毛敬，韓志敏，周木蘭，董玲玲

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持續(xù)性牽張力在高糖狀態(tài)下對子宮平滑肌細(xì)胞收縮蛋白表達(dá)的影響

毛敬，韓志敏，周木蘭，董玲玲

【摘要】目的：探討持續(xù)性牽張力在高糖環(huán)境下對大鼠子宮平滑肌細(xì)胞催產(chǎn)素受體和前列腺素受體表達(dá)的影響。方法：體外培養(yǎng)大鼠子宮平滑肌細(xì)胞，高糖作用不同時間后，觀察高糖狀態(tài)下大鼠子宮平滑肌細(xì)胞催產(chǎn)素受體和前列腺素受體表達(dá)變化情況。對高糖狀態(tài)下的肌細(xì)胞施加持續(xù)性牽張力，明確牽張力對肌細(xì)胞催產(chǎn)素受體和前列腺素受體表達(dá)的影響以及高糖和牽張力之間的協(xié)同作用，同時采用晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）抑制劑（sRAGE）拮抗高糖作用作為對照，比較加入抑制劑后，催產(chǎn)素受體和前列腺素受體表達(dá)變化情況。結(jié)果：單獨(dú)高糖培養(yǎng)或單獨(dú)持續(xù)性牽張力都可導(dǎo)致大鼠子宮平滑肌細(xì)胞裂解液中催產(chǎn)素受體和前列腺素受體表達(dá)量上升，二者同時施加，可使催產(chǎn)素受體和前列腺素受體表達(dá)進(jìn)一步上升，并有一定的協(xié)同效應(yīng)。加入sRAGE后均可使催產(chǎn)素受體和前列腺素受體表達(dá)部分下降，但仍高于生理糖濃度組。結(jié)論：高糖狀態(tài)及牽張力均可促進(jìn)肌細(xì)胞催產(chǎn)素受體和前列腺素受體表達(dá)增加，并有一定協(xié)同作用，AGEs參與了這一過程，但并不是唯一途徑。

【關(guān)鍵詞】應(yīng)力，物理；葡萄糖；子宮；肌細(xì)胞，平滑肌；收縮蛋白質(zhì)類；受體，催產(chǎn)素；受體，前列腺素

作者單位：200126上海，同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院

（J Int Obstet Gynecol，2016，43：230-233）

妊娠期糖尿病是目前婦產(chǎn)科臨床上常見的一種疾病，國內(nèi)統(tǒng)計其發(fā)生率將近占全部孕婦的20%［1］，并有逐年上升趨勢，對孕婦和胎兒均有不同程度的危害，其并發(fā)癥的發(fā)生率與孕婦妊娠期糖尿病的嚴(yán)重程度成正比。平滑肌是子宮最主要的成分，妊娠期糖尿病患者子宮平滑肌組織處于一個特殊的環(huán)境，不僅受高糖環(huán)境的影響，也受妊娠時子宮膨大的牽張力的影響，子宮肌肉組織收縮活性的異常，易引發(fā)流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎盤功能不全和胎兒發(fā)育異常等并發(fā)癥。目前研究表明高糖環(huán)境或牽張力可導(dǎo)致多種細(xì)胞增殖活性降低，引發(fā)凋亡現(xiàn)象［2-4］，但關(guān)于高血糖對子宮肌肉組織收縮蛋白有何影響、是通過何種途徑實(shí)現(xiàn)的以及牽張力在其中的作用，目前尚少見報道。另有研究表明，高糖狀態(tài)下晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）聚集，與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合，進(jìn)而可以通過多種方式激活下游因子并影響細(xì)胞功能，可溶性RAGE（sRAGE）可競爭性與AGEs結(jié)合，從而阻斷AGEs與RAGE的結(jié)合，抑制AGEs的功能［5-6］，包括細(xì)胞增殖、分化及凋亡等。本實(shí)驗通過體外培養(yǎng)大鼠子宮平滑肌細(xì)胞，闡明在高糖環(huán)境和牽張力雙重作用下，子宮平滑肌細(xì)胞相關(guān)收縮蛋白催產(chǎn)素受體和前列腺素受體表達(dá)的變化情況，并進(jìn)一步明確AGEs抑制劑對此過程的調(diào)控作用，以期為降低妊娠期糖尿病并發(fā)癥提供參考。

