臧玉紅

(承德石油高等?？茖W校 化學工程系,河北　承德　067000)

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香菇母種組織分離控制褐變的實驗研究

臧玉紅

(承德石油高等?？茖W校 化學工程系,河北承德067000)

摘要：為降低香菇母種組織培養(yǎng)過程中外植體的褐變程度，從菌塊的大小、菌種的表面消毒時間、培養(yǎng)基的新鮮程度、培養(yǎng)基中活性炭及瓊脂的含量進行綜合實驗。結果表明：菌塊大小選擇在0.5～0.9 cm2，升汞消毒時間保持在3～5 min,使用活性炭含量為0.2%～0.4%，瓊脂含量為2.0%～4.0%，新鮮度為4 d內(nèi)的培養(yǎng)基，能有效地控制褐變，并使菌絲生長健壯。

關鍵詞：香菇；褐變；組織分離

香菇享有“菇中皇后”等美稱[1]，隨著人們對香菇營養(yǎng)價值和保健功能的認識，栽培面積不斷擴大，培養(yǎng)過程中褐變等問題也凸顯出來，直接制約著香菇業(yè)的發(fā)展[2-3]。褐變是指外植體在培養(yǎng)過程中，自身組織從表面向培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì),以致培養(yǎng)基逐漸變成褐色,外植體也隨之進一步褐變而死亡的現(xiàn)象。褐變產(chǎn)物不僅使外植體、細胞、培養(yǎng)基等變褐色，而且對許多酶也有抑制作用。香菇組織分離培養(yǎng)過程中，組織塊褐變現(xiàn)象嚴重，前期影響菌絲生長，后期將培養(yǎng)基染成褐色，從而影響母種分離成功率和質(zhì)量[4-5]。本實驗利用香菇菌柄、菌蓋交接處的組織作為外植體，從接種組織塊大小、消毒時間、培養(yǎng)條件等方面，研究物理和化學因素對香菇離體培養(yǎng)中外植體褐化的影響，以期將褐變控制在最低程度，提高離體快繁效率，為香菇工廠化育苗奠定技術基礎。

1材料與方法

1.1實驗材料

香菇(品種939)，食用菌生產(chǎn)大棚采摘；瓊脂、活性炭等化工商店采購，分析純。

1.2實驗儀器

超凈工作臺、培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、微生物培養(yǎng)室、試管、三角瓶等。

1.3實驗設計

1.3.1接種組織塊大小對褐變的影響

分別選用0.1 cm3、0.3 cm3、0.5 cm3、0.7 cm3、0.9 cm3、1.1 cm3六種不同大小的組織塊進行接種，每種組織塊接種試管20支試管，每支兩粒，觀察記錄組織塊變化及菌絲生長狀況。

1.3.2接種組織塊消毒時間對褐變的影響

在無菌操作臺上用75%乙醇溶液擦拭消毒后，再分別用0．1%升汞浸泡1、3、5、7、9、11 min，再用無菌水沖洗3～4次，接種于培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每種處理接種20支試管，每瓶接種兩粒，培養(yǎng)觀察。

1.3.3培養(yǎng)基放置不同時間(表面含水量不同)對褐變的影響

分別將0.6 cm3處理好的組織塊接種不同新鮮度的培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基分別放置0 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d，然后接種香菇組織塊，每個處理20支，每支接兩粒，培養(yǎng)觀察記錄組織塊、培養(yǎng)基變化及菌絲生長情況。

1.3.4培養(yǎng)基中活性炭添加量對褐變的影響

在培養(yǎng)基上分別加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的活性炭作為吸附劑，每個處理接種20支，每支接兩粒，培養(yǎng)觀察記錄結果。

1.3.5培養(yǎng)基加入瓊脂量對褐變的影響

在配制培養(yǎng)基時加入不同濃度的瓊脂，瓊脂用量分別為5、10、15、20、25 g/L，每個處理接種20支，每支接兩粒，培養(yǎng)觀察、統(tǒng)計結果。

1.3.6在最佳條件下研究對褐變率的影響

通過上面實驗結果，在最佳條件下設計實驗，統(tǒng)計褐變率，驗證實驗結果。

1.4實驗方法

1.4.1香菇的選擇及消毒從食用菌生產(chǎn)棚采摘新鮮無破損、無蟲害、成熟前期的香菇(品種為939)，表面用75%的酒精擦洗消毒備用。

1.4.2培養(yǎng)基的制備 基礎培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL)，pH自然。常規(guī)方法制備試管斜面培養(yǎng)基。

