宋發(fā)谷 韓駿飛

結(jié)核桿菌痰檢方法的臨床應(yīng)用比較

宋發(fā)谷 韓駿飛

目的 比較結(jié)核桿菌抗酸染色、金胺O熒光染色（以下簡(jiǎn)稱熒光染色）及結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)（以下簡(jiǎn)稱結(jié)核培養(yǎng)）3種檢測(cè)方法的陽(yáng)性檢出率，探討最適合基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)結(jié)核桿菌篩查的檢測(cè)模式。方法 選取確診為肺結(jié)核的患者536例，期間共計(jì)痰檢人次為1531次，按醫(yī)學(xué)影像學(xué)和臨床癥狀分為3個(gè)組，每位肺結(jié)核患者每痰檢1次則記為1例，其中處于進(jìn)展期895例，好轉(zhuǎn)期357例，穩(wěn)定期279例。對(duì)處于進(jìn)展期、好轉(zhuǎn)期和穩(wěn)定期的患者的痰檢標(biāo)本分別采用抗酸染色、金胺O熒光染色及結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)3種方法同時(shí)檢測(cè)即時(shí)、夜間和晨痰3份標(biāo)本。對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 （1）肺結(jié)核進(jìn)展期895例，其中抗酸染色陽(yáng)性病例為266例（29.72%），金胺O熒光染色陽(yáng)性病例377例（42.12%），結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)陽(yáng)性病例401例（44.80%）。結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)陽(yáng)性檢出率最高,熒光染色次之,抗酸染色最低；抗酸染色與另2種檢測(cè)方法之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；另2種檢測(cè)方法之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）肺結(jié)核好轉(zhuǎn)期357例，其中抗酸染色陽(yáng)性病例為7例（1.96%），金胺O熒光染色陽(yáng)性病例23例（6.44%），結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)陽(yáng)性病例19例（5.32%）。后2種檢測(cè)方法之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；抗酸染色與后2種檢測(cè)方法之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（3）穩(wěn)定期279例，其中抗酸染色陽(yáng)性病例為5例（1.79%），金胺O熒光染色陽(yáng)性病例8例（2.86%），結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)陽(yáng)性病例7例（2.51%）。3種方法之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 抗酸染色檢測(cè)迅速，實(shí)驗(yàn)操作及設(shè)備要求簡(jiǎn)單，適合基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)大規(guī)模結(jié)核病初次篩查及穩(wěn)定期患者的痰檢；金胺O熒光染色檢測(cè)迅速，操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求相對(duì)較高，配合抗酸染色有助于提高結(jié)核桿菌檢出率，適用于肺結(jié)核治療過程中痰菌檢測(cè)；結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)在3種方法中陽(yáng)性檢出率最高，但是檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，不利于結(jié)核桿菌的快速檢出，可用于檢測(cè)抗酸染色和金胺O熒光染色不能確定的可疑標(biāo)本。

肺結(jié)核；結(jié)核桿菌；抗酸染色；金胺O熒光染色；結(jié)核桿菌快速培養(yǎng)；進(jìn)展期；好轉(zhuǎn)期；穩(wěn)定期

肺結(jié)核的防治關(guān)鍵是早發(fā)現(xiàn)早治療。在眾多的檢測(cè)方法中，結(jié)核菌痰檢方便快捷，可靠性高，能為臨床治療提供有力的輔助診斷依據(jù)，是肺結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。其它實(shí)驗(yàn)室輔助診斷都具有間接性，臨床意義有限[1]。所以，本研究將目前應(yīng)用最廣泛的其中3種結(jié)核菌痰檢方法的陽(yáng)性檢出率進(jìn)行比較，探究3種方法的臨床意義、適用范圍以及最適合基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)結(jié)核桿菌篩查的檢測(cè)模式。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月～2014年12月間秭歸縣人民醫(yī)院結(jié)核門診確診為肺結(jié)核的患者536例。由于肺結(jié)核臨床治療需要定期做結(jié)核桿菌痰檢，本院檢驗(yàn)科2012年1月～2013年12月間肺結(jié)核患者的痰檢人次達(dá)1531次，每位肺結(jié)核患者每痰檢1次則記為1例，其中處于進(jìn)展期895例，好轉(zhuǎn)期357例，穩(wěn)定期279例。肺結(jié)核易發(fā)生遷延，即同1個(gè)肺結(jié)核患者病情分期可在進(jìn)展期、好轉(zhuǎn)期、穩(wěn)定期3期中往復(fù)，因此本研究中同1例肺結(jié)核患者在不同時(shí)期可能分組不同，故按其分組的病例數(shù)多于實(shí)際病例數(shù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.2.1 標(biāo)本 痰檢標(biāo)本：采用一次性專用痰液杯分別留取即時(shí)、夜間及晨痰3次深咳痰標(biāo)本。

