張 偉， 魏 蜜，王立華， 魯旭東

(特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北孝感 432000)

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不同樣品前處理對(duì)轉(zhuǎn)基因棉Bt蛋白含量測定的影響

張 偉， 魏 蜜*，王立華， 魯旭東

(特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北孝感 432000)

摘要[目的]尋找一種穩(wěn)定、準(zhǔn)確、靈敏度高的檢測轉(zhuǎn)Bt植物中Bt殺蟲蛋白的方法。[方法]比較幾種ELISA方法檢測Bt殺蟲蛋白的效果，并就樣品前處理方式以及溫育時(shí)間、顯色時(shí)間等影響因子進(jìn)行分析。[結(jié)果]自制抗體法較試劑盒更為靈敏，其同一時(shí)期同一組織的Bt蛋白含量顯著高于試劑盒，但不同方法對(duì)Bt蛋白含量的檢測結(jié)果在時(shí)空表達(dá)變化的趨勢上基本一致。樣品在液氮研磨后抽提5或8 h，對(duì)檢測結(jié)果影響較小，差異未達(dá)顯著水平；勻漿機(jī)研磨過濾后離心與否，對(duì)檢測結(jié)果影響較小。從樣品前處理方式看，勻漿機(jī)較液氮研磨對(duì)樣品組織蛋白的萃取效率更高，其檢測結(jié)果顯著高于液氮研磨處理的樣品，差異達(dá)顯著水平。溫育時(shí)間和顯色時(shí)間的延長會(huì)增加樣品的吸光值，對(duì)蛋白含量檢測值有一定影響，但差異不顯著。[結(jié)論]不同樣品前處理方式對(duì)轉(zhuǎn)基因棉Bt蛋白含量測定存在顯著影響。

關(guān)鍵詞ELISA ；Bt毒蛋白；cry Lab /acrylamide試劑盒

目前，轉(zhuǎn)Bt基因技術(shù)已發(fā)展成為微生物殺蟲技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于糧食、經(jīng)濟(jì)作物、蔬菜、林果以及衛(wèi)生害蟲的防治。轉(zhuǎn)Bt基因技術(shù)的應(yīng)用，可以降低農(nóng)業(yè)成本，大幅度增加單位面積作物產(chǎn)量，減少作物中農(nóng)藥殘留[1]。轉(zhuǎn)Bt基因是目前應(yīng)用最廣泛和最有潛力的一個(gè)抗蟲基因,已有近70 種植物被轉(zhuǎn)入Bt基因而獲得了抗蟲性。但其基因漂移、生物多樣性、對(duì)非靶標(biāo)生物的潛在危害等環(huán)境安全、生態(tài)安全問題，要求必須對(duì)其實(shí)行有效監(jiān)控，因此建立Bt蛋白檢測方法十分必要[2]。

酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)是目前應(yīng)用最廣泛的免疫檢測方法，具有測定時(shí)間短、檢測極限高、可定量分析等優(yōu)點(diǎn)。國內(nèi)已有ELISA 在轉(zhuǎn)Bt 棉花、玉米、水稻和油菜[3-6]等中的應(yīng)用。針對(duì)不同轉(zhuǎn)基因作物中特異表達(dá)的蛋白質(zhì)，許多公司設(shè)計(jì)了專一方法和商用試劑盒。美國 Virological 公司生產(chǎn)的 cry Lab /acrylamide試劑盒，是定量檢測 Bt 殺蟲蛋白的專用試劑盒，已在轉(zhuǎn)基因 Bt棉花、玉米上得到了廣泛應(yīng)用[7]。但在應(yīng)用其檢測過程中，由于樣品前處理方式以及檢測處理時(shí)間的不同，造成不同檢測結(jié)果的偏差。筆者比較了幾種ELISA 法檢測Bt 殺蟲蛋白的效果，并就樣品前處理方式以及溫育時(shí)間、顯色時(shí)間等影響因子進(jìn)行分析,旨在為找到一種穩(wěn)定、準(zhǔn)確、靈敏度高的檢測轉(zhuǎn)Bt 植物中Bt 殺蟲蛋白的方法提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料1～9號(hào)棉花品種由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所提供。

