劉 準(zhǔn)，臧傳佼，易新健，陳申秒，3*

（1.山東濱州沃華生物工程有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省病原微生物實(shí)驗(yàn)室，山東 濱州 256600；3.山東省博萊威生物技術(shù)研究所，山東 濱州 256606）

山東省某豬場(chǎng)豬偽狂犬病的診斷鑒定及防治措施

劉 準(zhǔn)1，2，臧傳佼1，易新健1，2，陳申秒1，2，3*

（1.山東濱州沃華生物工程有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省病原微生物實(shí)驗(yàn)室，山東 濱州 256600；3.山東省博萊威生物技術(shù)研究所，山東 濱州 256606）

為了確診一起豬偽狂犬病的發(fā)生，采集送檢病料的肝臟、腎臟、脾臟、肺臟、腦等組織器官進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷和PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，病料中擴(kuò)增出了偽狂犬病病毒的特異性gE基因片段，通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)此次發(fā)生的偽狂犬病與2011年之后流行的偽狂犬流行毒株高度同源。綜合流行病學(xué)、病理解剖、實(shí)驗(yàn)室診斷，確定引起此次疾病的主要病原為豬偽狂犬病毒。

豬偽狂犬；流行毒株；診斷

偽狂犬病毒（PRV）是由皰疹病毒引起的可以多種動(dòng)物共患的急性、熱性傳染病。病毒可以通過(guò)直接接觸和間接接觸在易感豬中傳播，一般流行較快，發(fā)病較急。目前，疫苗免疫是防治本病的主要手段，豬場(chǎng)必須通過(guò)合理的疫苗免疫程序才能控制和消滅該病。但由于疫苗免疫不充分和疫苗不合理應(yīng)用仍會(huì)造成該病的發(fā)生。自2011年以來(lái)，一種由偽狂犬病毒變異株引起的豬偽狂犬病在我國(guó)爆發(fā)，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。2016年2月，山東省廣饒縣某養(yǎng)殖場(chǎng)育肥豬群爆發(fā)疑似偽狂犬病，經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀觀察、病理剖檢和實(shí)驗(yàn)室診斷，最終確診本次疫情為豬偽狂犬病，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 發(fā)病情況

據(jù)場(chǎng)主自述自2016年2月10號(hào)起，豬群中有豬只出現(xiàn)呼吸道癥狀，體溫升高到41.5℃左右，之后大群陸續(xù)發(fā)病并出現(xiàn)呼吸道癥狀，當(dāng)?shù)孬F醫(yī)診斷為喘氣病，讓其拌料飼喂泰妙菌素和氟苯尼考等藥物，同時(shí)對(duì)于食欲廢絕的豬只注射頭孢等抗生素，藥物治療后體溫回降，但大群呼吸道癥狀一直未見好轉(zhuǎn)，斷斷續(xù)續(xù)仍然有豬只死亡。發(fā)病豬日齡主要集中在4～5月齡的育肥豬，100頭左右。其中圈舍中有三圈育肥豬癥狀較為嚴(yán)重，豬只趴伏不起，精神沉郁，采食減退或廢絕。育肥豬群除在3日齡滴鼻豬偽狂犬病弱毒活疫苗，30日齡和60日齡分別免疫過(guò)2次豬瘟疫苗，其他疫苗均未免疫。豬群情況不容樂觀。養(yǎng)殖場(chǎng)遂于3月1號(hào)攜帶2頭病豬至沃華生物分子檢測(cè)中心求診，查找病因。

2 臨床癥狀及剖檢病變

病豬體溫升高在41℃左右，精神不振，食欲減退或廢絕。病豬呈典型的腹式呼吸，咳嗽，呼吸困難，病豬未見消瘦情況。其中，有1頭病豬有典型的神經(jīng)癥狀，盲目轉(zhuǎn)圈，側(cè)臥，四肢劃水狀。豬只死亡一段時(shí)間之后口鼻流出泡沫狀帶血的液體。

剖檢病死豬兩頭，病理變化主要表現(xiàn)為腹股溝淋巴結(jié)腫大、充血，頜下淋巴結(jié)充血、腫脹、壞死（圖1，A）；胸腔和腹腔有大量淡黃色透明狀液體，肺臟高度水腫，呈黑紅花斑狀（圖1，B）；扁桃體出血、潰瘍嚴(yán)重（圖1，C）；喉頭會(huì)厭軟骨出血（圖1，D），氣管內(nèi)有白色泡沫，肝臟腫脹，表面有些灰白色的壞死灶；脾臟腫大（圖1，E），腎臟腫大，腦有嚴(yán)重的充血積血（圖1，F(xiàn)）。綜合以上剖檢癥狀，初步診斷為偽狂犬感染。

