任　曼　宮碧霜　靳二輝　李升和　曾祥芳　譙仕彥*

(1.安徽科技學院動物科學學院，鳳陽233100；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，北京100193)

營養(yǎng)、大腸桿菌和氨基酸對豬小腸上皮細胞抗菌肽和信號通路蛋白表達的影響

任曼1,2宮碧霜1靳二輝1李升和1曾祥芳2譙仕彥2*

(1.安徽科技學院動物科學學院，鳳陽233100；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，北京100193)

摘要：為了研究應激和氨基酸對上皮抗菌肽表達的作用和分子機制，試驗選用豬小腸上皮細胞系IPEC-J2作為研究對象，饑餓和大腸桿菌感染分別作為營養(yǎng)應激和細菌應激，丙氨酸和異亮氨酸作為氨基酸處理，收集細胞mRNA，利用熒光定量PCR測定β防御素和相關信號通路蛋白表達水平。結(jié)果表明：與對照組(DMEM/F12培養(yǎng)基)相比，饑餓顯著降低了小腸上皮細胞豬防御素2(pBD-2)、豬防御素3(pBD-3)和豬防御素EP2c(pEP2c)及沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1(Sirt1)、叉頭轉(zhuǎn)錄因子1(FoxO1)和叉頭轉(zhuǎn)錄因子4(FoxO4)的表達(P<0.05)，大腸桿菌對β防御素表達無顯著影響(P>0.05)。與對照組(饑餓培養(yǎng)基)相比，丙氨酸處理未顯著影響pBD-2和pBD-3的表達(P>0.05)，但顯著提高了pEP2c表達水平(P<0.05)；異亮氨酸處理使pBD-2、pBD-3和pEP2c表達水平顯著升高(P<0.05)。與對照組相比，丙氨酸和異亮氨酸處理不同程度影響信號通路蛋白轉(zhuǎn)錄，丙氨酸處理顯著提高了Sirt1和FoxO4的表達水平(P<0.05)，異亮氨酸處理顯著促進了Sirt1、FoxO1和FoxO4的表達(P<0.05)。由此得出，營養(yǎng)應激降低豬小腸上皮細胞中β防御素的表達，而氨基酸的補充可促進其表達，該調(diào)控作用可能與Sirt1和叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FoxO)信號通路蛋白有關。

關鍵詞：豬小腸上皮細胞；抗菌肽；防御素；信號通路；Sirt1；FoxO

抗生素在畜禽生產(chǎn)中的應用歷史超過50年之久，主要用于減少畜禽發(fā)病率、提高生產(chǎn)速度和飼料利用率，然而，濫用抗生素引發(fā)眾多人畜病原菌產(chǎn)生耐藥性，直接危害全球公共健康[1]。研究表明，短期使用低劑量抗生素會造成豬腸道內(nèi)微生物耐藥性基因的數(shù)量和多樣性增加[2]。研究開發(fā)提高動物免疫力和抗病力的策略迫在眉睫，近年發(fā)現(xiàn)通過營養(yǎng)調(diào)控手段提高畜禽腸道先天性免疫功能成為可行策略之一[3]。

哺乳動物內(nèi)源合成的抗菌肽(antimicrobial peptide，AMP)具有廣譜抗菌作用，其種類多樣且功能復雜，參與組成機體先天性免疫系統(tǒng)，微生物對其不易產(chǎn)生抗性[4]。位于腸道表面的上皮細胞可分泌大量多樣AMP，以抵擋復雜的微生物環(huán)境和病原微生物入侵[4]，與腸上皮黏膜表面分泌型免疫球蛋白A(sIgA)共同形成先天免疫屏障[5]。近年關于AMP參與免疫調(diào)節(jié)的研究日益增多，它們可通過趨化途徑和調(diào)控Toll樣受體(TLR)信號強度發(fā)揮免疫調(diào)控功能[6]。目前，在豬體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)25種AMP，分別為11種cathelicidins、12種防御素、1種saposin和1種cecropin[7]。研究發(fā)現(xiàn)，多種因素可影響和調(diào)控內(nèi)源AMP表達，包括發(fā)育階段、損傷、營養(yǎng)物質(zhì)(如維生素D、短鏈脂肪酸、氨基酸等)及脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等。前期研究發(fā)現(xiàn)異亮氨酸可調(diào)控斷奶仔豬腸道黏膜免疫功能，并對AMP表達具有一定的促進作用[8]。但關于營養(yǎng)水平對豬腸上皮細胞AMP表達的影響的研究較少，有關AMP誘導表達的分子機制知之甚少。因此，本研究以豬小腸上皮細胞系IPEC-J2為模型，研究營養(yǎng)和細菌應激及不同氨基酸處理對小腸上皮細胞AMP和信號通路蛋白表達的影響，旨在為研究應激和營養(yǎng)素調(diào)控內(nèi)源AMP表達及腸上皮黏膜屏障功能的提高提供借鑒，也為免疫促進功能的營養(yǎng)物質(zhì)篩選提供理論基礎。