1.2.2 試劑與儀器設(shè)備 珠海貝索抗酸染色試劑盒:批號(hào)413012；珠海貝索金胺O熒光染色試劑盒:批號(hào)413081；珠海貝索改良結(jié)核菌羅氏培養(yǎng)管（酸性）Ⅱ型:批號(hào)20131008；德國(guó)蔡司研究級(jí)偏光顯微鏡:型號(hào)Axioskopt40Pol；帆船牌載玻片:規(guī)格25.4mm×76.2mm；蘇凈安泰生物安全柜:型號(hào)BSC-1000ⅡA2型；酒精燈；上海恒字隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱:型號(hào)PYX-DHS-BS-Ⅱ型。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)操作 對(duì)處于進(jìn)展期、好轉(zhuǎn)期和穩(wěn)定期的患者的痰檢標(biāo)本分別采用抗酸染色、金胺O熒光染色及結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)3種方法同時(shí)檢測(cè)即時(shí)、夜間和晨痰3份標(biāo)本?；颊咛禉z3份標(biāo)本，只要1份標(biāo)本痰檢發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌，即該患者視為痰檢陽(yáng)性病例[2]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 進(jìn)展期肺結(jié)核患者的痰檢結(jié)果 陽(yáng)性檢出率最高的是結(jié)核培養(yǎng)，895例肺結(jié)核進(jìn)展期的患者痰檢陽(yáng)性401例，其次是熒光染色377例，抗酸染色陽(yáng)性檢出率為3種方法中最低為266例。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，抗酸染色與熒光染色方法之間差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2抗酸-熒光=29.90，P＜0.01）；抗酸染色與結(jié)核培養(yǎng)方法之間差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2抗酸-培養(yǎng)= 43.55，P＜0.01）；熒光染色與結(jié)核培養(yǎng)方法之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2培養(yǎng)-熒光=1.31，P＞0.05）。見表1。

表1 895例進(jìn)展期肺結(jié)核患者的痰檢結(jié)果

2.2 好轉(zhuǎn)期肺結(jié)核患者的痰檢結(jié)果 陽(yáng)性檢出率最高的是熒光染色，357例肺結(jié)核好轉(zhuǎn)期的患者痰檢陽(yáng)性23例，其次是結(jié)核培養(yǎng)19例，抗酸染色敏感度為3種方法中最低為7例。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，抗酸染色與熒光染色及結(jié)核培養(yǎng)2種方法之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2抗酸-熒光=8.91,P＜0.05；χ2

抗酸-培養(yǎng)=5.75，P＜0.01）；熒光染色與結(jié)核培養(yǎng)方法之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2

抗酸-培養(yǎng)=0.4，P＞0.05）。見表2。

表2 357例好轉(zhuǎn)期肺結(jié)核患者的痰檢結(jié)果

2.3 穩(wěn)定期肺結(jié)核患者的痰檢結(jié)果 從表3中可以看出，3種方法陽(yáng)性檢出率最高的是熒光染色，279例肺結(jié)核穩(wěn)定期的患者痰檢陽(yáng)性8例，其次是結(jié)核培養(yǎng)7例，抗酸染色陽(yáng)性檢出率為3種方法中最低為5例。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，抗酸染色、金胺O熒光染色及結(jié)核培養(yǎng)3種方法之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2