1　材料與方法

1.1試劑和儀器胎牛血清（美國Gibco公司），細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM，美國Gibco公司），胰蛋白酶（美國Amresco公司），Triton X-100（美國Sigma公司），乙二胺四乙酸（EDTA，美國Amresco公司），酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海研域化學(xué)試劑有限公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國ThermoForma公司），ELx800 uv型酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Bio-Tek公司），TDZSWS型自動平衡高速離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司），TGL-16G型高速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），溫控超速離心機(jī)（德國Eppendorf公司），F(xiàn)V500激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司），倒置相差顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2大鼠肌細(xì)胞預(yù)處理分離培養(yǎng)正常大鼠子宮平滑肌細(xì)胞，噻唑藍(lán)（MTT）比色法觀察細(xì)胞增殖情況并繪制細(xì)胞生長曲線，細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，從次日開始每天取出一個培養(yǎng)板，共檢測7 d。每孔加入MTT溶液20 mL，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 mL的二甲基亞砜（DMSO），震蕩10 min，使甲瓚充分溶解，用Synergy HT多功能酶標(biāo)儀選擇490 nm波長，測定吸光度值（A值），并以時間為橫軸，A值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。因?qū)?shù)生長期細(xì)胞是細(xì)胞增殖最活躍的時期，各項指標(biāo)表達(dá)相對顯著并且穩(wěn)定，因此本研究采取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗。1.3高糖狀態(tài)對肌細(xì)胞催產(chǎn)素受體和前列腺素受體表達(dá)的影響采用對數(shù)生長期細(xì)胞，生理糖濃度（5.5 mmol/L）進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)24 h，在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入葡萄糖，使培養(yǎng)液中葡萄糖終濃度達(dá)到35 mmol/L，高糖狀態(tài)下對大鼠子宮平滑肌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，時間分別為0，6，12，24 h，然后采用蛋白質(zhì)印跡法（Western-blot法）檢測各時間點(diǎn)細(xì)胞裂解液中催產(chǎn)素受體和前列腺素受體的濃度變化情況。

1.4牽張力和高糖協(xié)同作用下肌細(xì)胞催產(chǎn)素受體和前列腺素受體表達(dá)的變化采用對數(shù)生長期細(xì)胞，生理糖濃度（5.5 mmol/L）進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)24 h，本實(shí)驗共分6組，對照組（C組）采用生理糖濃度繼續(xù)培養(yǎng)24 h；高糖組（G組）采用高糖濃度（35 mmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h；高糖＋抑制劑組（G+sRAGE組）細(xì)胞在其培養(yǎng)液中加入AGEs的抑制劑sRAGE（濃度為1mg/L），于加入葡萄糖的同時加入，作用時間同為24 h，拮抗高糖作用；牽張力組（F組）細(xì)胞采用美國Flexercell公司細(xì)胞拉伸加載裝置對細(xì)胞進(jìn)行應(yīng)力加載，根據(jù)參考文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗［4］，力值大小為細(xì)胞表面拉伸力的20%，性質(zhì)為持續(xù)性牽張應(yīng)力，持續(xù)時間24 h；高糖＋牽張力組（G+F組）細(xì)胞加入高糖的同時施加牽張力，作用時間同為24 h；高糖＋牽張力＋抑制劑組（G+ F+sRAGE組）細(xì)胞加入高糖的同時施加牽張力，并同時加入AGEs的抑制劑sRAGE（濃度為1 mg/L），作用時間同為24 h； Western-blot法檢測細(xì)胞裂解液中催產(chǎn)素受體和前列腺素受體的濃度變化情況。

1.5Western-blot法測定催產(chǎn)素受體和前列腺素受體含量每組細(xì)胞收集1×107個細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，裂解后常規(guī)提取總蛋白，繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，化學(xué)發(fā)光法檢測每組樣本中催產(chǎn)素受體和前列腺素受體蛋白含量，并分別與各自內(nèi)參（Actin）對比，即比較目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值，檢測相對含量并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，高糖狀態(tài)不同時間點(diǎn)對受體表達(dá)影響采用重復(fù)測量資料的方差分析；牽張力和高糖作用對受體表達(dá)的影響為2×2析因設(shè)計資料，采用析因方差分析；加入sRAGE后對受體表達(dá)的影響采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較的t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

MTT法檢測大鼠子宮平滑肌細(xì)胞生長曲線呈S型，細(xì)胞第1～2天處于靜止期，無明顯增長，從第3天開始進(jìn)入快速生長期，細(xì)胞增殖加速，第6天開始進(jìn)入平臺期，生長受到抑制，見圖1。本實(shí)驗選擇第3天的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

圖1　大鼠子宮平滑肌細(xì)胞生長曲線

本實(shí)驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著高糖作用時間增加，細(xì)胞裂解液中催產(chǎn)素受體（F時間=22.549，P=0.000）和前列腺素受體（F時間=20.21，P=0.000）表達(dá)量上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1、圖2和圖3。

表1　高糖作用下肌細(xì)胞催產(chǎn)素受體和前列腺素受體表達(dá)變化?。ā纒）

表1　高糖作用下肌細(xì)胞催產(chǎn)素受體和前列腺素受體表達(dá)變化?。ā纒）

注：a與0 h比較；b與6 h比較；c與12 h比較，均P＜0.05。

指標(biāo)名稱　檢測結(jié)果0 h　6 h　12 h　24 h催產(chǎn)素受體　0.363±0.074 0.447±0.100 0.687±0.060ab0.850±0.085ab前列腺素受體0.243±0.035 0.313±0.045 0.427±0.047a0.650±0.115abc

