王德功，魏麗娟，楊國(guó)輝，劉 欣，吳聰明，賈國(guó)賓*

（1.河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司，河北 石家莊 050041；2.河北省獸藥工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050041；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100193）

鹽酸多西環(huán)素與土霉素對(duì)胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的體外抑菌效果研究

王德功1，2，魏麗娟1，2，楊國(guó)輝1，2，劉 欣1，2，吳聰明3，賈國(guó)賓1，2*

（1.河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司，河北 石家莊 050041；2.河北省獸藥工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050041；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100193）

為研究鹽酸多西環(huán)素、土霉素對(duì)胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的抗菌活性，本試驗(yàn)采用微量肉湯稀釋法，對(duì)胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌進(jìn)行了體外藥敏試驗(yàn)。結(jié)果顯示，鹽酸多西環(huán)素對(duì)胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的MIC范圍為0.125～1.0 μg/mL，土霉素對(duì)胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的MIC范圍為0.125～1.0 μg/mL，兩種藥物對(duì)胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的體外抗菌活性相當(dāng)。結(jié)果表明，鹽酸多西環(huán)素和土霉素對(duì)胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌具有良好體外抑菌作用。

鹽酸多西環(huán)素；土霉素；胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌；體外抑菌試驗(yàn)

多西環(huán)素（Doxycycline）與土霉素（Oxytetracycline）均屬于四環(huán)素類(lèi)抗菌藥[1]，是臨床上廣泛應(yīng)用的廣譜抗生素[2]。多西環(huán)素又名強(qiáng)力霉素、脫氧土霉素，具有抗菌活性和組織穿透力更強(qiáng)、生物利用度高、體內(nèi)分布廣、半衰期較長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，在治療大腸桿菌病、沙門(mén)氏菌病、巴氏桿菌病及支原體感染等方面效果顯著[3]。土霉素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、支原體、衣原體、立克次體等引起的感染有效，也可用于治療梨形蟲(chóng)病、附紅細(xì)胞體病等[4]。

傳染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia，PCP）是由胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌（APP）引起的豬的一種高度傳染性呼吸道疾病，以急性出血和慢性纖維素性胸膜肺炎為特征，可造成患病豬死亡，在新進(jìn)豬群中多呈急性爆發(fā)[5]。其發(fā)病率在10%以上，最急性型的死亡率可高達(dá)80%～100%[6]。隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模化和集約化的發(fā)展，傳染性胸膜肺炎已成為嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要細(xì)菌性傳染病之一，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了極大的經(jīng)濟(jì)損失[7]。本試驗(yàn)旨在通過(guò)觀察鹽酸多西環(huán)素及土霉素對(duì)胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的體外抑菌活性，為臨床藥物合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試藥物 鹽酸多西環(huán)素（原料藥），含量84.50%，批號(hào)201312022，揚(yáng)州聯(lián)博藥業(yè)有限公司。

土霉素（原料藥），含量 90.20%，批號(hào)：141401074，赤峰制藥股份有限公司。

1.1.2 對(duì)照藥物 鹽酸多西環(huán)素（標(biāo)準(zhǔn)品），含量85.20%，批號(hào)130485-201202，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

土霉素（對(duì)照品），含量91.30%，批號(hào)K0031208（K0031208-01），購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 試驗(yàn)菌株 胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌，共計(jì)7株，均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。這些菌株均分離自豬胸膜肺炎病例，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定保存。

1.1.4 質(zhì)控菌株 大腸桿菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC29213，購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所（ATCC）。

1.1.5 培養(yǎng)基 MH肉湯培養(yǎng)基和MH瓊脂培養(yǎng)基（質(zhì)控菌用），批號(hào)分別為1211071和1302051；PPLO肉湯和PPLO瓊脂（測(cè)試菌用），批號(hào)分別為1211071和1302051。上述試劑購(gòu)自北京市陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 試驗(yàn)方法 按微量肉湯稀釋法進(jìn)行，測(cè)試步驟參照CLSI（2013，VET01-S2）。具體操作如下。