圖1 病理剖檢Fig.1 Pathologic autopsy

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 細(xì)菌分離 無(wú)菌采取心包積液、肝臟、肺臟等進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，接種在含小牛血清及NAD的TSA瓊脂平板上培養(yǎng)24 h，結(jié)果無(wú)致病菌生長(zhǎng)。

3.2 PCR診斷 采集豬的腦、肺臟、肝臟、脾臟、淋巴結(jié)等組織的病變部位，采用RT-PCR和PCR的方法檢測(cè)豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環(huán)病毒、偽狂犬病毒等病原。

3.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank上公布的偽狂犬病毒基因設(shè)計(jì)合成1對(duì)gE基因特異性擴(kuò)增引物。引物序列：P1：5’-GACCCCAAGCGCGCC-3’，P2：5’-CGCGTAGTACCAGTCCAGCGT-3’。

3.2.2 病毒DNA提取 采集腦、肝、脾、淋巴結(jié)、扁桃體等組織器官進(jìn)行研磨勻漿，反復(fù)凍融3次后用OMEGA公司試劑盒（貨號(hào)D3892-02）對(duì)病毒核酸進(jìn)行提取。

3.2.3 PCR擴(kuò)增 使用TaKaRa公司（貨號(hào)DDR20AG）試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：DNA 2 μL，2×GC buffer I 2.5 μL，MgCl2（25 μM）1.5 μL，dNTP（2.5 mM）2 μL，上游引物（10 μM）1 μL，下游引物（10 μM）1 μL，Taq 0.3 μL，ddH2O 14.7 μL。 PCR反 應(yīng) 程 序 ： 94 ℃ 預(yù) 變 性5 min；94℃變性1 min、53℃退火30 s、72℃延伸1 min 30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min后4℃保存。

4 結(jié)果與分析

4.1 判定 實(shí)驗(yàn)室PCR檢測(cè)結(jié)果（圖2），除偽狂犬gE陽(yáng)性外，其他CSFV、PCV-2、PRRSV等病毒結(jié)果陰性。綜合臨床及剖檢癥狀，判斷該豬群發(fā)病的主要原因是由豬偽狂犬病毒感染導(dǎo)致。

圖2 PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Results of PCR

4.2 gE基因的測(cè)序 對(duì)PCR擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化和測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank上國(guó)內(nèi)外不同時(shí)間的毒株進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)該毒株與2011年以后流行的毒株同源性高達(dá)99.5%，通過(guò)對(duì)gE基因構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，本次疫情所分離的毒株與2011年以后的國(guó)內(nèi)的分離毒株親緣關(guān)系較近，屬于一個(gè)分支，與11年之前的國(guó)內(nèi)分離到的一些經(jīng)典毒株同屬一個(gè)大分支，而與國(guó)外的一些毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（遺傳進(jìn)化樹如圖3）。

5 防控措施

針對(duì)發(fā)病的豬群緊急接種偽狂犬弱毒疫苗2.5頭份，同時(shí)在飲水中加入多維，連用7 d，以減少疾病帶來(lái)的應(yīng)激，在飼料中添加保肝護(hù)腎和黃芪多糖等中藥，減輕疾病和前期用藥對(duì)肝臟和腎臟的損傷，增強(qiáng)抵抗力，同時(shí)也有利于豬群后期的恢復(fù)。經(jīng)過(guò)實(shí)地觀察發(fā)現(xiàn)，疫苗免疫后2 d未見明顯好轉(zhuǎn)，發(fā)病后期的豬（主要為腹式呼吸的豬只）仍有個(gè)別死亡，第3天癥狀較重的三圈舍的育肥豬有幾只可以自由活動(dòng)，采食。其他圈舍咳嗽、氣喘的豬只癥狀明顯減輕。疫苗免疫后第5天，豬只大群狀態(tài)基本正常，病情逐漸得到控制，總共死亡5頭，死亡率為5%。由于判斷及時(shí)準(zhǔn)確，疫苗免疫后成功控制住病情的發(fā)展。

