鄭劍滔, 鄭　斌, 郭朝暉, 朱　勇, 鄭　煒, 陳　椿

福建醫(yī)科大學(xué) 附屬協(xié)和醫(yī)院胸外科，福州　350001

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非小細胞肺癌患者EML4-ALK基因表達與臨床特征及近期生存的關(guān)系

鄭劍滔, 鄭斌, 郭朝暉, 朱勇, 鄭煒, 陳椿

福建醫(yī)科大學(xué) 附屬協(xié)和醫(yī)院胸外科，福州350001

摘要:目的探討非小細胞肺癌(NSCLC)中棘皮動物微管蛋白4-間變性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)融合基因突變情況與臨床特征、生存時間的關(guān)系。方法回顧性分析82例NSCLC患者的臨床資料，包括患者的年齡、性別、吸煙史、病理類型、腫瘤轉(zhuǎn)移、臨床分期或術(shù)后分期及表皮生長因子受體(EGFR)突變情況等，并通過閱覽病例、電話隨訪等方式隨訪其生存情況。結(jié)果82例中，檢測出EML4-ALK融合基因突變9例為突變陽性組，總突變率為10.98%，余為突變陰性組。2組在性別、腫瘤病理類型、腫瘤轉(zhuǎn)移、病理分期等方面比較,差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；2組在吸煙史、EGFR基因突變情況的比較，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。突變陽性組與突變陰性組的中位生存期分別為21月(95%CI，18～24月)和23月(95%CI，22～24月)，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論EML4-ALK融合基因突變多傾向于女性、不吸煙、腺癌與EGFR基因無突變的患者。EML4-ALK融合基因突變尚不能作為評估NSCLC近期預(yù)后的獨立因素。

關(guān)鍵詞:非小細胞肺癌； EML4-ALK融合基因； 臨床特征； 生存

肺癌是當今全球最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年上升，發(fā)病率和死亡率位于世界惡性腫瘤首位[1]。由于其發(fā)病隱匿，癥狀缺乏特異性，超過半數(shù)以上的患者在首診時已屬腫瘤局部晚期或晚期，失去手術(shù)機會，如果不采取相應(yīng)治療，其1年生存率不足10%[2]。令人可喜的是，隨著對腫瘤發(fā)病機制及其生物學(xué)行為的不斷深入，人們越來越多的將治療的焦點集中于特異性高、不良反應(yīng)輕的分子靶向藥物。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)的出現(xiàn)受到了腫瘤學(xué)界的普遍關(guān)注，其臨床應(yīng)用為非小細胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)的治療帶來了新的曙光[3-5]。2007年，Soda等在NSCLC中發(fā)現(xiàn)了棘皮動物微管蛋白4-間變性淋巴瘤激酶(microtubule-associated protein-like 4 and anaplastic lymphoma kinase，EML4-ALK)融合基因這另一種高活性的酪氨酸激酶類型[6]。目前ALK激酶抑制劑已經(jīng)誕生，并被證實能夠抑制EML4-ALK融合基因陽性細胞的生長。有報道EML4-ALK融合常發(fā)生于有特定臨床特征的NSCLC患者中[7]。筆者采用RT-PCR法檢測EML4-ALK 9個亞型融合基因突變情況,并分析基因突變狀態(tài)與NSCLC患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，為NSCLC患者的個體化治療、預(yù)后判斷提供依據(jù)。

1對象與方法

1.1對象收集2010年10月—2013年11月經(jīng)組織病理學(xué)證實的NSCLC患者，滿足病理診斷后，完成EML4-ALK融合基因檢測共82例。其中男性44例，女性38例，年齡(60.5±10.2)歲(36～82歲)，≥60歲42例，<60歲40例；無吸煙史53例，有吸煙史29例；Ⅰ期20例，Ⅱ期3例，Ⅲ期23例，Ⅳ期36例；腺癌61例，鱗癌14例，大細胞癌1例，其他類型6例；出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移者60例，無腫瘤轉(zhuǎn)移者22例；EGFR突變者38例，無EGFR突變者44例。

1.2儀器人類EML4-ALK融合基因檢測試劑盒(廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司)；熒光PCR儀(Mx 3000 p，美國Stratagene公司)。

1.3EML4-ALK融合基因檢測方法

1.3.1RNA提取取5片5 μm厚度石蠟切片組織，置于1.5 mL EP管內(nèi),甲醛固定，提取并純化石蠟組織的RNA，具體步驟按試劑盒操作說明進行。

1.3.2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液18 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶(EA)1 μL，加入無菌離心管中，混勻；加入待測樣品RNA 6 μL(RNA總量0.1～5 μg，可用DEPC水進行RNA稀釋)；42 ℃保溫1 h；95 ℃保溫5 min后冰上冷卻，得到的cDNA溶液用于PCR擴增。

PCR擴增：采用特異引物即時熒光PCR法，檢測E13；A20、E6；A20、E20；A20、E15；A20、E14；A20、E18；A20、E2；A20、E17；A20、E2；insll7A20共9種融合突變。將從石蠟包埋組織中提取的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，再進行即時熒光PCR。PCR