1.4.3香菇組織塊的接種與培養(yǎng)。在超凈工作臺上嚴格按照無菌操作規(guī)程接種。把接種好的試管，做好標記，擺放到培養(yǎng)架上置于25 ℃、暗光條件下培養(yǎng)，每天觀察記錄，持續(xù)40 d。

1.5數(shù)據(jù)處理

1.5.1褐變率的計算

褐變率=褐變個數(shù)/接種個數(shù)×100%

1.5.2實驗數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS 1.7進行分析處理[6]。

2結果與分析

2.1接種組織塊大小對香菇組織培養(yǎng)過程中褐變的影響

選用大小不同的組織塊接種到基礎培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察記錄的結果見表1。

通過表1分析可知，隨著菌塊的增大，褐變率明顯下降，菌塊越小，褐變率越高，0.1 cm2的菌塊褐變率達到51.95%，褐變數(shù)一半以上。小于0.3 cm2以下的菌塊，褐變率高可能是菌塊較小，切割面積大，與外界接觸面積就大，褐變的幾率隨之增加，菌塊太小很難長出菌絲，同時長出的菌絲生長非常緩慢，所以菌塊太小不適合接種；另外，當菌塊達到1.1 cm2時，菌塊增大，消毒不容易徹底，褐變率降低1%，降幅不明顯，所以接種菌塊以0.5～0.9 cm2較好。

表1　組織塊大小對褐變及菌絲生長情況的影響

注：同一列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著性(p<0.05)，下同。

2.2消毒時間對香菇組織培養(yǎng)中褐變的影響

將0.6 cm2大小的新鮮菌塊進行不同時間的消毒，然后進行培養(yǎng)，所得結果如表2。

表2　消毒時間對褐變及菌絲生長情況的影響

表2的數(shù)據(jù)分析可知，隨著升汞消毒時間的增加，褐變率逐漸增加，當消毒時間為1 min時，褐變率最低為12.5%，但菌快污染率較高，菌絲生長受影響；當消毒時間為11 min時，褐變率可高達到46.35%，且消毒時間大于9 min以上時，有可能對菌塊表面的組織破壞，從而菌絲生長開始變得緩慢，綜合考慮，消毒時間為3～5 min為宜。

2.3培養(yǎng)基新鮮度對香菇組織培養(yǎng)中褐變的影響

把接種到不同新鮮度培養(yǎng)基的菌種在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，結果如表3。

表3　培養(yǎng)基新鮮度對褐變及菌絲生長情況的影響

從表3數(shù)據(jù)分析可知，隨著培養(yǎng)基新鮮度的下降，褐變率逐漸增加，從12.54%至30.53%，這可能是隨著培養(yǎng)基放置時間的延長，一方面水分減少比較多，另一方面培養(yǎng)基本身也增大了污染性，從而使外植體菌快生長菌絲的時間推遲，褐變率提高。因此，用于接種的培養(yǎng)基以不超過4d的新鮮培養(yǎng)基為宜。

2.4培養(yǎng)基中活性炭對香菇組織培養(yǎng)中褐變的影響

在不同活性炭比例的培養(yǎng)基上接上菌種后培養(yǎng)，觀察記錄的結果如表4。

通過表4數(shù)據(jù)分析可知，隨著培養(yǎng)基中活性炭百分比濃度的增加，褐變率逐漸下降，但是下降的幅度都比較小，下降10%左右，也就是說活性炭的加入量對褐變率影響較小。活性炭具有較強的吸附作用，可以吸附菌種產(chǎn)生的褐色有毒物質(zhì)，減少有害物質(zhì)對接種菌體的影響，從而降低褐化率。但是活性炭同時也吸附了培養(yǎng)基中的一些生長調(diào)節(jié)劑，隨著活性炭濃度的加大不僅降低了菌絲的形成，還影響了菌絲的生長，所以活性炭的加入量應以加入少量為佳。

