朱敬敬，李　兵

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·實(shí)驗(yàn)論著·

青蒿素在小鼠花粉過敏性結(jié)膜炎早期反應(yīng)相中的作用

朱敬敬1，李兵2

Citation:Zhu JJ, Li B. Effects of artemisinin on early-phase response of allergic conjunctivitis in a murine model induced by pollen.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(6):1032-1035

摘要

目的：探討青蒿素對小鼠花粉過敏性結(jié)膜炎早期反應(yīng)相的免疫抑制作用。

方法：選取Balb/c雌性小鼠25只，隨機(jī)分為五組：A組：模型組；B組：青蒿素滴眼組；C組：青蒿素灌胃組；D組：地塞米松磷酸鈉滴眼組；E組：陰性對照組。初次誘導(dǎo)采用小鼠尾根部及足墊皮下注射豚草花粉粗浸液與弗氏佐劑的混合液，第7d和14d加強(qiáng)致敏采用腹腔注射。陰性對照組使用等量的弗氏佐劑與PBS混合液代替。在第21～27d進(jìn)行治療，青蒿素滴眼組給予1%青蒿素滴眼液滴眼，4次/d；青蒿素灌胃組按600mg/kg的劑量進(jìn)行灌胃，1次/d；地塞米松磷酸鈉滴眼組給予地塞米松磷酸鈉滴眼液滴眼，4次/d；模型組及陰性對照組給予青蒿素滴眼液基質(zhì)液滴眼。治療后采用豚草花粉變應(yīng)原滴眼激發(fā)后1h內(nèi)，取眼球用于組織病理學(xué)檢測，取血清用于豚草花粉特異性IgE測定。

結(jié)果：模型組小鼠激發(fā)后過敏癥狀較其他各用藥組明顯嚴(yán)重；地塞米松磷酸鈉滴眼組、青蒿素滴眼組及灌胃組過敏癥狀評分、肥大細(xì)胞脫顆粒比率及血清中豚草花粉特異性IgE濃度均高于陰性對照組，而顯著低于模型組。

結(jié)論：青蒿素滴眼及灌胃治療均可明顯抑制小鼠花粉過敏性結(jié)膜炎癥狀、早期反應(yīng)相中肥大細(xì)胞脫顆粒比率和豚草花粉特異性IgE的產(chǎn)生，推測青蒿素對花粉過敏性結(jié)膜炎具有一定的治療作用。

關(guān)鍵詞：青蒿素；過敏性結(jié)膜炎；肥大細(xì)胞脫顆粒

引用：朱敬敬，李兵.青蒿素在小鼠花粉過敏性結(jié)膜炎早期反應(yīng)相中的作用.國際眼科雜志2016;16(6):1032-1035

0引言

過敏性結(jié)膜炎是一種常見的眼表過敏性疾病，由于眼部組織接觸到環(huán)境中的藥物及其他過敏原而產(chǎn)生的超敏反應(yīng)性炎癥。過敏性結(jié)膜炎分兩個反應(yīng)期：早期反應(yīng)相(the early-phase reaction，EPR)和晚期反應(yīng)相(the late-phase reaction，LPR)。諸多研究表明，EPR主要包括眼部癥狀的評估，組織學(xué)上包括肥大細(xì)胞浸潤、脫顆粒以及組胺的釋放；而LPR則主要是各種炎性細(xì)胞的浸潤(嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、T細(xì)胞)[1]。當(dāng)機(jī)體初次接觸過敏原時，體內(nèi)變應(yīng)原特異性IgE與肥大細(xì)胞膜表面FcεRI相結(jié)合，使機(jī)體處于致敏狀態(tài)；當(dāng)相同變應(yīng)原再次與已處于致敏狀態(tài)的機(jī)體接觸時，變應(yīng)原與已致敏的結(jié)膜肥大細(xì)胞膜表面FcεRI上的IgE相結(jié)合，受體交聯(lián)就會觸發(fā)結(jié)膜肥大細(xì)胞脫顆粒，進(jìn)而導(dǎo)致其他一些中間介質(zhì)的釋放，如組胺、色氨酸、前列腺素、白三烯等[2]。這就導(dǎo)致了過敏性結(jié)膜炎EPR的形成，主要特征是血管擴(kuò)張、血管壁通透性增高、瘙癢。此過程持續(xù)時間約20～30min。肥大細(xì)胞釋放的趨化因子通過誘導(dǎo)局部活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)新的黏附分子，啟動了LPR。LPR發(fā)生在機(jī)體再次接觸致敏原后6～8h。各種炎細(xì)胞特別是嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤是LPR主要的組織學(xué)表現(xiàn)，此外還有嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞。抗原特異性T細(xì)胞啟動嗜酸性粒細(xì)胞向結(jié)膜移動，進(jìn)而導(dǎo)致組織損傷[3-4]。本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠過敏性結(jié)膜炎模型，并給予青蒿素進(jìn)行干預(yù)治療，探討青蒿素對小鼠花粉過敏性結(jié)膜炎早期反應(yīng)相的免疫抑制作用，為使青蒿素成為治療過敏性結(jié)膜炎的一種安全有效的方法提供實(shí)驗(yàn)及理論支持。