1.2.1 藥液配制 將鹽酸多西環(huán)素、土霉素分別用滅菌蒸餾水配制成1 280 μg/mL的貯備液，過(guò)濾除菌，-20℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液制備 質(zhì)控菌株（大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC29213）分別用MH肉湯復(fù)活，測(cè)試菌株（胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌）用PPLO肉湯（添加1%NAD和5%豬血清）復(fù)活。質(zhì)控菌株復(fù)活后接種于MH瓊脂平板，測(cè)試菌株復(fù)活后接種于PPLO瓊脂（添加1% NAD和5%豬血清）平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，分別挑取1～3個(gè)單菌落接種于MH肉湯或PPLO肉湯，置37℃孵育16～18 h。將原菌液用相應(yīng)液體培養(yǎng)基按1:1 000稀釋作為試驗(yàn)菌液。

1.2.3 接種培養(yǎng) 將兩種藥物貯備液分別用MH肉湯培養(yǎng)基（質(zhì)控菌用）或PPLO肉湯（測(cè)試菌用）依次倍比稀釋成 128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL，用微量加液器將稀釋好的藥液依次加入微孔板每排，每孔50 μL，第12孔加不含藥物的培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。用微量加液器將試驗(yàn)菌液依次加入微孔板每排，每孔50 μL，這樣每孔內(nèi)藥物的最后濃度為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.063 μg/mL，第12孔為不含藥物的陰性對(duì)照?；靹?，將微量板置于墊有濕紗布的搪瓷方盤(pán)內(nèi)，置37℃培養(yǎng)18～24 h觀察結(jié)果。

1.2.4 MIC判定 在襯有黑底板的光線(xiàn)下觀察，細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)小孔內(nèi)培養(yǎng)液呈彌散狀渾濁或U形底部有圓形或絲網(wǎng)狀沉淀，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)孔的最低藥物濃度即為該藥物的MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽酸多西環(huán)素和土霉素對(duì)質(zhì)控菌和測(cè)試菌的體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。數(shù)據(jù)顯示，鹽酸多西環(huán)素和土霉素對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）在質(zhì)控范圍內(nèi)（大腸桿菌0.5～2.0 μg/mL；金葡菌0.125～1.0 μg/mL），表明試驗(yàn)所用試劑（培養(yǎng)基）和操作方法合乎要求，檢測(cè)數(shù)據(jù)可信。

2.2 數(shù)據(jù)可見(jiàn)，鹽酸多西環(huán)素原料藥對(duì)7株胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的MIC范圍為0.125～1.0 μg/mL，鹽酸多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)7株胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的MIC范圍為0.063～0.5 μg/mL。鹽酸多西環(huán)素原料藥和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的體外抗菌活性基本相當(dāng)。

2.3 數(shù)據(jù)可見(jiàn)，土霉素原料藥對(duì)7株胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的MIC范圍為0.125～1.0 μg/mL，土霉素對(duì)照品對(duì)7株胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的MIC范圍為0.063～1.0 μg/mL。土霉素原料藥和對(duì)照品對(duì)胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的體外抗菌活性也基本相當(dāng)。

2.4 測(cè)定數(shù)據(jù)顯示，鹽酸多西環(huán)素對(duì)胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的體外抗菌活性與土霉素相當(dāng)。兩種藥物原料藥的體外抗菌活性也與它們的標(biāo)準(zhǔn)品（或?qū)φ掌罚┫喈?dāng)。且鹽酸多西環(huán)素、土霉素對(duì)7株胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的MIC≤1 μg/mL，根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）的判定標(biāo)準(zhǔn)均為敏感。

表1 鹽酸多西環(huán)素和土霉素對(duì)豬源胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的體外藥敏檢測(cè)結(jié)果Table1 In vitro susceptibility test results of doxycycline and oxytetracycline hydrochloride on porcine Actinobacillus pleuropneumoniae