表4　活性炭對褐變及菌絲生長情況的影響

2.5培養(yǎng)基中瓊脂對香菇組織培養(yǎng)中褐變的影響

在不同瓊脂比例的培養(yǎng)基上接種菌種后培養(yǎng)，觀察記錄的結果如表5。

表5　瓊脂含量對褐變率的影響

由表5可知，培養(yǎng)基中含瓊脂的多少，直接影響培養(yǎng)基的硬度，也就影響香菇組織培養(yǎng)的褐變率。使用0.5%、1.0%的瓊脂，培養(yǎng)基硬度小，基本上呈半固體培養(yǎng)基，尤其是當含有0.5%的瓊脂時，接種后，菌塊淹沒進入培養(yǎng)基中，褐變率高達60.33%，且菌絲生長較少。隨著加大瓊脂的用量，增加了培養(yǎng)基的硬度，褐變率也隨之減輕。當培養(yǎng)基中瓊脂用量為3.0%時，褐變率達到最低值17.55%．隨著培養(yǎng)基硬度進一步加大，褐化率又出現(xiàn)上升趨勢，褐化多產(chǎn)生于培養(yǎng)基接觸的部位,這可能是由于硬度過大，阻礙了菌種外滲的有毒褐色物質(zhì)的擴散，造成有毒物質(zhì)的局部累積，從而加大了褐化程度。瓊脂僅僅是起到影響培養(yǎng)基硬度的作用，而不給菌種提供營養(yǎng)等，瓊脂的含量多少對菌絲的生長狀況影響較少，所以，瓊脂的用量主要考慮褐變率，應該在2.0%～4.0%較好。

2.6驗證實驗結果

在最佳實驗條件下接種培養(yǎng)，統(tǒng)計褐變率結果如表6。

表6　最佳條件下對褐變率及菌絲生長情況的影響

由表6可知，在較優(yōu)的培養(yǎng)條件下，褐變率得到有效的控制，降低到8%，并且菌絲生長良好，可見本課題的結果有較強的實踐指導性。

3結論

食用菌組織培養(yǎng)過程中引起褐變的因素是復雜的，隨種類、基因型、外植體部位等的不同，褐化程度也有所不同。本實驗從菌塊大小、消毒時間、培養(yǎng)基添加劑等5個方面對香菇離體培養(yǎng)中外植體褐化的影響進行了研究，使褐變率控制在8%較低的程度，降低了生產(chǎn)成本，為香菇快繁提供了可靠的實驗數(shù)據(jù)。

參考文獻：

[1]萬伏紅,謝經(jīng)榮,雍松林.香菇營養(yǎng)價值豐富具有廣泛的市場前景[J]．農(nóng)村實用技術，2013(4):53.

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[3]班新河,魏銀初,王震，等.香菇栽培集成新技術在生產(chǎn)中的應用[J].食用菌，2014，36(3):38-40.

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[5]彭麗萍,郜海蓮.防止軟籽石榴外植體褐變的研究[J].安徽科技學院學報,2011,25(2):28-31.

[6]唐世星,毛玉強,楊光.Mathematica在高等數(shù)學實驗中的應用[J].承德石油高等專科學校學報,2014(5):48-50.

Browning Control of Mother Species in Tissue Separation of Lentinus Edodes

ZANG Yu-hong

(Department of Chemical Engineering, Chengde Petroleum College, Chengde 067000, Hebei, China)

Abstract:Edible fungus block size, sterilization time of edible fungus surface, freshness of culture medium, the content of activated carbon and agar in culture medium were comprehensive studied for reducing the browning rate of explants mother species in tissue culture of shiitake mushrooms. The results showed that the browning rate control and mycelial growth were best when bacteria block size was between 0.5～0.9 cm2, the explants were sterilized by 0.1% mercury solution for 3～5 min, the content of activated carbon in culture medium was 0.2%～0.4%, the content of agar in culture medium was 2.0%～4.0%, and freshness of medium was within 4 days.

Key words:lentinus edodes; browning; tissue separation

基金項目：河北省科技支撐計劃項目(廢棄菇渣在蔬菜無土栽培中的配方研究及栽培模式的建立)：12227304

收稿日期：2015-10-19

作者簡介：臧玉紅(1968-)，女，河北保定人，承德石油高等?？茖W?；瘜W工程系副教授，碩士，從事生物技術、生物化工、微生物等方面的教學科研工作。

中圖分類號：S646

文獻標識碼：A

文章編號：1008-9446(2016)02-0013-04