劉 欣，熊芳琪，余倩莎，張 城，唐 娟，彭國平

（湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，道地藥用植物規(guī)范化栽培與綜合利用湖南省工程實驗室，湖南　長沙 410128）

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茯苓多糖的提取工藝優(yōu)化

劉 欣，熊芳琪，余倩莎，張 城，唐 娟，彭國平

（湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，道地藥用植物規(guī)范化栽培與綜合利用湖南省工程實驗室，湖南長沙 410128）

摘 要：為了改進茯苓多糖的提取工藝，以茯苓粉為原料，通過對NaOH濃度、反應溫度、反應時間、料液比4個因素進行正交試驗，探討了茯苓多糖提取的優(yōu)化條件。結果表明：茯苓多糖提取的最優(yōu)制備工藝為：反應時間8 h，堿濃度0.7 mol/L，料液比1∶30，反應溫度5℃。

關鍵詞：茯苓；茯苓多糖；提取工藝；優(yōu)化

茯苓味甘、淡，性平，主產(chǎn)于安徽、云南和湖北。茯苓中絕大部分組分是多糖，含量達到93%以上。目前有關茯苓多糖提取工藝的研究很多［1-3］，通常采用水提和堿提兩種方法分別提取水溶性茯苓多糖和堿溶性茯苓多糖。因茯苓多糖大多為堿溶性，所以堿提法更常用，但強堿有可能打斷多糖的糖苷鍵，從而引起多糖降解。研究考察了提取堿濃度、提取溫度、料液比、提取時間等因素對茯苓多糖提取率的影響，優(yōu)化了堿溶性茯苓提取工藝條件，旨在為堿溶性茯苓多糖的推廣應用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗材料與試劑 茯苓粉菌核（湖南省靖州縣茯苓協(xié)會茯苓基地）。無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、葡萄糖、乙醚、丙酮、冰醋酸均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.1.2 試驗儀器 紫外-可見分光光度計（Agilent 8453，美國安捷倫科技公司）、旋轉蒸發(fā)儀（R-1001N，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、冷凍高速離心機（5417R，德國Eppendorf公司）、傅里葉紅外光譜儀（Vector，德國布魯克儀器公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 前期處理 將采集的茯苓菌核洗凈，切成塊，放在烘箱中50℃烘干72 h。將烘干的茯苓菌核體用中草藥粉碎機粉碎至粉末狀。過20目篩，封存、備用。然后，準確稱取一定量干燥茯苓菌核粉末，加入80%乙醇，持續(xù)攪拌20 min，離心，收集殘渣，依此過程重復脫脂3次，干燥，備用。

1.2.2 多糖的提取條件單因素試驗 用堿溶液處理水提后的茯苓渣，分別用5倍量的堿液浸提，攪拌均勻，此時溶液呈黃棕色透明粘稠狀，置于4℃過夜，抽濾得上堿液，把渣再用3倍量堿液提取一次，所得堿液合并，抽濾，用Sevage法除蛋白，重復3次以上，濾液以10%醋酸液中和至pH值為6，此時溶液變成白色膠體狀，再加入3倍量的95%乙醇，于4℃放置過夜，抽濾得沉淀，45℃恒溫干燥，得到堿溶性茯苓多糖，備用［4］。

（1）NaOH濃度處理試驗：固定反應溫度為5℃、反應時間為12 h、料液比為1∶30，NaOH濃度梯度為：0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和0.9 mol/L，測定不同NaOH濃度處理下堿溶性茯苓多糖的提取率。

（2）溫度處理試驗：固定反應堿濃度為0.8 mol/L、反應時間為12 h、料液比為1∶30，溫度變化梯度為：5、15、25、35和45℃，測定不同溫度處理下堿溶性茯苓多糖的提取率。

（3）時間處理試驗：在反應堿濃度為0.8 mol/L、反應溫度為5℃、料液比為1∶30條件下，處理時分別為：2、4、6、8、10和12 h，測定不同時間處理下的堿溶性茯苓多糖的提取率。

（4）料液比處理試驗：在反應堿濃度為0.8 mol/L、反應溫度為5℃、反應時間為12 h條件下，料液比變化梯度為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50，測定不同料液比處理下堿溶性茯苓多糖的提取率。

1.2.3 正交試驗 參照文獻總結多種提取方法及探索性實驗的結果［5-8］，根據(jù)單因素試驗結果，每個因素確定3個水平之后，以茯苓多糖提取率作為考察指標進行正交試驗，用SPSS軟件對正交試驗結果進行分析，從而確定茯苓多糖提取的最優(yōu)條件。