析因方差分析示，單獨(dú)高糖培養(yǎng)或單獨(dú)持續(xù)性牽張力都可導(dǎo)致大鼠子宮平滑肌細(xì)胞裂解液中催產(chǎn)素受體（FG=112.94，F(xiàn)F=99.07）和前列腺素受體（FG= 136.91，F(xiàn)F=121.57）表達(dá)量上升（P＜0.05）；二者同時施加，可使催產(chǎn)素受體（FG×F=15.77）和前列腺素受體（FG×F=7.91）表達(dá)進(jìn)一步上升，二者存在協(xié)同作用（P＜0.05）。在高糖狀態(tài)下以及高糖和牽張力同時存在時分別加入sRAGE后均可使催產(chǎn)素受體和前列腺素受體表達(dá)下降，但仍高于生理糖濃度和單獨(dú)牽張力時的催產(chǎn)素受體和前列腺素受體表達(dá)水平（P＜0.05），見表2、表3、圖4和圖5。

圖2　高糖狀態(tài)對肌細(xì)胞催產(chǎn)素受體的影響

圖3　高糖狀態(tài)對肌細(xì)胞前列腺素受體的影響（Western-blot法）

圖4　高糖、牽張力及sRAGE對肌細(xì)胞催產(chǎn)素受體的影響

圖5　高糖、牽張力及sRAGE對肌細(xì)胞前列腺素受體的影響（Western-blot法）

表2　牽張力和高糖作用下肌細(xì)胞催產(chǎn)素受體和前列腺素受體表達(dá)變化?。ā纒）

表2　牽張力和高糖作用下肌細(xì)胞催產(chǎn)素受體和前列腺素受體表達(dá)變化?。ā纒）

組別　n　催產(chǎn)素受體　前列腺素受體C組　3　 0.223±0.045　0.213±0.040 G組　3　 0.453±0.049　0.477±0.059 F組　3　 0.417±0.025　0.457±0.055 G+F組　3　 0.903±0.086　0.887±0.049 G+sRAGE組　3　 0.333±0.040　0.333±0.038 G+F+sRAGE組　3　 0.687±0.080　0.653±0.102

表3　各組合分析的統(tǒng)計量值

3　討論

在分娩調(diào)節(jié)中，臨產(chǎn)后一個重要變化是一系列炎性介質(zhì)的釋放［如白細(xì)胞介素1（IL-1）、IL-6、IL-8］及收縮相關(guān)蛋白在子宮平滑肌細(xì)胞膜的協(xié)調(diào)表達(dá)，臨產(chǎn)后觸發(fā)強(qiáng)烈而協(xié)調(diào)的宮縮將胎兒娩出［7-8］。這些收縮蛋白主要包括催產(chǎn)素受體、前列腺素受體、β-腎上腺素受體、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體以及鉀離子通道蛋白等［9-11］。子宮催產(chǎn)素受體在整個妊娠期逐漸增加，產(chǎn)程開始后子宮平滑肌的催產(chǎn)素受體水平比正常子宮高200多倍。前列腺素可通過前列腺素E受體1和3（EP1和EP3），促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)第二信使磷脂酰肌醇/二酰甘油（IP3/DAG）表達(dá)、降低細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平，使細(xì)胞質(zhì)鈣離子濃度升高，從而收縮平滑肌。但在高糖狀態(tài)下，機(jī)械牽張力是否會對催產(chǎn)素及其受體途徑產(chǎn)生影響，具體機(jī)制如何，少見報道。因此，本研究重點(diǎn)探討催產(chǎn)素受體及前列腺素受體在高糖和牽張力影響子宮平滑肌細(xì)胞收縮功能過程中的表達(dá)變化情況，為后續(xù)實(shí)驗奠定基礎(chǔ)。

