李昊一,李冬敏,馬剛,商艷麗,孫英

( 河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 藥物化學(xué)與分子診斷教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北保定　071002)

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牛血清白蛋白聚集體的分解動(dòng)力學(xué)

李昊一,李冬敏,馬剛,商艷麗,孫英

( 河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 藥物化學(xué)與分子診斷教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北保定071002)

摘要：以牛血清白蛋白(BSA)作為模型蛋白,通過濁度法研究BSA形成的無序蛋白聚集體的分解動(dòng)力學(xué)并揭示其復(fù)雜結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié).實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),BSA無序聚集體在堿性條件下分解過程有4個(gè)動(dòng)力學(xué)階段,包括1個(gè)快速的分解階段,2個(gè)相對(duì)較慢的分解階段和1個(gè)動(dòng)力學(xué)惰性階段.由此推測BSA聚集體中至少含有4種不同的BSA單體形態(tài).

關(guān)鍵詞：蛋白聚集體；牛血清白蛋白；濁度法；動(dòng)力學(xué)

蛋白質(zhì)聚集是所有蛋白的一種固有性質(zhì),在合適的條件下,可以說所有的蛋白都可以發(fā)生聚集.在生物制藥業(yè),這種聚集對(duì)蛋白藥物的生產(chǎn)提出巨大的挑戰(zhàn)[1-5].它幾乎影響到所有的生產(chǎn)步驟的質(zhì)量控制,如發(fā)酵階段[6]、搖動(dòng)階段[7]、冷凍干燥階段[8]、成型階段[1]和儲(chǔ)藏階段[9-10].蛋白藥物的聚集會(huì)降低生產(chǎn)效率,縮短藥物保存期,使藥物的釋放變得復(fù)雜[2],更嚴(yán)重的是,這種聚集很可能會(huì)使病人產(chǎn)生免疫反應(yīng),成為生物制藥業(yè)最嚴(yán)重的安全隱患[11-13].此外,在生物體內(nèi),蛋白聚集還和40多種神經(jīng)退行性疾病、全身性疾病和非全身性疾病相關(guān)[14-15].這些淀粉樣疾病包括阿爾茨海默病[16]、帕金森癥[17]和Ⅱ型糖尿病[18],它們都和某種特定類型蛋白的聚集相關(guān).

蛋白聚集是一個(gè)非常復(fù)雜的蛋白自我結(jié)合過程,包含多步動(dòng)力學(xué)機(jī)制[19].這些步驟包括：1)蛋白單體的解折疊；2)可逆寡聚物的形成；3)成核過程；4)可溶的大分子量的中間態(tài)聚集體的形成；5)成熟纖維狀或無序聚集體的形成[19].蛋白聚集過程受很多因素影響,如溫度、pH、離子強(qiáng)度、震蕩和剪切力、凍融和凍干、干燥、有機(jī)溶劑、金屬離子、壓力、疏水表面以及濃度等.不同的外界條件和聚集方式可以誘導(dǎo)形成形貌各異的各種類型聚集體.

雖然蛋白聚集體的形貌各異、大小不同,仍可以大致把它們分為2類：有序蛋白聚集體和無序蛋白聚集體.有序蛋白聚集體主要是淀粉樣纖維聚集體,它與如前所述的許多影響人類健康的重大疾病相關(guān)[14].有序結(jié)構(gòu)使得這些淀粉樣纖維相對(duì)而言容易進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,因此,到目前為止人們已經(jīng)對(duì)它們的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)有了很多了解.目前已知,在此類有序蛋白聚集體中,每條纖維都是由多個(gè)沿纖維軸縱向延展的β片層構(gòu)成,β片層中的多肽鏈和纖維軸垂直,而組成纖維的片層則與纖維軸平行[20].這樣的超分子結(jié)構(gòu)在X線衍射分析中約4.8 ×10-10m和 8×10-10～11×10-10m位置上會(huì)有特征的衍射峰,它們分別對(duì)應(yīng)于肽鏈間距離和片層間距離[20-21].相對(duì)而言,對(duì)于在生物制藥過程中經(jīng)常出現(xiàn)的無序聚集體,人們對(duì)它們的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)了解甚少.實(shí)際上,即便采用先進(jìn)的固態(tài)核磁技術(shù),這種無序聚集體仍是難以表征.