1材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)

豬腸上皮細胞系IPEC-J2為本實驗室保存，受贈于伍國耀教授(Texas A & M University)。該細胞系分離自新生仔豬空腸上皮，單層貼壁生長，其培養(yǎng)基為含5%(體積分數(shù))胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Gibco，美國)、1%胰島素硒(insulin transferrin selenium，ITS)(ScienCell，美國)和1 μg/L內(nèi)皮生長因子(endothelial growth factor，EGF)(Sigma，美國)的DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone，中國)。

1.2試驗設計和處理

豬小腸上皮細胞IPEC-J2接種于6孔板，加入完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)至80%細胞愈合時進行試驗。營養(yǎng)與大腸桿菌應激：棄去待處理細胞的細胞液，換新的培養(yǎng)基，其中對照組為DMEM/F12培養(yǎng)基，饑餓組為饑餓培養(yǎng)基(Earle’s鹽平衡緩沖液+維生素混合液)，大腸桿菌組為DMEM/F12培養(yǎng)基+1×103CFU/孔大腸桿菌，處理12 h后收集細胞。氨基酸處理：棄去待處理細胞的細胞液，加入以下處理培養(yǎng)基：對照組為饑餓培養(yǎng)基，丙氨酸組為饑餓培養(yǎng)基中添加1.0 mmol/L的丙氨酸(異亮氨酸等氮組)，異亮氨酸組為饑餓培養(yǎng)基中添加1.0 mmol/L的異亮氨酸，處理12 h后收集細胞。

1.3總mRNA提取和反轉(zhuǎn)錄

1.4基因引物設計

內(nèi)參基因(β-actin)、AMP基因[豬防御素2(pBD-2)、豬防御素3(pBD-3)和豬防御素EP2c(pEP2c)]以及信號通路蛋白基因[沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1(Sirt1)、叉頭轉(zhuǎn)錄因子1(FoxO1)和叉頭轉(zhuǎn)錄因子4(FoxO4)]引物通過Primer Premier 6.0軟件設計，由北京三博志遠生物技術有限公司合成。根據(jù)梯度PCR和瓊脂糖凝膠電泳檢測引物的最適退火溫度和擴增片段的特異性，無引物二聚體和非特異擴增的引物可用，引物序列見表1。

1.5熒光定量PCR

將所提cDNA經(jīng)相應引物PCR擴增后，回收基因片段，按10-1～10-9倍連續(xù)稀釋，選擇10-2～10-98個梯度繪制標準曲線，每個梯度3個重復，進行預試驗，驗證引物擴增效率。將反轉(zhuǎn)的cDNA作為模板進行熒光定量PCR，按照SYBR Green定量PCR試劑盒(TaKaRa，中國)操作，采用10 μL反應體系，其中檢測β-actin時cDNA量為1/20，檢測目的基因時cDNA量為1/10，熒光定量PCR在ABI7500快速檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國)中進行。PCR反應程序為：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 10 s，42個循環(huán)。

1.6數(shù)據(jù)分析

根據(jù)2-△△CT法分析基因表達情況，以內(nèi)參基因為參照，獲得目的基因相對表達量，每個處理3個重復。相對表達量數(shù)值采用SAS 8.1(SAS Institute，Gary，美國)單因子方差分析(one-way ANOVA)模型進行統(tǒng)計分析，若處理間差異顯著，用Duncan氏法多重比較進行檢驗。試驗結(jié)果均以平均值±標準誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1應激和氨基酸處理對IPEC-J2AMP表達的影響