Zhang等［12］在實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過小劑量鏈脲佐菌素處理過的小鼠，胰島素的分泌降低，對照組小鼠表現(xiàn)出明顯的高血糖，而中樞注射催產(chǎn)素的治療組小鼠血糖得到明顯改善，并且血清胰島素水平提高，該研究提示催產(chǎn)素有一定的降血糖作用，而本研究結(jié)果也表明子宮肌細(xì)胞催產(chǎn)素受體的分泌量隨著高糖作用時間的增加而顯著上升，說明高糖可以呈時間依賴性地促進(jìn)催產(chǎn)素受體的表達(dá)，這與趙軍等［13］研究結(jié)果一致。高糖條件下催產(chǎn)素分泌量表達(dá)升高，進(jìn)而起到一定的降血糖作用，可能是自體神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控機(jī)制起到的保護(hù)作用，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究，但這一過程可能與腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號通路有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)催產(chǎn)素能夠誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞的葡萄糖攝取，并刺激骨骼肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，啟動鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶，上調(diào)AMPK的活性，AMPK可以磷酸化磷酸果糖激酶，增加其活性，進(jìn)一步增強(qiáng)糖酵解途徑，最終提高對葡萄糖的攝取［14］。盡管如此，以上研究都沒有涉及到細(xì)胞力學(xué)刺激在這一過程中的作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，牽張力本身也可以促進(jìn)催產(chǎn)素受體和前列腺素受體的表達(dá)，這完全符合體內(nèi)妊娠過程的實(shí)際生理情況，即在妊娠末期，子宮過度膨大，平滑肌所受的牽張力也達(dá)到最大，此時催產(chǎn)素受體和前列腺素受體的表達(dá)可協(xié)助啟動分娩過程。但在以往研究中，尚未查閱到有文獻(xiàn)報道牽張力和高糖共同作用對肌細(xì)胞收縮相關(guān)蛋白的影響，因而本研究正是對這一方面進(jìn)行了補(bǔ)充，本研究結(jié)果表明，牽張力和高糖有一定的協(xié)同作用，表現(xiàn)為牽張力可以加劇高糖狀態(tài)促進(jìn)肌細(xì)胞催產(chǎn)素受體和前列腺素受體表達(dá)升高這一過程，說明高糖環(huán)境下妊娠期子宮更易受到牽張力的影響，導(dǎo)致收縮蛋白表達(dá)增加。收縮蛋白的異常表達(dá)會使得子宮平滑肌收縮異常，進(jìn)而引發(fā)流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎盤功能不良及胎兒發(fā)育異常等并發(fā)癥，糖尿病妊娠者早產(chǎn)發(fā)生率可達(dá)到10%～25%，胎兒畸形率也高于非糖尿病孕婦，嚴(yán)重畸形發(fā)生率為正常妊娠的7～10倍，且與受孕后最初數(shù)周高血糖水平密切相關(guān)，是構(gòu)成圍生兒死亡的重要原因。

本研究還發(fā)現(xiàn)，AGEs的抑制劑sRAGE部分抑制這一過程，但不能完全阻斷，表現(xiàn)為加入sRAGE后，催產(chǎn)素受體和前列腺素受體的表達(dá)雖然低于不加入組（即G+sRAGE組低于G組，G+F+sRAGE組低于G+F組），但仍高于對照組（即G+sRAGE組高于C組，G+F+sRAGE組高于F組），說明高糖狀態(tài)下AGEs的聚集雖然可以引起肌細(xì)胞催產(chǎn)素受體和前列腺素受體的表達(dá)升高，但并不是唯一途徑，高糖狀態(tài)還可能通過其他途徑引起相應(yīng)收縮蛋白表達(dá)升高，因此單一的抑制劑不能完全阻斷這一效果。

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［本文編輯秦娟］

Effect of Continuous Stretch on Contractile Protein Expression of Uterine Smooth Muscle under High Glucose Circumstance

MAO Jing，HAN Zhi-min，ZHOU Mu-lan，DONG Ling-ling. Shanghai First Maternity and Infant Hospital，Tongji University，Shanghai 200126，China

【Abstract】Objective：To analyze the effect of continuous stretch on oxytocin receptors and prostaglandin receptors expression of uterine smooth muscle cells under high glucose circumstance. Methods：Rat uterine smooth muscle cells were separated and cultured under high glucose circumstance for different durations，then we detected oxytocin receptors and prostaglandin receptors expression changes of smooth muscle cells. Continuous stretch was forced on cells under high glucose circumstance to determine synergistic effect of stretch and high glucose. At the same time，as a control team，advanced glycation end products（AGEs）inhibitor（sRAGE）was added to antagonize the effect of high glucose，then evaluate the expression of oxytocin receptors and prostaglandin receptors. Results：Both high glucose circumstance and continuous stretch could lead to oxytocin receptors and prostaglandin receptors expression of rat uterine smooth muscle cells increasing. Exerting high glucose and continuous stretch simultaneously could promote oxytocin receptors and prostaglandin receptors expressions even further and synergistic effect could be detected. After adding sRAGE，oxytocin receptors and prostaglandin receptors expressions decreased to some extend，but not completely，still higher than the normal glucose teams. Conclusions：Both continuous stretch and high glucose could promote oxytocin receptors and prostaglandin receptors expressions and there exist a synergistic effect between them. AGEs was involved in this process，but this is not the only signal pathway.

【Keywords】Stress，mechanical；Glucose；Uterus；Myocytes，smooth muscle；Contractile proteins；Receptors，oxytocin；Receptors，prostaglandin

收稿日期：（2015-09-08）