3 討論

3.1 胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌屬巴氏桿菌科嗜血桿菌屬，后根據(jù)其表型和DNA雜交水平均與放線(xiàn)桿菌屬模式種密切相關(guān)，歸屬為巴氏桿菌科放線(xiàn)桿菌屬[8]，目前已報(bào)道的APP有15個(gè)血清型，15個(gè)血清型又分為生物Ⅰ型和生物Ⅱ型[9]。由于其血清型眾多，具有地方特異性，同時(shí)各血清型之間也很難產(chǎn)生較強(qiáng)的交叉保護(hù)作用，疫苗免疫常常面臨交叉保護(hù)作用不強(qiáng)的問(wèn)題，影響其防控效果，所以抗菌藥物成為控制這種病的主要手段[10]，臨床上常用先鋒霉素、阿莫西林、頭孢噻呋、替米考星、四環(huán)素、氯霉素等治療該病[11]。鹽酸多西環(huán)素和土霉素作為臨床上廣泛應(yīng)用的廣譜抗生素，對(duì)胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌具有良好的體外抑菌作用，因此開(kāi)發(fā)用于防治豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌感染的鹽酸多西環(huán)素和土霉素制劑，有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

3.2 由于胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌易產(chǎn)生耐藥性[12]，隨著臨床生產(chǎn)實(shí)踐中抗菌藥物大量的使用，其耐藥性也越來(lái)越嚴(yán)重。郭慶河[13]報(bào)道對(duì)新疆昌吉地區(qū)經(jīng)過(guò)檢測(cè)的9株APP進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌對(duì)鹽酸多西環(huán)素敏感，其敏感率分別為77.8%；楊瑞晨[14]報(bào)道對(duì)來(lái)自四川廣安、層山等地區(qū)疑似病料進(jìn)行APP分離獲得9株分離株進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)研究，結(jié)果表明9株分離株均四環(huán)素耐藥；李海利等[15]報(bào)道對(duì)分離的7株APP進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果表明對(duì)四環(huán)素、鹽酸多西環(huán)素耐藥；本試驗(yàn)中鹽酸多西環(huán)素、土霉素對(duì)胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的MIC范圍均為0.125～1.0 μg/mL，處于敏感狀態(tài)。但隨著鹽酸多西環(huán)素在臨床中的廣泛應(yīng)用，菌株有可能會(huì)產(chǎn)生耐藥。因此建議臨床應(yīng)加強(qiáng)分離菌的藥物敏感性監(jiān)測(cè)，以提高用藥針對(duì)性，保證療效。

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Studies on the Antibacterial Activity of Doxycycline Hydrochloride and Oxytetracycline against Actinobacillus Pleuropneumoniae in vitro

Wang Degong1,2,Wei Lijuan1,2,Yang Guohui1,2,Liu Xin1,2,Wu Congming3,Jia Guobin1,2*
（1.Hebei Yuanzheng Pharmaceutical Co.,Ltd,Hebei Shijiazhuang 050041; 2.Hebei provincial veterinary Engineering Technology Research Center,Hebei Shijiazhuang 050041; 3.China Agricultural University,Beijing 100193）

In order to study the antibacterial activity of doxycycline hydrochloride and oxytetracycline against Actinobacillus pleuropneumoniae,This experiment adopts the broth microdilution method of Actinobacillus pleuropneumoniae by drug sensitivity test in vitro.The results showed that the MIC of doxycycline hydrochloride against Actinobacillus pleuropneumoniae was 0.125～1.0 μg/mL,the MIC of oxytetracycline against Actinobacillus pleuropneumoniae was 0.125～1.0 μg/mL. The antimicrobial activity in vitro of the two drugs were equivalent against Actinobacillus pleuropneumoniae.The results show that doxycycline hydrochloride and oxytetracycline has good antibacterial activity against Actinobacillus pleuropneumoniae in vitro.

Doxycycline Hydrochloride;Oxytetracycline;Actinobacillus pleuropneumoniae;Antibacterial experiment in vitro

S855.12

：B

：1672-9692(2016)09-0016-04

2016-06-11

王德功（1981-），男，工程師，大學(xué)本科，學(xué)士，研究方向：藥劑學(xué)及畜禽疾病。

賈國(guó)賓（1964-）男，大學(xué)本科，學(xué)士，高級(jí)工程師，研究方向：藥劑學(xué)及畜禽疾病。

石家莊市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃課題項(xiàng)目（131200083A）。