豬小腸上皮細胞系單層貼壁生長(圖1)，增長速度快，當細胞愈合至90%以上時生長速率降低。本研究篩選出3種豬AMP基因引物用于熒光定量PCR，均為β防御素，分別為pBD-2、pBD-3和pEP2c。營養(yǎng)和大腸桿菌應激對豬腸上皮細胞系IPEC-J2防御素轉(zhuǎn)錄水平的影響見圖2。結(jié)果表明，與對照組相比，細胞液中加入1×103CFU/孔大腸桿菌并未顯著影響pBD-2、pBD-3和pEP2c的表達(P>0.05)；而饑餓應激則顯著降低了防御素的表達(P<0.05)，其中pBD-2表達水平降至對照組的47%，pBD-3降至58%，pEP2c降至25%。與對照組相比，丙氨酸和異亮氨酸處理后，發(fā)現(xiàn)丙氨酸未顯著影響pBD-2和pBD-3表達(P>0.05)，但顯著提高了pEP2c表達(P<0.05)；而異亮氨酸則

顯著促進了3種防御素表達(P<0.05)，pBD-2表達升高至5.68倍，pBD-3表達升高至9.94倍，pEP2c升高至5.34倍。丙氨酸作為異亮氨酸的等氮對照處理，旨在說明異亮氨酸對防御素的誘導表達是其本身作用還是氮素的作用，以上結(jié)果說明氮素的補充可影響防御素pEP2c的表達，但異亮氨酸對防御素表達具有較強的促進作用，此作用與氮素無關。

表1　熒光定量PCR引物序列

圖1　豬小腸上皮細胞系IPEC-J2

2.2營養(yǎng)應激和氨基酸處理對信號通路蛋白轉(zhuǎn)錄水平的影響

本試驗選用3種信號通路蛋白，分別是Sirt1、FoxO1和FoxO4。結(jié)果顯示，與對照組相比，饑餓應激顯著降低了IPEC-J2細胞內(nèi)信號通路蛋白的表達(P<0.05)，Sirt1表達水平降低至對照組的36%，F(xiàn)oxO1降低至31%，F(xiàn)oxO4降低至39%(圖3)。與對照組相比，丙氨酸和異亮氨酸均不同程度影響信號通路蛋白的轉(zhuǎn)錄，其中，丙氨酸顯著提高了Sirt1(2.13倍)和FoxO4(3.16倍)的表達水平(P<0.05)，異亮氨酸顯著促進了Sirt1(30.76倍)、FoxO1(3.45倍)和FoxO4(3.00倍)表達(P<0.05)。

3討論

動物腸道黏膜面臨大量挑戰(zhàn)，如維持共生菌群平衡和阻止病原微生物入侵。腸上皮表面的AMP在抵御微生物過程中扮演重要角色，這些“天然抗生素”屬于進化古老的先天性免疫效應因子[9]。其中，β防御素是目前研究最為深入和存在最為廣泛的AMP之一，它一方面可阻止上皮表面微生物的入侵，另一方面參與機體免疫調(diào)節(jié)[10]。近年研究表明，豬腸道上皮組織可表達多種β防御素[11]。豬小腸細胞系IPEC-J2是一種未完全分化的腸上皮細胞，分離于初生仔豬空腸上皮組織，其保持了腸道細胞的多種特性，如表達β防御素等[12]。為研究營養(yǎng)和微生物應激以及氨基酸對小腸上皮細胞AMP表達的作用，本試驗篩選到IPEC-J2可表達的3種豬源β防御素(即pBD-2、pBD-3和pEP2c)引物。

同基因數(shù)據(jù)柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

Value columns of a gene with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

圖2應激(A)和氨基酸處理(B)對IPEC-J2細胞中防御素表達的影響

Fig.2Effects of stress (A) and amino acid treatments (B) on defensin expression in IPEC-J2 cells