6 討論

圖3 遺傳進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree

2011年以來(lái)，新一輪的偽狂犬病疫情在我國(guó)大部分地區(qū)爆發(fā)，新的疫情主要是架子豬和育肥豬出現(xiàn)典型的呼吸道癥狀[2]。國(guó)內(nèi)許多研究報(bào)道表明，我國(guó)目前大部分地區(qū)流行的偽狂犬病毒發(fā)生了變異[3-6]。哈爾濱獸醫(yī)研究所通過(guò)對(duì)當(dāng)前流行的偽狂犬病毒進(jìn)行全基因組以及各基因序列進(jìn)行比較分析，首次提出了偽狂犬病毒存在兩個(gè)主要的基因型，并且兩個(gè)基因型之間具有一定的地域性。歐美國(guó)家的毒株主要是基因Ⅰ型，亞洲國(guó)家的毒株主要是基因Ⅱ型，我國(guó)流行的偽狂犬毒株以基因Ⅱ型為主[7]。另外有研究報(bào)道，Bartha-k61株產(chǎn)生的中和抗體對(duì)目前變異毒株的中和能力遠(yuǎn)低于Bartha-k61株，表明偽狂犬變異毒株與經(jīng)典強(qiáng)毒株和傳統(tǒng)疫苗株存在一定的抗原差異[1，8-9]。在免疫保護(hù)方面，Bartha-k61株疫苗免疫后，用變異毒株進(jìn)行攻毒，豬群出現(xiàn)發(fā)熱、呼吸道癥狀和排毒，有部分豬只出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，但未出現(xiàn)豬群死亡現(xiàn)象[9-10]。

對(duì)于本次豬場(chǎng)爆發(fā)的偽狂犬病，通過(guò)對(duì)gE基因進(jìn)行同源比較和遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，引起豬場(chǎng)致病的野毒與2011年之后國(guó)內(nèi)分離到的流行變異株有很高的同源性，為新的偽狂犬病變異毒株。另外通過(guò)對(duì)豬群緊急免疫偽狂犬弱毒活疫苗，很好的控制住豬場(chǎng)的疫情表明，經(jīng)典株的疫苗仍能對(duì)變異株產(chǎn)生有效保護(hù)。對(duì)于防控目前流行的偽狂犬，增加經(jīng)典株的接種次數(shù)，能夠?qū)ωi群提供堅(jiān)強(qiáng)持久的保護(hù)[11]。萬(wàn)遂如教授[12]指出豬場(chǎng)不合理的使用疫苗，降低疫苗的免疫頻率，致使免疫空白期延長(zhǎng)；另外，一些豬場(chǎng)頻繁更換疫苗，有的豬場(chǎng)在兩年時(shí)間更換了4個(gè)廠家的疫苗（雙基因缺失疫苗、單基因缺失疫苗、弱毒活疫苗），在一定程度上為偽狂犬病毒的重組提供了條件，以上情況都給偽狂犬病毒的流行帶來(lái)了很多風(fēng)險(xiǎn)。

[1]彭金美，安同慶，趙鴻遠(yuǎn)，等.豬偽狂犬病病毒新流行株的分離鑒定及抗原差異性分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，35（1）：1-4.

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The diagnostic identification and prevention measures of Pseudorabies Virus from pig farm in Shandong Province

Liu Zhun1,2,Zang Chuanjiao1,Yi Xinjian1,2,Chen Shenmiao1,2,3
（1.Shandong Binzhou Wohua Biotech Co.,Ltd.,Shandong Binzhou 256600; 2.Shandong pathogenic microbiology laboratory,Shandong Binzhou 256600; 3.Shandong Bolaiwei Biological Technology Institute,Shandong Binzhou 256606)

To diagnose a suspected pseudorabies case,pathologic autopsy was performed and tissues of the pigs were collected for virus isolation and identification using PCR.The PRV gE gene was amplified from the tissues and its infection was confirmed.The swine Pseudorabies Virus was determined combined with epidemiology,anatomical pathology,laboratory diagnosis.The PCR product were analyzed by sequence alignment and showed that the isolate strain of this case shared highly homologous to the other strains that had been isolated after 2011,and confirmed the occurrence of this case was caused by a new wild pseudorabies virus.

Swine pseudorabies;Epidemic strain;Diagnose

S858.28

：B

：1672-9692(2016)09-0033-05

2016-07-20

劉準(zhǔn)（1984-），男，山東萊陽(yáng)人，碩士，研究方向：動(dòng)物傳染病的防控研究。

陳申秒（1983-），男，山東鄆城人，碩士，助理研究員，研究方向：動(dòng)物傳染病的診斷與防治。