抗酸-熒光=0.71，χ2抗酸-培養(yǎng)=0.34，χ2

培養(yǎng)-熒光=0.07，P＞0.05）。見表3。

表3 279例穩(wěn)定期肺結(jié)核患者的痰檢結(jié)果

3 討論

結(jié)核菌檢查是確診肺結(jié)核最具特異性的方法，痰中找到結(jié)核菌是確診肺結(jié)核的主要依據(jù)[3]?？顾崛旧R檢快速簡(jiǎn)便，在我國(guó)非典型分枝桿菌比較少見，因此抗酸桿菌痰檢陽(yáng)性，基本即可診斷為結(jié)核桿菌陽(yáng)性。多次痰檢，每次痰檢采集清晨、夜間、及時(shí)3次痰液標(biāo)本送檢，痰液涂片采取厚涂片[4]，為目前普遍采用。

金胺O熒光染色法適合于大量標(biāo)本快速檢查[5]。對(duì)于菌陰性肺結(jié)核患者，在必要的時(shí)候，可以通過纖支鏡直達(dá)病灶檢查，或從其涮洗液中查找結(jié)核菌[6-7]。

結(jié)核病的細(xì)菌學(xué)檢查是檢測(cè)結(jié)核桿菌的重要手段，是結(jié)核病確診和制定治療方案的重要依據(jù)[8]。結(jié)核菌培養(yǎng)不僅能判斷患者是否感染結(jié)核菌，而且培養(yǎng)出的結(jié)核菌還可作藥物敏感試驗(yàn)與菌型鑒定[9]。結(jié)核菌生長(zhǎng)緩慢，使用改良羅氏培養(yǎng)基，通常需4～8周才能報(bào)告。培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，但檢測(cè)結(jié)果可靠，特異性高，尤其在涂片陰性或診斷有疑問時(shí)，培養(yǎng)更為重要[10]。培養(yǎng)菌株作藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，可以為肺結(jié)核臨床治療提供參考[11]。本研究采用上述3種方法檢測(cè)已經(jīng)過臨床診斷確認(rèn)處于進(jìn)展期、好轉(zhuǎn)期和穩(wěn)定期的病例，比較其陽(yáng)性檢出率。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的表1中可以看出，處于進(jìn)展期的肺結(jié)核患者體內(nèi)結(jié)核桿菌活性較高，3種方法的結(jié)核桿菌檢出率都較高。同時(shí)，抗酸染色與熒光染色和結(jié)核培養(yǎng)的檢測(cè)結(jié)果比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），熒光染色與結(jié)核菌培養(yǎng)的檢測(cè)結(jié)果比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陽(yáng)性病例在熒光顯微鏡黑暗背景下呈亮綠色或黃綠色桿狀,不易漏檢。在熒光鏡中倍物鏡(20×)下鏡檢,其視野約為0.14mm2,而抗酸染色法采用油鏡下鏡檢,油鏡下視野面積約為0.102mm2,因此,在相同時(shí)間內(nèi),熒光染色法鏡檢時(shí)所掃讀面積比抗酸染色法鏡檢時(shí)多20倍左右,更易檢出抗酸桿菌[12-13]，從而可以提高檢出率。結(jié)核桿菌的羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法一直是肺結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn),是目前活菌檢測(cè)不可替代的方法,也是化療反應(yīng)的主要監(jiān)測(cè)指標(biāo)[14],還可以在其基礎(chǔ)上進(jìn)行菌種鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)[11]。本研究中結(jié)核培養(yǎng)陽(yáng)性檢出率，與相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道基本一致[15]。相比較而言,3種方法中抗酸顏色實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求最低,檢測(cè)速度快,結(jié)果可靠,可以當(dāng)天報(bào)告結(jié)果,具備及時(shí)性;熒光染色實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求較高,需要熒光顯微鏡,檢測(cè)速度快,結(jié)果可靠也可以當(dāng)天報(bào)告結(jié)果,具備及時(shí)性;結(jié)核培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求較高,需要培養(yǎng)箱和振蕩器，其檢測(cè)結(jié)果是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，當(dāng)天不能報(bào)告結(jié)果，具有滯后性。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的表2中可以看出，處于好轉(zhuǎn)期的肺結(jié)核患者，實(shí)驗(yàn)中3種方法痰檢結(jié)果陽(yáng)性檢出率都有很大幅度的降低，這與好轉(zhuǎn)期結(jié)核病患者用藥治療以及患者自身的免疫力有關(guān)。同時(shí)，抗酸染色與熒光染色和結(jié)核培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，熒光染色與快速培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，熒光染色陽(yáng)性檢出率高于結(jié)核培養(yǎng)，這可能與患者藥物化療對(duì)結(jié)核桿菌產(chǎn)生抑制作用有關(guān)。結(jié)核桿菌的培養(yǎng)，一般需要45天時(shí)間，且對(duì)培養(yǎng)條件要求較高，不能做出早期診斷和及時(shí)的治療；而且熒光染色報(bào)告結(jié)果所需時(shí)間短［13］，因此，金胺O熒光染色更適用于治療過程中肺結(jié)核痰菌快速檢測(cè)。

