsCell proliferationBetacellulinTumor suppressor proteins

【中圖分類號(hào)】R735.7

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.06.001

·論著·基礎(chǔ)研究·

*國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(81030010)

陜西省社會(huì)發(fā)展公關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目[2009K12-02(9)]

△陜西省府谷縣人民醫(yī)院普外科

◇陜西省榆林市星元醫(yī)院內(nèi)二科

▲通訊作者