1材料和方法

1.1材料6～8周齡的雌性Balb/c小鼠(25只)購自遼寧本溪長生生物技術(shù)有限公司，SPF級實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑、ELISA試劑盒購自沈陽鼎國昌盛股份有限公司。羊抗小鼠IgE抗體購自深圳研順生物科技有限公司。地塞米松磷酸鈉滴眼液購自武漢五景藥業(yè)(5mL：1.25mg)。青蒿素購自重慶華方武陵山制藥有限公司(用加入微量的注射用大豆油及丙二醇的PBS混合液制成滴眼液的基質(zhì)液，取一定量的青蒿素加入基質(zhì)液中制成1%的青蒿素滴眼液，避光保存。)

1.2方法

1.2.1動物分組及治療選取6～8周齡Balb/c雌性小鼠25只，分為過敏性結(jié)膜炎模型組A組(5只)，青蒿素滴眼治療組B組(5只)，青蒿素灌胃治療組C組(5只)，地塞米松磷酸鈉滴眼治療組D組(5只)，陰性對照組E組(5只)。參考以往的豚草花粉過敏性結(jié)膜炎模型[5-8]，將含有50μg豚草花粉的PBS液與弗氏完全佐劑按1∶1的體積比例混合完全，除陰性對照組外其余各組均分別于小鼠尾根部及左后足墊皮下注射進(jìn)行初次致敏，每個部位150μL，于注射后第7d將等量的豚草花粉PBS液與弗氏不完全佐劑按1∶1的體積比例混合完全后腹腔注射進(jìn)行增強(qiáng)致敏，第14d以同樣的方法再次增強(qiáng)致敏。治療過程在末次增強(qiáng)致敏后7d(第21～27d)，A組給予青蒿素滴眼液基質(zhì)液滴眼4次/d，B組給予1%青蒿素滴眼液4次/d，C組按600mg/kg的劑量給予青蒿素灌胃1次/d，D組給予地塞米松磷酸鈉滴眼液4次/d，E組給予青蒿素滴眼液基質(zhì)液滴眼4次/d。治療結(jié)束后，各實(shí)驗(yàn)組每只小鼠給予300μg花粉蛋白粗浸液進(jìn)行滴眼激發(fā)。激發(fā)后1h內(nèi)，10%水合氯醛麻醉，采用眼球放血將小鼠處死，取下眼球用于制作病理切片行肥大細(xì)胞檢測，收集的血清用于ELISA檢測豚草花粉特異性IgE。

1.2.2臨床癥狀評估所有實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)過相應(yīng)藥物(模型組及陰性對照組為青蒿素滴眼液基質(zhì)液)的治療后，經(jīng)豚草花粉變應(yīng)原激發(fā)后，在30min內(nèi)于顯微鏡下觀察小鼠體征并進(jìn)行臨床評估。參考以往的文獻(xiàn)[8]，評估指標(biāo)包括：結(jié)膜水腫、結(jié)膜充血、眼瞼腫脹、流淚，按0～3分評分，制定評分標(biāo)準(zhǔn)：無：0分；輕度：1分；中度：2分；重度：3分。這四個類別各自得分的總和為總的評分：眼睛有嚴(yán)重的結(jié)膜充血、水腫、眼瞼腫脹、流淚者最高評分為12分，中度者最高評分為8分，輕度者最高評分為4分。