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的表3中可以看出，處于穩(wěn)定期的肺結(jié)核患者，實(shí)驗(yàn)中3種方法痰檢結(jié)果陽(yáng)性檢出率都有很大幅度的降低，這可能與穩(wěn)定期結(jié)核病患者用藥治療以及結(jié)核病病灶鈣化痊愈有關(guān)?？顾崛旧晒馊旧徒Y(jié)核培養(yǎng)3種方法檢測(cè)結(jié)果比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。防治結(jié)核（TB）病目前的戰(zhàn)略是基于患者的早期檢測(cè)和治療從而停止病菌傳播[16]，因此，抗酸染色配合金胺O熒光染色即可勝任穩(wěn)定期肺結(jié)核患者的痰檢。

綜上所述，抗酸染色檢測(cè)迅速，實(shí)驗(yàn)操作及設(shè)備要求簡(jiǎn)單，適合基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)大規(guī)模結(jié)核病初次篩查及穩(wěn)定期患者的痰檢；金胺O熒光染色檢測(cè)迅速，操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求相對(duì)較高，配合抗酸染色有助于提高結(jié)核桿菌檢出率，適用于肺結(jié)核治療過程中痰菌檢測(cè)；結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)在3種方法中陽(yáng)性檢出率最高，但是檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，不利于結(jié)核桿菌的快速檢出，可用于檢測(cè)抗酸染色和金胺O熒光染色不能確定的可疑標(biāo)本。

[1] 張杰,李玲,張洪玉,等.幾種常用肺結(jié)核病診斷方法臨床價(jià)值的探討[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1998,19(2):133-135.

[2] World Health Organization.Geneva:World Health Organization[R].New WHO policies:definition of smear-positive TB case,2007.

[3] 楊松,張耀亭,林素梅.抗酸染色對(duì)肺結(jié)核的診斷價(jià)值[J].臨床肺科雜志,2007,12(4):328-329.

[4] 周建華.痰涂片法與痰培養(yǎng)法檢測(cè)抗酸桿菌結(jié)果比較[J].中國(guó)鄉(xiāng)村醫(yī)藥,2013,20(5):55-56.

[5] 肖靜,楊元好,金瑛.熒光染色法檢測(cè)痰中結(jié)核桿菌的應(yīng)用[J].貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,35(4):152-153.

[6] Soto A,Acurio V,Solari L，et al.Incremental yield of bronchial washing for diagnosing smear-negative pulmonary tuberculosis[J].Rev Saude Publica,2013,47(4):813-816.

[7] Goussard P,Gie R.The role of bronchoscopy in the diagnosis and management of pediatric pulmonary tuberculosis[J].Expert Rev Respir Med,2014,8(1):101-109.

[8] Darban-Sarokhalil D,Imani Fooladi AA,Maleknejad P,et al.Comparison of smear microscopy,culture,and real-time PCR for quantitative detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical respiratory specimens[J].Scand J Infect Dis,2013,45(4):250-255.

[9] 周建華.痰涂片法與痰培養(yǎng)法檢測(cè)抗酸桿菌結(jié)果比較[J].中國(guó)鄉(xiāng)村醫(yī)藥,2013,20(5):56-57.

[10] Yam WC,Siu KH.Rapid identification of mycobacteria and rapid detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis in cultured isolates and in respiratory specimens[J].Methods Mol Biol,2013,9(43):171-199.

[11] 徐蕾.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的現(xiàn)狀和進(jìn)展[A]//重慶微生物學(xué)會(huì)第九屆會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)年會(huì)5論文摘要集6[C].2009.