1.2試驗(yàn)藥劑Cry1Ac/Cry1Ab檢測試劑盒購自美國Virological公司；Detection Antibody、coating Ab、Poly-HRP dilution buffer、stock conjugate、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)由美國孟山都(Monsanto)公司提供。

1.3試驗(yàn)方法田間采集棉花組織樣品，加干冰冷凍碎樣，用凍存管迅速分裝，置于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.3.1樣品前處理。勻漿機(jī)法：稱取0.1 g樣品于離心管內(nèi)，加入8顆無油鋼珠(6.3 mm)及10 mL抽提緩沖液(1×TBA)。勻漿機(jī)勻漿10 min，用血清過濾管過濾，小心吸取1 mL上清液，4 ℃低溫保存。液氮研磨法：稱取0.1 g樣品于離心管內(nèi)，放入研缽中，再倒入液氮，用研棒充分研磨，加入1 mL PBST緩沖液，搖床搖12 h后，4 ℃，10 000 r/min，離心20 min，小心吸取1 mL上清液，4 ℃低溫保存。檢測前，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)用抽提緩沖液對(duì)樣品進(jìn)行不同比例的稀釋。標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的含量進(jìn)行等比梯度稀釋[8]。

1.3.2檢測方法。試劑盒法：使用美國Virological公司生產(chǎn)的Cry1Ac/Cry1Ab檢測試劑盒，具體操作方法見試劑盒說明書。每孔加入50 μL酶交聯(lián)物，立即加入稀釋好的檢測樣品，26 ℃孵育1～2 h,洗滌3次。每反應(yīng)孔加入底物100 μL， 26 ℃孵育15～30 min，后每孔加入100 μL終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm處測定每孔的吸光值(OD)。用計(jì)算機(jī)軟件處理所測結(jié)果。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光值生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測樣品的濃度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

自制抗體法：用50 mmol/L Na2CO3/NaHCO3+0.15 mol/L NaCA緩沖液將coating Ab稀釋至蛋白質(zhì)含量為2 μg/L。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加100 μL，用塑料紙密封,4 ℃過夜(≥8 h)。洗板3次，每孔各加入250 μL封閉液Blocker (1×PBST + 5%(W/V)BSA) 。將反應(yīng)板貼膜密封后置于37 ℃溫育60～90 min。迅速洗板3次，Cry1Ac陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)樣品及待測樣品孔中每孔各加入100 μL，做3重復(fù)孔。封閉反應(yīng)板并將反應(yīng)板充分混勻后置于37 ℃溫育60～65 min。迅速洗板3次，每孔中加入按照1∶1 875稀釋的Detection Antibody 100 μL。封閉反應(yīng)板并將反應(yīng)板充分混勻后置于37 ℃溫育60～65 min。迅速洗板3次，以1∶10 000比例用Poly-HRP dilution buffer將stock conjugate稀釋，每孔加Poly-HRP conjugate工作液100 μL。封閉反應(yīng)板并將反應(yīng)板充分混勻后置于37 ℃溫育30～32 min。將四甲基聯(lián)苯胺(TMB)/底物置于室溫，等量量取，每孔中加入TMB底物工作液100 μL，酶標(biāo)板置于室溫 (20～25 ℃)5 min。每孔中加入100 μL終止液(3 mol/L磷酸)混勻。10 min后，用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光值[9]。