本研究中,筆者擬應(yīng)用濁度法對(duì)無序蛋白聚集體的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)進(jìn)行研究.濁度法是蛋白藥物生產(chǎn)過程中為數(shù)不多的有效的質(zhì)量控制技術(shù)之一[13],易于表征蛋白聚集體的存在.但是,據(jù)筆者所知,濁度法尚沒有被用于蛋白聚集體復(fù)雜結(jié)構(gòu)的研究.筆者采用濁度法研究牛血清白蛋白(BSA)無序聚集體的分解動(dòng)力學(xué),并通過動(dòng)力學(xué)分析探討無序蛋白聚集體中的BSA分子是單一結(jié)構(gòu)還是具有多種不同類型.對(duì)于無序聚集體,一般人們會(huì)認(rèn)為在聚集體中所有的BSA分子混亂無序,共同形成一個(gè)整體.這種觀點(diǎn)看似合理,但是筆者的研究將給出不同的結(jié)果.

1材料與方法

1.1材料與儀器

質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%的牛血清蛋白(BSA)從瑞士羅氏公司購得；質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%的氯化鈉(NaCl)從美國Sigma-Aldrich公司購得；高純水通過美國密理博純水機(jī)制備；氫氧化鈉(NaOH)購自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司,為分析純；鹽酸(HCl)購自北京化工廠,為優(yōu)級(jí)純；活性炭購自天津市進(jìn)豐化工有限公司,為分析純,使用前活化.

德國Implen Nanophotometer紫外可見分光光度計(jì)；俄羅斯NT-MDT Solver P47掃描探針顯微鏡；美國Beckman Coulter DelsaTMNano C粒度分析儀.

1.2BSA的提純

市售BSA通常含有一定量的脂肪酸雜質(zhì),雖然含量各不相同,但是會(huì)阻礙BSA聚集,因此必須除去.筆者采取的方法如下[22]：稱量BSA 300 mg,加高純水15 mL,攪拌使其完全溶解后,用0.2 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至1.5左右,加入活性炭300 mg吸收雜質(zhì),置于冰水浴中磁力攪拌1 h.然后用15 000 r/min速度離心3次,每次10 min.取上清液,確保沒有活性炭殘留,用0.2 mol/L 的NaOH調(diào)節(jié)pH 至8.9左右,最后過 0.22 μm的濾膜,得到澄清的且無活性炭的BSA 溶液.用紫外可見分光光度計(jì)測定此時(shí)的BSA 溶液的質(zhì)量濃度,約為15 mg/mL,BSA聚集實(shí)驗(yàn)待用.

1.3BSA的聚集和聚集體預(yù)處理

取上述pH=8.9的BSA 溶液,加入NaCl 促進(jìn)聚集,使NaCl的最終濃度約為240 mmol/L,62 ℃加熱BSA溶液24 h.在孵育過程中,澄清的BSA溶液會(huì)逐漸變得渾濁.在24 h聚集過程結(jié)束以后,15 000 r/min離心20 min,以去除較大的顆粒獲得含BSA納米級(jí)顆粒的膠體溶液體系.

1.4濁度法研究BSA聚集體的分解動(dòng)力學(xué)

基于上述內(nèi)容，本文將引入Pareto分析法、Hamming距離測度、加權(quán)平均算子方法構(gòu)建智能變電站裝配式建筑造價(jià)評(píng)價(jià)模型。

離心處理后的BSA膠體溶液用于BSA聚集體分解過程的研究.取一系列1.5 mL BSA 聚集體溶液,分別加入不同pH值的NaOH溶液0.5 mL.此外,另取1.5 mL BSA 聚集體溶液加0.5 mL高純水作為對(duì)照組.混合均勻后,用德國Implen紫外可見分光光度計(jì)測量各溶液在400 nm濁度(濁度用光密度OD表示).采用400 nm進(jìn)行測量是為了避免蛋白中的色氨酸在280 nm處的吸收干擾.濁度隨時(shí)間的變化使用多指數(shù)函數(shù)衰減曲線進(jìn)行擬合.動(dòng)力學(xué)死時(shí)間為1 min,也就是說,在濁度測量之前,需要1 min將BSA聚集體溶液與NaOH混合.筆者報(bào)道的pH值為濁度研究的最終pH.整個(gè)實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行.