1.2.3組織病理學(xué)檢測采用眼科剪將小鼠眼球連同周邊瞼結(jié)膜一同剪下，此過程不要破壞穹隆部結(jié)膜，4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，制4μm切片，每只小鼠取不同層面的5張切片進(jìn)行瑞士-吉姆薩染色，中性樹膠封片，鏡檢。每張切片在×400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察5個視野，對視野中肥大細(xì)胞總數(shù)與肥大細(xì)胞脫顆粒數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計，然后計算出每組小鼠肥大細(xì)胞脫顆粒百分比。

1.2.4血清中豚草花粉特異性IgE水平檢測激發(fā)30min后處理小鼠，眼球取血，室溫靜置2h后保存于4℃冰箱過夜。離心后吸取上層血清，利用間接ELISA法檢測血清中豚草花粉特異性IgE水平。依照本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法，用豚草花粉粗蛋白(2ng/μL)包被，4℃過夜，3% BAS-PBS封閉，洗板后依次加入小鼠血清、生物素標(biāo)記的HRP-羊抗小鼠IgE二抗，最后加入顯色液、底物及終止液，酶標(biāo)儀450nm處讀取OD值。

2結(jié)果

2.1臨床癥狀評分結(jié)果各組小鼠結(jié)束治療后，用豚草花粉蛋白粗浸液進(jìn)行滴眼激發(fā)，激發(fā)后30min內(nèi)，對各實(shí)驗(yàn)組小鼠臨床癥狀進(jìn)行評分，結(jié)果見圖1。模型組小鼠出現(xiàn)了明顯的過敏癥狀，包括結(jié)膜充血、水腫、眼瞼腫脹、流淚；青蒿素滴眼組與灌胃組均能觀察到輕度的過敏性結(jié)膜炎的臨床癥狀，與模型組比較，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；地塞米松磷酸鈉滴眼組小鼠可見輕度的過敏性結(jié)膜炎癥狀，較青蒿素滴眼組及灌胃組有所減輕，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；青蒿素滴眼組與灌胃組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。

2.2組織病理學(xué)染色結(jié)果瑞士-吉姆薩染色見圖2。陰性對照組的肥大細(xì)胞脫顆粒百分比為(26.4±8.47)%，模型組為(66.6±9.61)%，地塞米松滴眼液組為(37.6±7.30)%，青蒿素灌胃組為(38.4±8.38)%，青蒿素滴眼組為(40.6±9.84)%。與陰性對照組比較，其余各組小鼠結(jié)膜組織中肥大細(xì)胞浸潤明顯，肥大細(xì)胞脫顆粒百分比增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；青蒿素滴眼組和青蒿素灌胃組小鼠結(jié)膜組織中肥大細(xì)胞浸潤程度及脫顆粒百分與模型組比較顯著降低,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，地塞米松磷酸鈉滴眼組小鼠結(jié)膜組織中可見輕度的肥大細(xì)胞浸潤與脫顆粒，較青蒿素滴眼組及灌胃組有所減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；青蒿素滴眼組與灌胃組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖1各組小鼠花粉過敏原激發(fā)后眼部過敏反應(yīng)的表現(xiàn)A:模型組小鼠可見嚴(yán)重的眼瞼腫脹、結(jié)膜充血、結(jié)膜水腫及分泌物增多等過敏性癥狀；B:青蒿素灌胃組小鼠眼瞼腫脹、結(jié)膜充血、結(jié)膜水腫及分泌物增多癥狀較輕；C：青蒿素滴眼組小鼠眼瞼腫脹、結(jié)膜充血、結(jié)膜水腫、分泌物增多程度較輕；D：地塞米松滴眼組小鼠眼瞼腫脹、結(jié)膜充血、結(jié)膜水腫、分泌物增多較輕；E：陰性對照組小鼠眼瞼腫脹、結(jié)膜充血、結(jié)膜水腫及分泌物增多不明顯。