1.2.4 正交試驗驗證 按照正交試驗得到的茯苓多糖提取的最優(yōu)條件對茯苓干粉進行提取處理，測定其多糖提取率，并與正交試驗中各組結果進行比較。

1.2.5 多糖含量的測定 采用蒽酮比色法［9］測定茯苓多糖的含量。

1.2.6 茯苓多糖脫蛋白 利用蛋白質在三氯乙烷等有機溶劑中變性的特點，將提取液與Sevage試劑5∶1混合，振蕩20 min左右，離心，變性后的蛋白質介于提取液與Sevage試劑交界處，重復多次，直至除盡蛋白質。此法的優(yōu)點是條件溫和，不會引起多糖的變性。

1.2.7 茯苓多糖紅外光譜分析 參照茯苓多糖紅外光譜分析的相關文獻［10-12］確定紅外光譜方法：茯苓多糖干粉，采用KBr壓片法，掃描范圍400～4 000 cm-1。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

由圖1可知，葡萄糖的標準曲線為y=29.502x-0.006 9，R2=0.997 9。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2單因素對茯苓多糖提取的影響

2.2.1 不同NaOH濃度對堿溶性茯苓多糖提取的影響表1結果表明，NaOH濃度對茯苓多糖的提取率影響較顯著，高濃度NaOH條件下，茯苓多糖的提取率更高，更加有利于茯苓多糖的提取。茯苓多糖在NaOH濃度為0.3～0.9 mol/L條件下提取率有明顯的差異，其中0.3 mol/L條件下多糖提取率很低，0.4 mol/L時，多糖提取率提升幅度較大，而從0.5～0.9 mol/L處理下的多糖提取率穩(wěn)步上升，但是上升幅度并不大，這說明，NaOH濃度為0.4 mol/L是茯苓多糖提取率變化的拐點。因此，高濃度NaOH有利于茯苓多糖的提取，但是濃度過高可能會導致多糖性質發(fā)生改變。

表1 NaOH濃度對堿溶性茯苓多糖提取率的影響

2.2.2 不同反應溫度對堿溶性茯苓多糖提取的影響表2結果表明，反應溫度對茯苓多糖的提取率影響較顯著，低溫條件下，茯苓多糖的提取率更高。茯苓多糖在溫度為5℃～45℃條件下提取率穩(wěn)步下降，并且下降幅度均有明顯差異，這說明，溫度為5℃是茯苓多糖提取的適合溫度。因此，低溫條件有利于茯苓多糖的提取。

表2 反應溫度對堿溶性茯苓多糖提取的影響

2.2.3 不同反應時間對堿溶性茯苓多糖提取的影響表3結果表明，反應時間對茯苓多糖的提取率影響不明顯，反應2 h后，多糖提取率的變化不大。因此，反應時間對茯苓多糖的提取影響不大，為了使試驗效率更高，可以在多糖提取處理的時間上進行縮短，根據(jù)試驗時間安排控制在適合的范圍下即可。

2.2.4 不同料液比對茯苓多糖提取的影響 表4結果表明，料液比對茯苓多糖的提取率影響較顯著，料液比小的條件下，茯苓多糖的提取率更高，更加有利于茯苓多糖的提取。茯苓多糖在料液比為（1∶10）～（1∶50）條件下提取率有明顯的差異，其中1∶10條件下多糖提取率很低，1∶20時，多糖提取率提升幅度較大，而1∶30～1∶50條件下多糖提取率穩(wěn)步上升，但是上升幅度并不大，這說明，料液比為1∶20是茯苓多糖提取率變化的拐點。因此，料液比小有利于茯苓多糖的提取，但是處于節(jié)約成本考慮，盡量控制料液比在（1∶30）～（1∶50）范圍內(nèi)。

表3 反應時間對堿溶性茯苓多糖提取率的影響

表4 料液比對堿溶性茯苓多糖提取率的影響

2.3 茯苓多糖提取工藝正交試驗

通過對茯苓多糖提取的單因素影響的探索，選取反應時間、堿濃度、料液比3個單因素進行正交試驗（表5），并對試驗結果進行極差分析（表6）和方差分析（表7）從而確定茯苓多糖提取的最優(yōu)條件。