1.5原子力顯微鏡(AFM)研究BSA聚集體形貌

AFM圖像通過俄羅斯的NT-MDT Solver P47掃描探針顯微鏡,采用輕敲模式測得.探針懸臂共振頻率為100 kHz,力常數(shù)為3 N/m.BSA聚集體樣品用高純水稀釋100倍,然后滴在嶄新的云母表面.靜置5 min后,用去離子水沖洗云母表面,自然風(fēng)干后測樣.

1.6動(dòng)態(tài)光散射(DLS)研究BSA聚集體粒度

BSA聚集體的粒徑分布采用美國Beckman Coulter 的DelsaTMNano C particle size analyzer測定.樣品放入一次性塑料樣品池,室溫測量.數(shù)據(jù)通過儀器內(nèi)置軟件處理.

2結(jié)果與討論

2.1濁度實(shí)驗(yàn)概述

在研究BSA聚集體的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)時(shí)基于如下假設(shè)：在合適的環(huán)境微擾下,不同狀態(tài)的BSA分子在聚集體中的分解速率不同.在堿性條件下,監(jiān)測BSA聚集體分解過程的濁度變化,得到濁度衰減曲線,并對(duì)其進(jìn)行擬合,以揭示不同動(dòng)力學(xué)階段的存在.每個(gè)動(dòng)力學(xué)階段都代表著不同的BSA分子存在狀態(tài),也就是說,BSA聚集體分解的濁度衰減曲線的多指數(shù)函數(shù)擬合結(jié)果,將說明BSA聚集體結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性.這個(gè)思路類似于廣泛應(yīng)用在蛋白質(zhì)折疊研究里的動(dòng)力學(xué)方法,即蛋白折疊動(dòng)力學(xué)擬合曲線中的不同階段對(duì)應(yīng)折疊過程中不同的動(dòng)力學(xué)中間體[23-26].聚集體分解研究和蛋白質(zhì)折疊研究之間最主要的區(qū)別是前者筆者使用濁度方法監(jiān)測蛋白聚集體,后者人們利用光譜技術(shù)監(jiān)測蛋白單體.

2.2制備穩(wěn)定的BSA聚集體

2.3BSA聚集體的AFM和DLS表征

在動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)前,首先需要使用AFM和DLS來表征BSA聚集體.如圖2的AFM圖像所示,BSA聚集體是形狀不同、大小不一的無序聚集體,大小從幾十納米到上百納米不等.因?yàn)锳FM不易檢測溶液中的聚集體粒徑分布情況,通過DLS得到精確地BSA聚集體粒徑分布,見圖3,從中可以看出BSA聚集體的尺寸為20～100 nm.DLS更適合表征球形顆粒,通過AFM圖像可以看出BSA聚集體是不規(guī)則形狀的,所以在本實(shí)驗(yàn)中DLS結(jié)果更適合作為BSA聚集體粒徑范圍的定性分析結(jié)果.

圖1　BSA聚集體系統(tǒng)濁度的穩(wěn)定性(OD) Fig.1　Turbidity stability of BSA aggregate system(OD).