圖2各組小鼠結(jié)膜組織吉姆薩染色結(jié)果(×400)A：模型組小鼠結(jié)膜組織可見大量肥大細(xì)胞浸潤，并見明顯的脫顆粒現(xiàn)象；B：青蒿素灌胃組小鼠結(jié)膜組織見少量肥大細(xì)胞浸潤，脫顆粒現(xiàn)象不明顯；C：青蒿素滴眼組小鼠結(jié)膜組織見少量肥大細(xì)胞浸潤，脫顆?，F(xiàn)象不明顯；D：地塞米松滴眼組小鼠結(jié)膜組織見少量肥大細(xì)胞浸潤，脫顆?，F(xiàn)象不明顯；E：陰性對照組小鼠結(jié)膜組織見極少量的肥大細(xì)胞浸潤，無明顯脫顆粒現(xiàn)象。

表1各組小鼠過敏原激發(fā)后眼部體征評分比較

注：aP<0.05vs陰性對照組；bP<0.01vs模型組；cP>0.05vs地塞米松滴眼組；eP>0.05vs青蒿素灌胃組。

2.3血清中豚草花粉特異性IgE的測定結(jié)果各組小鼠血清中豚草花粉特異性IgE抗體水平分別為：陰性對照組0.65±0.20，模型組2.37±0.23，地塞米松滴眼組1.23±0.10，青蒿素灌胃組1.35±0.12，青蒿素滴眼組1.43±0.07。各組小鼠與陰性對照組小鼠血清中豚草花粉特異性IgE的水平比較，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松磷酸鈉滴眼組、青蒿素滴眼組及灌胃組血清中豚草花粉特異性IgE水平顯著下降，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；地塞米松磷酸鈉滴眼組豚草花粉特異性IgE水平較青蒿素治療組有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；青蒿素滴眼組與青蒿素灌胃組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3討論

過敏性結(jié)膜炎類型有很多種，其中臨床上發(fā)病率最高及最常見的是季節(jié)性過敏性結(jié)膜炎中花粉過敏導(dǎo)致的過敏性結(jié)膜炎。過敏性結(jié)膜炎常常會伴有過敏性鼻炎、過敏性哮喘，由于該病發(fā)病率高、病程長、易反復(fù)發(fā)作、療效有限，故嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，屬于眼科難治性疾病之一。全世界過敏性結(jié)膜炎的發(fā)病率達(dá)到15%～20%(甚至有報道達(dá)到40%)，并且發(fā)病率日益增長[9]。

肥大細(xì)胞被認(rèn)為是導(dǎo)致過敏性結(jié)膜炎癥狀發(fā)生的主要細(xì)胞，肥大細(xì)胞通過產(chǎn)生炎癥介質(zhì)在早期反應(yīng)相及晚期反應(yīng)相中均發(fā)揮著重要作用[10]。有實(shí)驗(yàn)研究顯示，結(jié)膜組織中肥大細(xì)胞浸潤的數(shù)量與過敏性結(jié)膜炎的癥狀呈正相關(guān)[11]。此外，肥大細(xì)胞脫顆粒誘導(dǎo)激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，并促進(jìn)細(xì)胞因子及黏附分子的分泌和表達(dá)。變應(yīng)原特異性IgE在過敏反應(yīng)中是非常重要的免疫分子，介導(dǎo)Ⅰ型超敏反應(yīng)的發(fā)生，誘導(dǎo)結(jié)膜組織中肥大細(xì)胞脫顆粒，從而引起一系列過敏性癥狀。當(dāng)機(jī)體受到過敏原的刺激后，體內(nèi)的IgE會在6～8h內(nèi)升高，因此檢測血清中抗原特異性IgE水平有助于檢測機(jī)體的過敏情況。

傳統(tǒng)的治療過敏性結(jié)膜炎的藥物有肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑、抗組胺藥、皮質(zhì)類固醇等。然而，抗組胺藥和皮質(zhì)類固醇僅僅能夠緩解癥狀，不能從根本上治療過敏性結(jié)膜炎，而且皮質(zhì)類固醇在治療的同時還可能會帶來一些嚴(yán)重的副作用，如眼壓增高、導(dǎo)致青光眼的發(fā)生以及白內(nèi)障的形成；當(dāng)過敏性結(jié)膜炎已經(jīng)表現(xiàn)出癥狀時，肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑并不總是有效的。因此，傳統(tǒng)的治療過敏性疾病的藥物并不能完全消除復(fù)雜的免疫反應(yīng)所引起的過敏癥狀，并且藥物一旦停止，癥狀還會復(fù)發(fā)[12]。