2結(jié)果與分析

2.1不同處理方法對(duì)檢測結(jié)果的影響從表1可以看出，不同前處理方式以及不同檢測方法對(duì)同一品種同一組織外源Bt蛋白含量的檢測結(jié)果差異達(dá)顯著水平，如品種1，利用試劑盒法，在勻漿機(jī)和液氮研磨2種樣品前處理方式下，苗期葉片Bt蛋白含量分別為(2 950.6±232.4)和(766.1±15.5)ng/gFW，差異達(dá)極顯著水平；而自制抗體法，在勻漿機(jī)樣品前處理方式下，1號(hào)品種苗期葉片Bt蛋白含量達(dá)(3 612±139.9)ng/gFW，與勻漿機(jī)+試劑盒法組合的檢測結(jié)果差異不顯著，但顯著高于液氮研磨+試劑盒法組合的檢測結(jié)果。從3個(gè)樣品的檢測結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，自制抗體法較試劑盒方法檢測更為靈敏，其檢測結(jié)果顯著高于美國Virological公司生產(chǎn)的Cry1Ac/Cry1Ab檢測試劑盒。而且樣品前處理方式，即勻漿機(jī)處理樣品和液氮研磨處理樣品對(duì)檢測結(jié)果的影響較大，從檢測值來看，勻漿機(jī)對(duì)樣品組織蛋白的萃取效率更高，顯著高于液氮研磨處理方式。從棉花整個(gè)生長期來看，這2種方法在不同樣品前處理方式下對(duì)Bt蛋白時(shí)空表達(dá)變化的檢測結(jié)果基本一致。

表1　不同檢測方法對(duì)葉片Bt蛋白檢測結(jié)果的影響

注：同一品種同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)。

Note: Different lowercases and capital letters in the same column stand for significant difference(P<0.05) and extremely significant difference(P<0.01),respectively.

2.2不同前處理方式對(duì)試劑盒檢測結(jié)果的影響由表2可知，樣品在液氮研磨后分別抽提5和8 h，兩者的檢測結(jié)果相差較小，差異未達(dá)顯著水平；而樣品在勻漿機(jī)研磨過濾后，離心20 min和不離心2種處理下，兩者的檢測結(jié)果差異不顯著。而勻漿機(jī)研磨樣品后，無論是否離心，其檢測結(jié)果均顯著高于液氮研磨處理的樣品，差異達(dá)顯著水平。

2.3不同溫育時(shí)間和顯色時(shí)間對(duì)試劑盒檢測結(jié)果的影響由表3可知，8號(hào)品種在溫育1.0 h、顯色15 min處理下，吸光值為0.662 8±0.020 2，蛋白含量為(269.1±8.5)ng/g；但在溫育1.5 h、顯色30 min處理下，吸光值為1.069 0±0.082 5，極顯著高于前者，但蛋白含量為(254.1±19.2)ng/g，與前者差異不顯著。9號(hào)品種在溫育1.0 h、顯色15 min處理下，吸光值為0.899 5±0.010 5，蛋白含量為(369.5±4.5)ng/g；但在溫育1.5 h、顯色30 min處理下，吸光值為1.355 7±0.070 6，極顯著高于前者，但蛋白含量為(320.9±16.5)ng/g，低于溫育1.0 h、顯色15 min的處理樣品，與前者相比差異達(dá)顯著水平。這表明溫育時(shí)間和顯色時(shí)間的延長會(huì)增加樣品吸光值，對(duì)蛋白含量檢測值有一定影響。

表2　不同前處理方式對(duì)葉片Bt蛋白檢測結(jié)果的影響

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)。

Note: Different lowercases and capital letters in the same column stand for significant difference(P<0.05) and extremely significant difference(P<0.01),respectively.

表3　不同溫育時(shí)間和顯色時(shí)間對(duì)葉片Bt蛋白檢測結(jié)果的影響

注：同一品種同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)。

Note: Different lowercases and capital letters in the same column stand for significant difference(P<0.05) and extremely significant difference(P<0.01),respectively.

3結(jié)論與討論

酶聯(lián)免疫吸附測定法的靈敏度受多種因素的影響,樣品稀釋、上樣量以及其他試驗(yàn)條件要保持一致,試驗(yàn)結(jié)果才具有較強(qiáng)的可比性。從檢測結(jié)果看，自制抗體法較試劑盒檢測更為靈敏，其檢測結(jié)果顯著高于美國Virological公司生產(chǎn)的Cry1Ac/Cry1Ab檢測試劑盒。而且樣品前處理方式，即勻漿機(jī)處理樣品和液氮研磨處理樣品對(duì)檢測結(jié)果影響較大，從檢測值來看，勻漿機(jī)對(duì)樣品組織蛋白的萃取效率更高，顯著高于液氮研磨處理方式。這可能是由于勻漿機(jī)對(duì)棉花組織細(xì)胞的破碎程度更大，使外源Bt殺蟲蛋白從棉花組織細(xì)胞釋放出來的更多，從而導(dǎo)致2種前處理方式處理后的檢測結(jié)果差異達(dá)顯著水平。李建武等[10]指出,分離提取生物大分子物質(zhì)首先要求其從原來的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來,選擇適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織或細(xì)胞破碎,破碎的程度越高,則目的物產(chǎn)量也越高。