反應(yīng)條件分別為：95 ℃ 5 min→95 ℃ 25 s→64 ℃ 20 s→72 ℃ 20 s，15個循環(huán)；93 ℃ 25 s→60 ℃ 35 s→72 ℃ 20 s，31個循環(huán)。收集熒光信號進行數(shù)據(jù)分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析,采用χ2檢驗進行各種率的分析，對于理論頻數(shù)<5的則采用Fisher確切概率法檢驗。采用Kaplan-Meier方法估計組間生存率和繪制累計生存曲線，組間對比使用Log-rank檢驗，P<0.05為差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般資料初次診斷為NSCLC并行EML4-ALK融合基因檢測患者82例,其具體臨床資料詳見表1。其中9例出現(xiàn)EML4-ALK融合基因突變?yōu)橥蛔冴栃越M，突變率為10.98%，其突變病例詳細臨床資料見表2。余為突變陰性組。2組在性別、腫瘤病理類型、腫瘤轉(zhuǎn)移、病理分期等方面比較,差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；2組在吸煙史、EGFR基因突變情況的比較，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2生存期本研究至2015年8月30日截止，隨訪時間為6～37月。共有29例患者死亡，其中突變陽性組4例，突變陰性組25例。突變陽性組與突變陰性組的中位生存期分別為23月(95%CI，22～24月)和21月(95%CI，18～24月)。2組中位生存期比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其生存曲線詳見圖1。

表1NSCLC患者的臨床特征

Tab 1Clinical characteristics of patients with NSCLC

NSCLC：非小細胞肺癌；ALK：間變性淋巴瘤激酶；EGFR：表皮生長因子受體.

表2　EML4-ALK融合基因突變患者的臨床特征

EML4-ALK：棘皮動物微管蛋白4-間變性淋巴瘤激酶； EGFR：表皮生長因子受體.

3討論

肺癌是癌癥死亡的首要原因，每年有超過一百萬人死于該病[8]。雖然化療仍然是NSCLC的主要治療方法[9-10]，但對于有EGFR基因突變的患者，酪氨酸激酶抑制劑(吉非替尼和厄洛替尼)已承擔著越來越重要的作用[5,11]。2007年，Sode和他的同事在腺癌患者中發(fā)現(xiàn)了一個亞群，即EML4-ALK融合基因。EML4-ALK代表了一種NSCLC的新分子亞型，該類患者具有獨特的臨床特征[7]。

在Sasaki等的綜述中，各種EML4-ALK融合基因突變類型中，以亞型1(E13;A20)最常見，檢出率高達33%[12]。本研究中，突變數(shù)為9例，突變率為10.97%，其中雙位點突變3例，具體為亞型1突變9例，亞型3突變1例，亞型2突變2例。本研究結(jié)果與上述報道基本一致，說明亞型1是EML4-ALK融合基因最常見的突變類型。關(guān)于為何會產(chǎn)生不同位點融合及其物質(zhì)基礎(chǔ)是否存在差異，其機制尚未完全闡述；同時融合基因各亞型之間的轉(zhuǎn)化活性和激酶活性彼此之間是否存在差異，而這在腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展中又起到什么作用，每種不同的融合基因突變型對ALK抑制劑的應(yīng)答水平是否存在差異，還值得不斷深入探討。值得關(guān)注的是，本研究存在3例雙突變的病例，對如何產(chǎn)生雙突變的機制仍未完全闡明，且其是否有不同于EML4-ALK融合基因單突變的臨床病理特征，有待今后的大宗樣本得以驗證。

Amanda等報道EML4-ALK融合基因突變并不普遍，在NSCLC中突變率為5%。但經(jīng)過臨床特征篩選后(年輕女性患者、腺癌)，其突變率可達到16.4%[13]，提示EML4-ALK融合基因陽性多見于女性、不吸煙和腺癌患者。而Koh等報道在韓國人群中，EML4-ALK融合基因突變更傾向于年輕患者[14]。本組中，年齡組間區(qū)別并不明顯，年齡≥60歲者和<60歲者的EML4-ALK融合基因陽性率分別為11.9%(5/42)和10.0%(4/40)，差別無統(tǒng)計學(xué)意義。進一步分析，EML4-ALK融合基因突變陽性組的平均年齡為(59.3±9.5)歲，而突變陰性組的平均年齡為(60.6±10.3)歲，差別無統(tǒng)計學(xué)意義，分析其主要原因,考慮可能是實驗樣本量較少及其納入標準等因素造成。

Amanda等報道，EML4-ALK融合基因突變與否和首次臨床分期差別無統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)[13]。而Fallet等認為，EML4-ALK融合基因突變更傾向于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的中晚期病例[15]。本組中，各組在臨床分期及腫瘤轉(zhuǎn)移方面比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮為EML4-ALK融合基因突變組的病理分期分布不均造成。