圖2　BSA聚集體無序性質(zhì)的AFM表征Fig.2　AFM characterization of BSA aggregate showing its amorphous nature

2.4BSA聚集體堿性條件下分解的動(dòng)力學(xué)分析

圖4展示了基于濁度法分析的不同pH條件下BSA聚集體分解的動(dòng)力學(xué)曲線.從pH=11.6到pH=13.3,研究了7個(gè)不同的pH值.顯然,堿性條件下BSA聚集體容易分解,分解導(dǎo)致聚集體粒徑減小,所以濁度降低.衰減曲線采用多指數(shù)方程擬合,如圖4所示,各曲線擬合參數(shù)列于表1.從圖4和表1中可以看出,當(dāng)pH=11.6,11.8,12.1時(shí),衰減曲線用單指數(shù)方程擬合吻合性較好.這就是說,在這些pH條件下只有1種BSA聚集體分子分解.而pH=12.4,12.6,12.9,13.3時(shí),衰減曲線更適合用雙指數(shù)方程擬合,即在這些pH條件下有2種BSA聚集體分子分解.然而,在上述全部pH條件下,濁度下降到一定程度后都不會(huì)再有進(jìn)一步變化,不會(huì)完全消失,這說明BSA聚集體不能全部分解,仍然有一些BSA分子可以很好地抵抗堿性條件并且緊密的結(jié)合在一起.綜上所述,筆者認(rèn)為至少有3種BSA分子存在于BSA無序聚集體中.

圖4　濁度法分析不同pH堿性條件下BSA聚集體的

表1　不同pH條件下BSA聚集體分解動(dòng)力學(xué)擬合結(jié)果

單指數(shù)衰減方程:y=y0+A1exp(-k1t)；雙指數(shù)衰減方程:y=y0+A1exp(-k1t)+A2exp(-k2t),k1和k2為分解速率,t為時(shí)間,R2為擬合相關(guān)系數(shù).

2.5擬合唯一性的驗(yàn)證

得到上述擬合結(jié)果后,需要對(duì)其唯一性進(jìn)行驗(yàn)證.由于任何數(shù)學(xué)擬合都受到主觀性的影響,對(duì)于同樣一條動(dòng)力學(xué)衰減曲線,可能有幾套擬合參數(shù)都可以和它很好地吻合.為了避免這種現(xiàn)象的發(fā)生,進(jìn)行了額外的擬合,結(jié)果見圖5.圖5中,使用雙指數(shù)函數(shù)對(duì)pH=11.6時(shí)的衰減曲線進(jìn)行擬合,可以看出擬合結(jié)果非常好,但擬合參數(shù)中的k1和k2是相等的,說明此時(shí)曲線使用單指數(shù)擬合方式即可.在圖6中,用單指數(shù)函數(shù)對(duì)pH=12.6時(shí)衰減曲線的擬合唯一性進(jìn)行驗(yàn)證,擬合曲線明顯偏離了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn),所以在pH=12.6時(shí)采用雙指數(shù)函數(shù)進(jìn)行擬合是合適的.

圖5pH=11.6時(shí)BSA聚集體的分解動(dòng)力學(xué)曲線和其雙指數(shù)函數(shù)擬合

圖6pH=12.6時(shí)BSA聚集體的分解動(dòng)力學(xué)曲線和其單指數(shù)函數(shù)擬合

Fig.5Dissociation kinetic curve of BSA aggregate at pH=11.6 and its double-exponential fit

Fig.6Dissociation kinetic curve of BSA aggregate at pH=12.6 and its single-exponential fit