其次，對(duì)前處理方式的影響因子進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，樣品在液氮研磨后分別抽提5和8 h，兩者的檢測結(jié)果相差較小，差異未達(dá)顯著水平；而樣品在勻漿機(jī)研磨過濾后，離心20 min和不離心2種處理下，兩者的檢測結(jié)果差異不顯著。而勻漿機(jī)研磨樣品后，無論是否離心，其檢測結(jié)果均顯著高于液氮研磨處理的樣品，差異達(dá)顯著水平。這說明蛋白檢測過程中，樣品的研磨方式對(duì)組織內(nèi)蛋白的釋放影響較大。

溫育時(shí)間和顯色時(shí)間的延長會(huì)增加樣品吸光值，對(duì)蛋白含量檢測也有一定影響，但不穩(wěn)定。因?yàn)槊嘎?lián)免疫吸附試驗(yàn)的關(guān)鍵之一是反應(yīng)時(shí)間，時(shí)間過短，部分樣品未來得及吸附即被洗掉，最終導(dǎo)致結(jié)果偏低；時(shí)間過長，又會(huì)影響正常反應(yīng)，如本不該吸附的分子也會(huì)參加反應(yīng)，最終雜質(zhì)分子影響了結(jié)果。同時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線選擇的標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度要適宜。毒蛋白測定的最終結(jié)果是通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度值與其吸光值的回歸關(guān)系計(jì)算出來，如果標(biāo)準(zhǔn)蛋白值的范圍過小，就會(huì)導(dǎo)致樣品的結(jié)果超越了檢測范圍而失去實(shí)際意義。

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Effects of Different Samples Pre-treatment on Determination of Protein Content in Transgenic Bt Cotton

ZHANG Wei,WEI Mi*,WANG Li-hua et al

(Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables,College of Life Science and Technology,Hubei Engineering University,Xiaogan,Hubei 432000)

Abstract[Objective] The aim was to seek a stable,accurate and high sensitive detection method for Bt insecticidal protein in transgenic Bt plants.[Method] The detection effect of several commonly used ELISA methods for Bt insecticidal protein were compared,pre-treatment methods and influencing factors such as incubation and coloration time were analyzed.[Result] The homemade antibody method was more sensitive than the kit,which measured Bt protein content in the same period and organization was significantly higher than the kit,but the detection results were basically the same in spatial-temporal expression change.After grinding the samples in liquid nitrogen and extracting for 5 or 8 h,there were less impact on the test results,the difference was not significant; homogenized and filtered centrifugal grinding machine or not,had little effect on the test results.From sample pre-treatment methods,the higher extraction efficiency compared to liquid nitrogen grinding machine homogenized tissue protein samples,the test results were significantly higher than the sample in liquid nitrogen grinding treatment,the difference was significant.Prolong of incubation and coloration would increase the sample absorbance values,and have a certain effect on the protein content detected values,but the difference was not significant.[Conclusion] Different samples pre-treatment has significant effects on determination of Bt insecticidal protein in transgenic Bt plants.

Key wordsELISA; Bt toxic protein; cry Lab / acrylamide kit

基金項(xiàng)目湖北省教育廳中青年人才項(xiàng)目(Q20152707)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31200488)；特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2014K05)。

作者簡介張偉(1991- )，男，湖北鄖西人，碩士研究生，研究方向：植物病理、微生物應(yīng)用。*通訊作者，講師，博士，從事微生物學(xué)、植物病理學(xué)研究。

收稿日期2016-02-29

中圖分類號(hào)S 188

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)08-141-03