Shaw等對5例EML4-ALK融合基因陽性的患者進一步進行了EGFR和KRAS突變狀態(tài)的檢測，發(fā)現(xiàn)并沒有EGFR和KRAS基因突變，因此認為EML4-ALK融合基因與這兩種基因突變的發(fā)生均不重合[16]。但Zhang等發(fā)現(xiàn)1例亞洲女性腺癌患者同時存在EML4-ALK與EGFR第19號外顯子突變[17]。另外一組將厄洛替尼聯(lián)合化療作為EGFR陽性突變的歐洲患者一線治療方案的研究中，15.8%的患者存在EGFR與EML4-ALK融合基因雙突變，與37.89%發(fā)生EGFR T790M位點上基因突變和24.21%發(fā)生在TP53位點上的基因突變的患者在中位生存期上比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義[18]。但是區(qū)分EML4-ALK融合基因和EGFR突變對指導(dǎo)腫瘤的治療仍具有重要意義，因為突變的EML4-ALK融合基因目前已被證實有增加EGFR-TKI耐藥的潛在風(fēng)險。而從本研究分析，也存在1例同時出現(xiàn)EML4-ALK融合基因與EGFR第19號外顯子突變的病例，但該病例為男性NSCLC患者。因此，是否在少數(shù)中國肺癌患者中可能同時存在EML4-ALK與EGFR基因突變，發(fā)生同時突變時是否具有獨特的臨床病理特征，這些疑慮還需進一步的研究來證實。

2011年，Shaw等報道，EML4-ALK融合基因突變與未突變患者的總生存時間比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義[19]。2014年，Amanda等分析顯示，盡管EML4-ALK融合基因突變組獲得更為積極的治療和較長的生存期，但與未突變組比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC中，2組總生存期比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義，與相關(guān)文獻報道吻合。因此，在NSCLC中，EML4-ALK融合基因突變與否尚不能作為獨立的預(yù)后影響因素。但考慮本研究的相關(guān)局限性，且2組確診后治療方案及一般情況不盡相同，并且本研究中部分EGFR突變患者有口服靶向藥治療病史，造成了偏倚。對此，可在后續(xù)研究中適當增加樣本量，并延長隨訪時間及準確了解治療方案以減少偏倚。

綜上所述，靶向藥物特別是針對NSCLC基因傳導(dǎo)通路上的靶向藥物為無數(shù)肺癌患者帶來新的曙光。因此，關(guān)于EML4-ALK融合基因的研究必將是繼EGFR之后在治療NSCLC的又一個熱點。本研究提示，EML4-ALK融合基因突變多傾向于女性、不吸煙、腺癌與EGFR基因無突變的患者。而年齡、疾病分期和腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移與EML4-ALK融合基因突變與否無統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)，這為今后篩選靶向藥物獲益人群提供了依據(jù)，同時也證明了EML4-ALK融合基因突變?nèi)圆荒茏鳛樵u價NSCLC預(yù)后的獨立因素。在今后的研究中，可繼續(xù)擴大樣本量、完善相關(guān)隨訪內(nèi)容，并延長隨訪時間，為NSCLC的個體化治療提供更好的依據(jù)。

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(編輯:張慧茹)

Expression of EML4-ALK Gene in Patients with Non Small Cell Lung Cancer with Clinical Characteristics and Survival Relations

ZHENG Jiantao, ZHENG Bin, GUO Chaohui, ZHU Yong, ZHENG Wei, CHEN Chun

Department of Thoracic Surgery, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001,China

ABSTRACT:ObjectiveTo study the relationship between EML4-ALK fusion gene mutations and clinical characteristics and survival in NSCLC.MethodsA total of 82 patients’ clinical data were collected, including the patient’s age, sex, smoking history, histological type, tumor metastasis, clinical stage or postoperative staging and EGFR mutations.The survival data were collected by chart study and telephone interview.ResultsOf all 82 patients, 9 were detected positive for EML4-ALK fusion gene mutations.Between the mutation positive group and the negative group there was no significant difference in gender, tumor histological type, tumor metastasis status, and pathologic stage(P>0.05).There was a statistically significant difference in smoking history and EGFR mutations(P<0.05).The median of survival time was 23 months for the gene mutation negative group and 21 months for the gene mutation positive group(P>0.05).ConclusionEML4-ALK fusion gene mutation is more inclined to occur in women, non-smokers, adenocarcinoma, and patients without EGFR gene mutation.The meanwhile of EML4-ALK fusion gene mutation can not yet be used as an independent factor in the assessment of non-small cell lung cancer prognosis.

KEY WORDS:non small cell lung cancer； EML4-ALK fusion gene； clinical characteristics； survival

收稿日期:2015-09-17

基金項目:福建省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題(2011-CX-9)

作者簡介:鄭劍滔(1987-)，男，住院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士通訊作者: 陳椿. Email：chenchun0209@163.com

中圖分類號:R394； R394.3； R730.26； R722.2

文獻標志碼:A

文章編號:1672-4194(2016)01-0020-05