青蒿素是從中藥青蒿中提取的有過氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯藥物，經(jīng)化學(xué)改造可以生成多種衍生物，如雙氫青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯、蒿乙醚等[13]。青蒿素作為一種治療瘧疾的有效藥物已經(jīng)有很多年的歷史了，然而近年的研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素除了具有抗瘧活性外，還具有免疫抑制作用。青蒿素在抗腫瘤、治療小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等[14-16]以及其他自身免疫性疾病方面具有一定的作用。有研究顯示，青蒿素及其衍生物可以通過對細(xì)胞免疫和體液免疫的抑制作用，阻止白細(xì)胞介素和各種炎癥因子的釋放[17-19]。本研究中，將青蒿素用于小鼠花粉過敏性結(jié)膜炎模型，結(jié)果顯示青蒿素滴眼組及灌胃組小鼠的過敏癥狀均較模型組減輕；組織切片瑞士-吉姆薩染色發(fā)現(xiàn)，結(jié)膜組織肥大細(xì)胞浸潤程度及脫顆粒比率明顯較模型較組減少；各組小鼠血清中豚草花粉特異性IgE水平比較，青蒿素灌胃組與滴眼組較模型組顯著降低。地塞米松磷酸鈉滴眼組各項指標(biāo)雖較青蒿素用藥組有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明青蒿素對于治療豚草花粉所致過敏性結(jié)膜炎具有一定的療效，提示青蒿素有望成為治療過敏性結(jié)膜炎的一種新藥。

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Effects of artemisinin on early-phase response of allergic conjunctivitis in a murine model induced by pollen

Jing-Jing Zhu1, Bing Li2

Foundation item:Natural Science Foundation of Liaoning (No.2013022001)

1Graduate School, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China;2Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University，Jinzhou 121001, Liaoning Province, China

Correspondence to:Bing Li.Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province.jzslibingv@163.com

Received：2016-02-29Accepted：2016-05-18

Abstract

?AIM: To investigate the immunosuppression of artemisinin in the early-phase response(EPR) of allergic conjunctivitis in a murine model induced by pollen.

?METHODS: Twenty-five Balb/c mice were divided into five groups at random: A: model group, B: artemisinin topical treatment group, C: oral artemisinin group, D: dexamethasone topical treatment group, E: negative control group. Balb/c mice were first sensitized with mixture of ragweed crude extract and complete Freund’s adjuvant by left footpad and root of tails injection at days 0. At days 7 and 14, mice were strengthen sensitized by intraperitoneal injection. Negative control group replacd with a mixture of equal amounts of Freund’s adjuvant and PBS mixture. Treatment time was between 21-27d: group B received 1% topical artemisinin eye drops 4 times per day; group C received artemisinin at doses of 600mg/kg orally once per day; group D received topical dexamethasone eye drops 4 times per day. The model and naive groups replaced with solvent for control. After treatment, mice were excited by ragweed pollen crude infusion drops. Within 1h after the excitation, the eyes were taken for histopathology testing, the serum for detection of specific IgE for ragweed pollen.

?RESULTS: After excitation, allergy symptoms of model group were more significantly compared with negative control group and the treatment groups; allergy symptom score, mast cell degranulation ratios and the ragweed pollen specific IgE in serum in the topical treatment groups and oral group were higher than that in the negative control group, but significantly lower than that in model group.

?CONCLUSION: Artemisinin topical treatment and oral treatment for mice could inhibit the symptoms of pollen allergic conjunctivitis, early-phase response of mast cell degranulation ratio and specific IgE generation for ragweed pollen, suggesting that artemisinin has some therapeutic effect for pollen allergic conjunctivitis.

KEYWORDS:?artemisinin; allergic conjunctivitis; mast cell degranulation

基金項目：遼寧省自然科學(xué)基金資助項目(No.2013022001)
作者單位：
1(121001)中國遼寧省錦州市，錦州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院；
2(121001)中國遼寧省錦州市，錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科

作者簡介：朱敬敬，在讀碩士研究生，研究方向：角膜病、眼表疾病。

通訊作者：李兵，醫(yī)學(xué)博士，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：角膜病、眼表疾病.jzslibingv@163.com

收稿日期：2016-02-29 修回日期： 2016-05-18

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.6.07