2.6BSA聚集體分解的快速反應(yīng)階段

通過詳細(xì)分析擬合結(jié)果,發(fā)現(xiàn)BSA聚集體分解過程存在一個(gè)快速反應(yīng)階段.在蛋白質(zhì)折疊研究中,快速反應(yīng)階段(burst phase)指的是在死時(shí)間內(nèi)(如在反應(yīng)物快速混和過程中)發(fā)生的快速折疊過程[23].在本實(shí)驗(yàn)中,快速反應(yīng)階段是指在BSA聚集體和NaOH溶液的混合過程這個(gè)死時(shí)間內(nèi)發(fā)生的快速分解過程.它的大小等于零時(shí)刻的濁度真實(shí)值和擬合結(jié)果外推值之間的差值.在圖7中,通過pH=12.4時(shí)的分解動(dòng)力學(xué)曲線來說明本實(shí)驗(yàn)中快速反應(yīng)階段的定義.零時(shí)刻真實(shí)的OD值實(shí)際上應(yīng)該是用相同體積純水代替NaOH溶液加入BSA聚集體溶液的對(duì)照組中BSA聚集體的OD值,而計(jì)算的OD值是通過擬合曲線外推得到的.在圖7中,計(jì)算得到的OD值為0.266,真實(shí)的OD值為0.388.這2個(gè)OD值的差值0.122即為快速反應(yīng)階段的量值.這說明快速反應(yīng)階段就是,在NaOH加入BSA聚集體溶液所需的1 min死時(shí)間內(nèi),一些BSA分子快速從BSA聚集體中分解的階段.假設(shè)這些快速分解的BSA分子屬于第4種BSA分子,位于BSA聚集體的最外層.表2中,列出了在所有pH條件下真實(shí)的OD值、推測的OD值和快速反應(yīng)階段的量值,從中可以看出在所有pH條件下都能觀察到快速反應(yīng)階段的存在.

圖7　濁度法研究中快速反應(yīng)階段的定義Fig.7　Illustration of the definition of burst phase in the turbidity assay

表2　BSA聚集體不同pH條件下零時(shí)刻真實(shí)的OD值、推測的OD值和快速反應(yīng)階段的量值

2.7BSA聚集體中4種不同分子

筆者認(rèn)為觀察到的4個(gè)動(dòng)力學(xué)階段,包括1個(gè)快速分解階段,2個(gè)相對(duì)較慢的階段和1個(gè)動(dòng)力學(xué)惰性階段,它們分別對(duì)應(yīng)BSA無序聚集體中的4種分子.由此可能有人對(duì)本文的結(jié)論有以下幾個(gè)疑問：第1個(gè)疑問是,在蛋白聚集過程中,蛋白質(zhì)在聚集體表面和內(nèi)層本質(zhì)上是不同的.因此,可能會(huì)認(rèn)為,在BSA的分解動(dòng)力學(xué)中,表面和內(nèi)層的蛋白質(zhì)應(yīng)該不同,從而導(dǎo)致至少2個(gè)動(dòng)力學(xué)階段.筆者認(rèn)為這種假設(shè)無法解釋觀察到的現(xiàn)象.首先,1個(gè)分子層的分解不能提供可以產(chǎn)生明顯濁度改變的聚集體總體積上的變化.濁度分析無法檢測BSA聚集體第1層和第2層分解速率之間的區(qū)別.其次,第1個(gè)分子層的分解會(huì)讓之前的第2層成為新的第1層.原則上,這2層分子仍有相同的分解速率.因此,筆者觀察到的多重動(dòng)力學(xué)階段表明BSA聚集體結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性.第2個(gè)疑問是,觀察到不同的動(dòng)力學(xué)速率是否對(duì)應(yīng)于不同類型的BSA聚集體的分解,而不是不同類型的BSA分子.筆者的DLS研究可以排除這種可能性.在圖8、圖9中展示了BSA聚集體在pH=12.1和pH=12.9條件下分解過程的DLS表征.如圖所見,分解過程并沒有導(dǎo)致BSA聚集體在一個(gè)特定的尺寸范圍消失或減少,BSA聚集體的粒徑分布是整體移動(dòng)的.

圖8　pH=12.1時(shí)BSA聚集體分解的DLS表征 圖9　pH=12.9時(shí)BSA聚集體分解的DLS表征Fig.8　DLS characterization of the dissociation of BSA Fig.9　DLS characterization of the dissociation of BSAaggregate system at pH=12.1 aggregate system at pH=12.9

圖10　動(dòng)力學(xué)速率(k1)和pH之間的線性相關(guān)分析 Fig.10　Linear correlation analysis between kinetic dissociation rate (k1) and pH