[12] 劉平,易任德.抗酸桿菌熒光染色法的臨床應(yīng)用[J].中國(guó)臨床醫(yī)生, 2003,31(3):48-49.

[13] Marais BJ,Brittle W,Painczyk K,et al.Use of light-emitting diode fluorescence microscopy to detect acid-fast bacilli in sputum[J].Clin Infect Dis,2008,47(2):203-207.

[14] 齊學(xué)進(jìn),陳琪福.臨床技術(shù)操作規(guī)范結(jié)核病分冊(cè)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2004:32-361.

[15] 施鴻生,王鵬飛,陸鏹,等.傳染性肺結(jié)核病例不同檢出和診斷方法評(píng)價(jià)[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,1997,20(5):301-304.

[16] Tasbiti AH,Bahrmand A,Shokrgozar MA,et al.Evaluation of Antigen Detection Test (Chromatographic Immunoassay):Potential to Replace the Antibody Assay Using Purified 45-kDa Protein for Rapid Diagnosis of Tuberculosis[J].J Clin Lab Anal,2014,28(1):70-76.

Objective Comparison of Mycobacterium tuberculosis by acid fast staining,auramine O fluorescence and Mycobacterium tuberculosis culture 3 methods for the detection of positive rate,detection of the Mycobacterium tuberculosis screening in primary health care institutions.Methods Select 536 cases of pulmonary tuberculosis patients,during this period a total of sputum specimens 1531 copies,according to medical imaging and clinical symptoms of the divided into three groups,each pulmonary tuberculosis patients per sputum examination is recorded as an example,which is in the progress of 895 cases of improved 357 cases,stable 279 patients.The in progress,improvement and stable period in patients with sputum specimens respectively by acid fast staining,auramine O fluorescent staining and Mycobacterium tuberculosis separation culture 3 kinds of method for the simultaneous determination of instant,night and morning sputum 3 specimens.The test results were statistically analyzed. Results （1）Pulmonary tuberculosis in 1 advanced stage in 895 cases,among them acid fast staining positive were 266 cases (29.72%),auramine O fluorescence staining was positive in 377 cases (42.12%),isolation and culture ofthe 401 positive cases of Mycobacterium tuberculosis (44.80%). Mycobacterium tuberculosis isolation and culture of the highest positive rate,fluorescence stainingtime,acid fast staining minimum; between the 2 methods for the detection of acid fast stain and then compare the difference was significant statistically significant (P＜0.05);no statistical significance between differences after 2 detection methods.（2）Pulmonary tuberculosis in 2 remission in 357 cases,among them acid fast staining positive were 7 cases (1.96%),auramine O fluorescence staining was positive in 23 cases (6.44%),isolation and culture of the 19 positive cases of Mycobacterium tuberculosis (5.32%).Between the 2 kinds of detection methods have no significant difference; between the 2 methods for the detection of acid fast stain and then compare the difference was significant statistical significance (P＜0.05). （3）stable stage in 279 cases, among them acid fast staining positive were 5 cases (1.79%),auramine O fluorescence staining was positive in 8 cases (2.86%),isolation and culture of the 7 positive cases of Mycobacterium tuberculosis (2.51%).Comparisonbetween 3 methods had no significant differences between the statistical significance.Conclusion Acid fast staining rapidly,experimental operation andsimple equipment requirement,sputum examination formedical institutions at the grassroots massfirst screening and TB patients in stable stage; auramine O fluorescence staining was rapid, simple operation, experimental equipment requirements are relatively high,with acid fast staining is helpful to improve the detection rate of Mycobacterium tuberculosis,is suitable for the detection of sputum tuberculosis in the course of treatment;isolation and culture in the 3 method the highest positive rate of Mycobacterium tuberculosis,but the detection timeis relatively long,is not conducive to the rapid detection of Mycobacterium tuberculosis,can be used for detection ofacid fast stain and auramine O fluorescence staining of suspicious samples could not be determined.

Pulmonary tuberculosis; Tuberculosis; Acid fast staining; Auramine O fluorescence; Rapid culture of Mycobacterium tuberculosis; Advanced; Better period; Stable period

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.21.002

湖北 443600 秭歸縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 （宋發(fā)谷 韓駿飛）