圖3　營養(yǎng)應激(A)和氨基酸處理(B)對IPEC-J2細胞中信號通路蛋白表達的影響

內(nèi)源AMP的表達和活性受多種因素調(diào)控，如細菌和LPS、營養(yǎng)供給和一些功能性營養(yǎng)物質(zhì)等。Muturi等[13]和Becker等[14]研究發(fā)現(xiàn)饑餓可增加埃及伊蚊和果蠅防御素表達，而Akoda等[15]研究結(jié)果表明饑餓未影響舌蠅體內(nèi)AMP的表達，而大腸桿菌卻可刺激其表達。與前人研究結(jié)果不同，本試驗發(fā)現(xiàn)去除培養(yǎng)基中氨基酸對IPEC-J2細胞造成營養(yǎng)應激可顯著降低防御素的表達，但大腸桿菌未顯著影響防御素表達。本試驗中大腸桿菌添加濃度為103CFU/mL，Akoda等[15]研究添加10 mL OD600 nm為0.5的大腸桿菌菌體，可能是由于添加量上的差異造成上述結(jié)果不同。有關饑餓和細菌對哺乳動物細胞AMP作用的研究較為缺乏，因種屬、試驗對象(體內(nèi)和體外)和防御素種類的不同造成了以上結(jié)果的差異，關于營養(yǎng)和細菌應激對AMP的影響仍需更多的研究。近期研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸能夠促進不同的上皮細胞表達β防御素，F(xiàn)ehlbaum等[16]報道3.12～12.50 μg/mL異亮氨酸可顯著促進牛腎上皮細胞中β防御素的表達，但當濃度≥25 μg/mL時這種促進作用明顯降低。Sherman等[17]研究發(fā)現(xiàn)100～250 μg/mL異亮氨酸能夠促進人結(jié)腸癌細胞系(HCT-116)中人β防御素1表達，Konno等[18]也報道細胞培養(yǎng)基中添加5～50 μg/mL的異亮氨酸可提高人結(jié)腸上皮細胞系Caco-2中人β防御素2的表達。本試驗發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加1.0 mmol/L(約131 μg/mL)異亮氨酸可顯著促進β防御素的表達，此結(jié)果與前人研究一致，而添加等氮量丙氨酸卻未見此作用，說明異亮氨酸的作用并非是由于補充氮源而影響防御素的轉(zhuǎn)錄。

通過氨基酸饑餓造成的營養(yǎng)應激和氨基酸的補充均屬于營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)控范疇。研究表明，調(diào)節(jié)控制動物體內(nèi)AMP表達的信號通路有核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白(Sirt)和叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FoxO)等[4]。其中，NF-κB信號通路主要是細菌、LPS和感染等影響AMP表達的作用通路[19]，本研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)大腸桿菌對防御素的影響，因此未測定該通路蛋白的變化。氨基酸相關的信號通路主要有絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Sirt、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、FoxO等[20-21]，由此可見，氨基酸可能是Sirt和FoxO信號通路調(diào)控AMP表達。Sirt1是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依賴去乙?；福轻劸平湍赋聊畔⒄{(diào)節(jié)因子2同源蛋白2(Sirt2)基因在哺乳動物體內(nèi)的同源基因，目前有關其研究主要集中在壽命調(diào)控方面[22]。近年，越來越多的研究表明Sirt1還是一種重要的營養(yǎng)物質(zhì)敏感性生長調(diào)節(jié)因子[23]。D’Antona等[24]研究發(fā)現(xiàn)，支鏈氨基酸(包括異亮氨酸)可影響大鼠體內(nèi)Sirt1的表達水平。FoxO是叉頭(forkhead)蛋白家族的一個亞群，從蠕蟲到人類均有表達，其在哺乳動物細胞中分別由4個基因編碼組成：FoxO1、叉頭轉(zhuǎn)錄因子3(FoxO3)、FoxO4和叉頭轉(zhuǎn)錄因子6(FoxO6)。作為一種轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)oxO家族參與調(diào)控細胞增殖、免疫反應和機體壽命[25]。應激和營養(yǎng)物質(zhì)可通過FoxO依賴通路調(diào)節(jié)Sirt1[26]，而Sirt1可直接影響防御素的表達[27]。Becker等[14]研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)應激可影響FoxO的活化程度，進而調(diào)節(jié)AMP表達。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)應激在降低防御素表達的同時也降低了Sirt1和FoxO表達水平，而異亮氨酸則顯著促進了防御素以及信號通路蛋白Sirt1和FoxO的表達，其中對Sirt1的促進作用最為強烈，丙氨酸促進了pEP2c以及信號通路蛋白Sirt1和FoxO4的表達，但程度顯著低于異亮氨酸，驗證了前人研究結(jié)果，說明營養(yǎng)應激與氨基酸對防御素表達的調(diào)控與Sirt1和FoxO信號通路有關，但信號通路蛋白對不同氨基酸的應答反應程度各不相同，具體調(diào)控通路還需進一步的研究。