2.8與胰島素纖維聚集體分解的比較

此前,Shammas等人進(jìn)行過胰島素有序纖維聚集體在堿性條件下的分解動(dòng)力學(xué)研究[27].筆者要在此討論一下這2種不同的聚集體在堿性條件下分解特性的不同：第一，在胰島素有序纖維聚集體系統(tǒng)只有2個(gè)動(dòng)力學(xué)階段,沒有觀察到快速反應(yīng)階段和動(dòng)力學(xué)惰性階段,在強(qiáng)堿性條件下,胰島素纖維全部分解.不同的是,筆者發(fā)現(xiàn)對(duì)于BSA無序聚集體系統(tǒng)來說,分解過程存在4個(gè)動(dòng)力學(xué)階段,包括1個(gè)快速反應(yīng)階段,而且在強(qiáng)堿性條件下,BSA聚集體不會(huì)全部分解,即存在動(dòng)力學(xué)惰性階段.第二,對(duì)于胰島素纖維,分解速率的對(duì)數(shù)和pH值之間存在完美的線性關(guān)系.這是因?yàn)橐葝u素纖維中有一個(gè)獨(dú)特的酸性氨基酸對(duì)其穩(wěn)定性產(chǎn)生了決定性的作用.筆者也對(duì)BSA聚集體的分解速率和pH值之間的關(guān)系進(jìn)行了研究,結(jié)果如圖10所示.在圖10中,展示了不同pH條件下進(jìn)行的80次濁度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果.采用動(dòng)力學(xué)速率k1進(jìn)行線性相關(guān)分析,從中可以看出只有一個(gè)粗略的線性相關(guān)性,并沒有一個(gè)很好的線性關(guān)系,說明有一系列酸性氨基酸都幫助維持BSA聚集體的穩(wěn)定性.這一現(xiàn)象可以歸因于BSA聚集體的無序特性.

3結(jié)論

在本文中,用濁度法研究了BSA無序聚集體的分解動(dòng)力學(xué),發(fā)現(xiàn)BSA聚集體在堿性條件下的分解過程有4個(gè)動(dòng)力學(xué)階段,包括1個(gè)快速分解階段,2個(gè)相對(duì)較慢的分解階段,和1個(gè)動(dòng)力學(xué)惰性階段.由此推斷BSA無序聚集體中至少包含4種不同的單體結(jié)構(gòu).

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(責(zé)任編輯：梁俊紅)

Structural insights into bovine serum albumin aggregates by a dissociation kinetic investigation

LI Haoyi,LI Dongmin,MA Gang,SHANG Yanli,SUN Ying

(Key Laboratory of Medicinal Chemistry and Molecular Diagnosis of Ministry of Education,College of Chemistry and Environmental Science,Hebei University,Baoding 071002,China)

Abstract:Protein aggregation is not only a common problem in biopharmaceutical industry involving protein drugs,but also a devastating phenomenon closely linked to numerous human diseases.Understanding structural details of protein aggregates is fundamentally important in the prediction and prevention of protein aggregation behavior.In this study,we explore to use a turbidity-based dissociation kinetic assay to tackle the complex nature of protein amorphous aggregates by a model protein,bovine serum albumin(BSA).We observe that the dissociation of BSA aggregates under basic condition consists of four distinct kinetic phases,including a burst phase,two relatively slow phases,and one kinetically inert phase.Such kinetic observation allows us to hypothesize that BSA aggregates consist of at least four different types of BSA monomeric structures at the molecular level.To the best of our knowledge,this is the first turbidity-based investigation with the aim to elucidate the structural heterogeneity of protein amorphous aggregates.

Key words:protein aggregation;bovine serum albumin;turbidity;kinetics

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2016.01.007

收稿日期：2015-09-14

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21075027)；教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(211014)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金聯(lián)合資助課題(20121301110003)；河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(B2011201082)

通信作者：馬剛(1971—),男,北京人,河北大學(xué)教授,主要從事與蛋白質(zhì)和納米材料相關(guān)物理化學(xué)研究.

中圖分類號(hào)：O643

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-1565(2016)01-0035-08

第一作者：李昊一(1991—),女,河北廊坊人,河北大學(xué)在讀碩士研究生.E-mail：haoyi19910324@sina.com.

E-mail：gangma@hbu.edu.cn