表5 堿溶性茯苓多糖提取率的因素水平

表6 堿溶性茯苓多糖提取率正交試驗

表7 正交試驗方差分析

根據(jù)極差分析及最優(yōu)條件確定：堿溶性茯苓多糖提取條件最優(yōu)水平組合是A2B3C1，即反應時間8 h，堿濃度0.7 mol/L，料液比1∶30，反應溫度5℃。表6中的反應時間、堿濃度、料液比3個因素的Ⅲ型平方和依次為：0.006、0.002、0.003，堿濃度的P值小于0.01，說明堿濃度對多糖提取率的影響極顯著，進一步證明了前面的結論。

2.4 正交試驗驗證結果

按照正交試驗所得結果以反應時間8 h，堿濃度0.7 mol/L，料液比1∶30，反應溫度5℃的條件進行茯苓多糖的提取，測定其提取率分別為：71.46%、70.63%、72.77%，平均值為71.62%，大于正交試驗中任意一組的多糖提取率，因此認為正交試驗結果為茯苓多糖提取率最優(yōu)條件。

2.5 茯苓多糖紅外光譜分析

由茯苓多糖樣品紅外光譜（圖2）可知：在1 650 cm-1有一水合物吸收峰，在3 600～3 000 cm-1（S，O-H）、2 900 cm-1（m，C-H）、1 200～1 000 cm-1（S，C-O-C，C-OH）等處有多糖的特征吸收峰，在840 cm-1附近有可以表明存在α-糖苷鍵的吸收峰。

圖2 茯苓多糖樣品紅外光譜分析

3 討論與結論

從堿濃度、提取時間、料液比、反應溫度對堿性茯苓多糖提取率的影響可知，影響的大小依次為：堿濃度、提取時間、提取溫度、料液比。為了提高堿性茯苓多糖得率，可以適當提高堿濃度，但過高的濃度，會導致茯苓多糖結構的破壞。裂解強度要適中，避免大量生成羧甲基低聚糖或者單糖，影響茯苓多糖的提取率。

單因素試驗結果表明：堿濃度在0.4 mol/L之前，提取率很低，0.4～0.9 mol/L呈上升趨勢，但當NaOH濃度達到0.7 mol/L之后，提取率的增幅變小，考慮到多糖在強堿環(huán)境下容易出現(xiàn)結構破環(huán)的情況，因此把堿濃度控制在0.7 mol/L左右為宜；隨著反應溫度的提高，茯苓多糖的提取率在下降，在45℃以上之后，提取率變得很低，在5℃反應下有最高值；隨著反應時間增加，提取率逐漸增高，但8 h以后出現(xiàn)提取率降低的現(xiàn)象；隨著反應料液比升高，提取率逐漸增高，在反應料液比達到1∶30以上后，提取率增長緩慢。正交試驗結果表明，反應時間8 h，堿濃度0.7 mol/L，料液比1∶30，反應溫度5℃為研究中最優(yōu)的茯苓多糖提取條件。

此外，茯苓多糖的干燥要注意：溫度不能太高，高溫條件下干燥，會使得茯苓多糖板結，將干燥溫度控制在50℃左右為最佳。

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（責任編輯：夏亞男）

Optimization of Fuling （Poria coccus） Polysaccharides Extraction Technology

LIU-Xin，XIONG Fang-qi，YU Qian-sha，ZHANG Cheng，TANG Juan1，PENG Guo-ping
（College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University， Hunan Engineering Laboratory for Good Agricultural Practice and Comprehensive Utilization of Famous-Region Medicinal Plants， Changsha 410128， PRC）

Abstract：In order to improve the tuckahoe polysaccharide extraction process， taking tuckahoe powder as raw material， four factors orthogonal test was conducted to optimize Poria cocos polysaccharide extraction conditions by NaOH concentration， reaction temperature，reaction time and material liquid， The results showed that the Indian buead polysaccharide extraction of the optimum preparation process for 8 h reaction time， concentration of alkali 0.7 mol/L， 1∶30 material liquid ratio， reaction temperature of 5 ℃ conditions of Poria cocos polysaccharide extraction.

Key words：Poria cocos； Indian buead polysaccharide； extracting process； optimization

中圖分類號：TQ461

文獻標識碼：A

文章編號：1006-060X（2016）05-0085-04

DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.05.024

收稿日期：2015-11-16

作者簡介：劉 欣（1990-），男，湖南岳陽市人，碩士研究生，主要從事中藥多糖的提取與分離研究。

通訊作者：彭國平