4結(jié)論

綜上，營養(yǎng)應激可降低豬小腸上皮細胞中β防御素的表達，而氨基酸的補充可促進β防御素表達，其中異亮氨酸的促進作用最為顯著。營養(yǎng)應激和氨基酸對防御素的調(diào)控作用可能與Sirt1和FoxO信號通路蛋白有關。

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(責任編輯田艷明)

Effects of Nutrition,Escherichiacoliand Amino Acids on Expression of Antimicrobial Peptide and Signaling Pathway Protein in Porcine Intestinal Epithelial Cells

REN Man1,2GONG Bishuang1JIN Erhui1LI Shenghe1ZENG Xiangfang2QIAO Shiyan2*

(1. College of Animal Science, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China;2. College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China)

Abstract:To investigate the effects and molecular mechanism of stress and amino acids on epithelial antimicrobial peptide, porcine intestinal epithelial cell line IPEC-J2 was treated with starvation (as nutritional stress), Escherichia coli (as bacterial stress), alanine or isoleucine (both as amino acid treatments), and cell mRNA was collected. Then the expression levels of β-defensins and signaling pathway protein were tested using real-time quantitative PCR. From results, we found compared with the control group (with DMEM/F12 medium), starvation treatment significantly decreased the expression levels of porcine β-defensin 2 (pBD-2), porcine β-defensin 2 (pBD-3), porcine β-defensin EP2c (pEP2c), silent mating type information regulation 2 homolog 1 (Sirt1), forkhead transcription factor 1 (FoxO1) and forkhead transcription factor 4 (FoxO4) (P<0.05), but Escherichia coli treatment had no significant effects on β-defensin expression (P>0.05). Compared with the control group (with starvation medium), alanine treatment significantly increased pEP2c expression level (P<0.05), but did not significantly change the expression of pBD-2 and pBD-3, and the expression levels of pBD-2, pBD-3 and pEP2c in isoleucine group were significantly increased (P<0.05). Signaling pathway protein transcription was different affected by alanine and isoleucine treatments. Compared with the control group, the expression levels of Sirt1 and FoxO4 in alanine group were significantly increased and isoleucine treatment significantly increased the expression of Sirt1, FoxO1 and FoxO4 (P<0.05). In conclusion, nutritional stress can increase β-defensin expression in intestinal epithelial cells, and amino acid supplementation can promote its expression. The mechanism of defensin regulation is related to Sirt1 and forkhead transcription factor (FoxO) signaling pathway protein.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(5)：1489-1495]

Key words:porcine intestinal epithelial cell; antimicrobial peptide; defensin; signaling pathway; Sirt1; FoxO

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.05.025

收稿日期：2015-12-25

基金項目：國家自然科學基金(31501968)；安徽省高校自然科學研究項目(KJ2015A296)；安徽省自然科學基金(1608085QC72)；安徽科技學院高層次人才引進項目(ZRC2014453)

作者簡介：任曼(1986—)，女，安徽淮北人，博士，動物營養(yǎng)與飼料科學專業(yè)。E-mail: renman@yeah.net *通信作者：譙仕彥，教授，博士生導師，E-mail: qiaoshy@mafic.ac.cn

中圖分類號：S811

文獻標識碼：A

文章編號：1006-267X(2016)05-1489-07

*Corresponding author, professor, E-mail: qiaoshy@mafic.ac.cn